關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌；草莓；高通量測序；真菌群落結(jié)構(gòu)；草莓根腐病

中圖分類號：S436.68：S476 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0081-07

作物土傳病害的發(fā)生與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定的相關(guān)性，微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可作為指示土壤健康的重要指標。生物防治、生物有機肥和輪作等措施可有效調(diào)節(jié)土壤微生物群落，提高土壤健康水平，減少病害發(fā)生，對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展、土壤生態(tài)環(huán)境保護具有重要意義。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)沈其榮團隊通過研究根際微生物與病害發(fā)生之間的聯(lián)系，揭示了“土壤微生物群操縱”、“鐵載體靶向療法”、“噬菌體療法”等多種調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的思路和機制，通過優(yōu)化土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，減少土壤中病原菌的數(shù)量，進而抑制作物病害發(fā)生。

草莓根腐病是由多種病原菌和環(huán)境互作引起的一類土傳病害，其致病菌復(fù)雜多樣，已報道的主要有絲核菌屬、鐮刀菌屬、腐霉菌屬、擬盤多毛孢屬、炭疽菌屬、疫霉屬和Dactylonectria等，生產(chǎn)中常用的高溫悶棚、灌施化學(xué)農(nóng)藥等措施易導(dǎo)致土壤板結(jié)和質(zhì)量下降、作物抗藥性等問題?；诖?，本研究以草莓為研究對象，施用枯草芽孢桿菌，利用高通量測序技術(shù)解析根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)變化，分析外源枯草芽孢桿菌對根際土壤真菌群落及作物病害和作物生長的影響，以期為利用微生物群落定向調(diào)控草莓土傳病害探索新思路。

1材料與方法

1.1供試菌株

3×10² CFU/mL枯草芽孢桿菌TB918懸浮劑由天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所贈送，3×10¹⁰ CFU/mL枯草芽孢桿菌NCD-2懸浮劑由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所贈送。

1.2試驗設(shè)計

試驗于2021—2022年在山東省臨沂市沂水縣小匡莊開展。試驗大棚多年種植草莓，草莓根腐病連年發(fā)生嚴重，當年未進行悶棚處理。共設(shè)置4個處理：60L／hm²枯草芽孢桿菌TB918滴灌處理（TB918）、60L／hm²枯草芽孢桿菌NCD-2滴灌處理（NCD-2）、7.5L／hm² 30%精甲霜靈·嗯霉靈滴灌化學(xué)對照（Chem）和清水對照（CK）。每處理重復(fù)4次，共16個小區(qū)，小區(qū)面積20m²（2m×10 m）。

1.3草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

草莓定植3個月后，采集不同處理的草莓根際土壤。每個處理隨機選取3株長勢較為一致的草莓植株，采用抖土法獲取根際土壤，充分混勻后作為1個土樣，重復(fù)3次。分別對各處理進行基因組DNA抽提，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA，使用ITSIF/ITS2R引物對真菌ITS區(qū)進行PCR擴增，切膠回收PCR產(chǎn)物后由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。Miseq測序得到的PE reads首先根據(jù)overlap關(guān)系進行拼接，同時對序列質(zhì)量進行質(zhì)控和過濾，區(qū)分樣本后進行OTU聚類分析和物種分類學(xué)分析。

利用美吉生物云平臺，采用Uparse（version 7.0.1090）軟件進行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行物種分類注釋，基于FUNGuild分析根際土壤真菌的營養(yǎng)型和功能預(yù)測，基于OTU進行Alpha多樣性分析，基于分類學(xué)信息進行門和屬水平群落結(jié)構(gòu)統(tǒng)計分析。

1.4枯草芽孢桿菌對草莓根腐病的防治效果

本研究以草莓發(fā)病率為指標計算防治效果，分別于草莓定植1、2、3個月時調(diào)查各處理草莓根腐病發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病率和防治效果。發(fā)病率（%）=發(fā)病株數(shù)／調(diào)查總株數(shù)×100。防效（%）=（對照發(fā)病率-處理發(fā)病率）／對照發(fā)病率×100。

1.5枯草芽孢桿菌對草莓的促生作用

在不同時間段內(nèi)，分別調(diào)查各處理草莓的冠徑、葉面積和葉片葉綠素含量（SPAD值）。冠徑使用直尺測量，葉面積使用直尺測量每株草莓最大葉片的長和寬后計算，SPAD值使用手持式葉綠素快速檢測儀（金科利達TYS-4N）測定，每重復(fù)測量10個植株或葉片。

1.6數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2017進行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，Duncan法進行顯著性檢驗（Plt;0.05），采用OriginPro 8.6軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2.1草莓根際土壤真菌多樣性分析

多樣性分析結(jié)果（表1）顯示，與CK相比，經(jīng)枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理的Shannon指數(shù)顯著上升22.88%和13.86%，Simpson指數(shù)顯著下降55.91%和36.56%，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)分別顯著上升19.06%、39.08%和16.57%、34.89%。表明施用枯草芽孢桿菌后，草莓根際土壤真菌的多樣性發(fā)生了較大變化，物種的豐富度和多樣性明顯增加。

2.2草莓根際土壤真菌營養(yǎng)型分析

利用FUNGuild對真菌功能進行預(yù)測分類，由圖1可知，樣本主要有3類基本營養(yǎng)型、5類交叉營養(yǎng)型及未知營養(yǎng)型。其中在3類基本營養(yǎng)型中，CK、Chem、NCD-2、TB918處理的病理營養(yǎng)型相對豐度分別是17.69%、10.81%、8.23%、9.46%，腐生營養(yǎng)型相對豐度分別為12.14%、10.79%、32.53%、26.94%，共生營養(yǎng)型相對豐度分別為0.23%、0.14%、0.75%、0.78%；兩種枯草芽孢桿菌處理的病理營養(yǎng)型均低于對照，腐生營養(yǎng)型和共生營養(yǎng)型均高于對照。

如表2所示，1073個OTU中共有23個OTU經(jīng)FUNGuild鑒定為植物病原菌，其在CK、Chem、NCD-2、TB918處理的相對豐度分別為15.44%、5.99%、7.73%和2.39%。其中，織球殼菌屬（Plectosphaerella）占主要地位，其序列數(shù)在4個處理中分別占病原菌序列總數(shù)的89.99%，90.38%、85.96%、80.21%，占全部真菌系列總數(shù)的13.9%、5.4%、6.65%、1.92%。

2.3草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)分析

草莓根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)如圖2所示，在門水平上（圖2A），優(yōu)勢菌門主要是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢菌門（Mortierellomycota），各處里中這3個門的總豐度均達80%以上。與CK相比，NCD-2和TB918處理的子囊菌門相對豐度明顯提高，擔子菌門和被孢菌門相對豐度明顯降低。

在屬水平上（圖2B），豐度在前15的優(yōu)勢菌屬是：被孢霉屬Mortierella、Tausonia、毛殼菌屬Chaetomium、籃狀菌屬Talaromyces、織球殼菌屬Plectosphaerella、油壺菌屬Olpidium、錐蓋傘屬Conocybe、假裸囊菌屬Pseudogymnoascus、小囊菌屬Microascus、腐質(zhì)霉屬Humicola、Oliveonia、Solic-occozyma、鐮刀菌屬Fusanum、Kernia、Aspergillus。其中，前5個優(yōu)勢菌屬在CK、Chem、NCD-2、TB918處理中的總相對豐度分別達到64.97%、63.88%、44.78%、40.21%，說明它們可能在土壤真菌群落結(jié)構(gòu)中起重要作用：NCD-2和TB918處理與CK差異均較明顯的主要菌屬有被孢霉屬、Tausonia、毛殼菌屬、織球殼菌屬，均表現(xiàn)為被孢霉屬、Tausonia和織球殼菌屬相對豐度降低，毛殼菌屬相對豐度增加；其中毛殼菌屬的相對豐度分別是CK的8倍和28倍，織球殼菌屬相對豐度則由CK的13.9%分別下降到6.65%和1.90%。各處理Fusarium的相對豐度均較低，分別為0.81%、0、0.79%和1.16%。

2.4枯草芽孢桿菌對草莓根腐病的防治效果

分別于草莓定植1個月、2個月和3個月調(diào)查（表3），TB918在3個調(diào)查時間對草莓根腐病的防效分別為79.73%、73.91%和58.44%，NCD-2對草莓根腐病的防效分別為76.78%、76.02%和61.24%，Chem對草莓根腐病的防效分別為27.86%、35.21%和27.94%。同一調(diào)查時間段內(nèi)，TB918和NCD-2處理的草莓根腐病發(fā)病率差異不顯著，但均顯著低于Chem和CK，表明施用枯草芽孢桿菌能有效防治草莓根腐病。

2.5枯草芽孢桿菌對草莓的促生長作用

由圖3可知，同一時間段內(nèi)枯草芽孢桿菌TB918和NCD-2處理對草莓各項生長指標的影響差異均不顯著，但相較Chem和CK均顯著增加；Chem處理中只在定植1個月時的冠徑比CK顯著增加，其他指標差異不顯著。結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌TB918和NCD-2可增加草莓冠徑、葉面積和葉片葉綠素含量，有效促進植株生長。

3討論

3.1真菌多樣性指數(shù)與病害發(fā)生之間的關(guān)系

真菌作為根際微生物的重要組成部分，其群落多樣性與作物健康和土壤生態(tài)有很大的相關(guān)性，可利用Alpha多樣性來衡量一個特定區(qū)域內(nèi)的微生物多樣性。目前國內(nèi)外針對施用外源微生物對土壤真菌多樣性影響的研究存在不同的結(jié)論，謝爾瓦尼木·阿不都艾尼等認為枯草芽孢桿菌可以導(dǎo)致土壤真菌的Chao和Ace指數(shù)上升，Simpson指數(shù)下降，提高真菌的多樣性指數(shù)；熊冰杰等認為施用適量生物菌有機肥可以提高土壤微生物多樣性，緩解三七連作障礙；Zhao等認為枯草芽孢桿菌能有效防治馬鈴薯黃萎病，但降低了根際土壤真菌多樣性。為了明確施用枯草芽孢桿菌對草莓根際真菌多樣性的影響，本研究設(shè)置了兩種枯草芽孢桿菌處理，結(jié)果顯示，施人枯草芽孢桿菌能提高草莓根際真菌的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon指數(shù)，降低Simpson指數(shù)，有效提升草莓根際土壤真菌群落的豐富度和多樣性。試驗中使用的枯草芽孢桿菌NCD-2與Zhao等使用的是同一株生防菌，但與其在馬鈴薯上的試驗呈現(xiàn)出相反的多樣性結(jié)果，綜合分析認為，作物病害發(fā)生與土壤真菌多樣性關(guān)系較為復(fù)雜，不同外源微生物以及同一種外源微生物在不同作物上均可能對土壤真菌多樣性產(chǎn)生不同的影響。

3.2真菌群落結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生之間的關(guān)系

雖然根際土壤微生物多樣性與病害發(fā)生之間的關(guān)系存在不同的研究結(jié)論，但是合理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在植物健康中發(fā)揮著重要作用。施人外源有益微生物能夠減少土壤病原菌的數(shù)量，重塑根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，對土傳病害有明顯的抑制作用。田春麗等研究發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，鐮刀菌屬等病原菌的豐度顯著增加，斗管囊霉屬等有益菌的豐度顯著下降。本研究通過高通量測序，利用FUNGuild分析預(yù)測了土壤真菌群落的營養(yǎng)型和功能，從生態(tài)功能視角探索真菌群落結(jié)構(gòu)與病害發(fā)生之間的聯(lián)系。結(jié)果表明，經(jīng)枯草芽孢桿菌處理后，對作物有害的植物病原菌相對豐度大幅下降，對作物有益的腐生菌和共生菌相對豐度大幅提高；而化學(xué)對照中的植物病原菌、腐生菌和內(nèi)生菌的相對豐度均低于清水對照，說明化學(xué)藥劑處理在殺滅病原菌的同時也削弱了有益菌。綜合分析認為，施用枯草芽孢桿菌能夠減少病原菌數(shù)量，增加有益菌數(shù)量，優(yōu)化根際土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)，達到防病和促生的作用。

3.3真菌種類與病害發(fā)生之間的關(guān)系

根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的改變降低了草莓根腐病的發(fā)生程度，為進一步明確在此過程中起關(guān)鍵作用的真菌類群，本研究分析了各處理在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)，重點分析了Chaetomium和Plectosphaerella兩個相對豐度較大的屬。其中，Chaetomium是一類具有生物防治效果的有益真菌，能夠產(chǎn)生具球毛殼菌素等代謝產(chǎn)物，對大麗輪枝菌、灰霉菌和鐮刀菌等多種病原菌具有抑制作用，同時對植物還有促生長作用。本研究中，枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理草莓根際土壤中Chaetomium，的相對豐度分別達到清水對照的8倍和28倍，說明Chaetomium，在草莓根腐病的防治中發(fā)揮了重要作用，這為下一步嘗試使用Chaetomium類生防菌防治草莓根腐病提供了新思路。

Plectosphaerella是近年來在全世界各地被發(fā)現(xiàn)的能夠引起多種作物病害的一類新型致病菌。2014年國內(nèi)首次報道了由黃瓜織球殼菌P.cu-cumerina引起的番茄萎蔫病，2020年美國馬薩諸塞州發(fā)現(xiàn)了由P.cucumerina引起的礬根草根腐病，2020年鄭州市發(fā)現(xiàn)了由P.cucumerina導(dǎo)致的草莓萎蔫病。本研究利用高通量測序分析也發(fā)現(xiàn)在山東地區(qū)的草莓土壤中存在Plecto-sphaerella，且其在清水對照中的相對豐度達到13.9%，經(jīng)枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918處理后分別下降為6.65%和1.92%。而草莓根腐病常見病原菌Fusarium在CK、Chem、NCD-2和TB918中的相對豐度均較低，由此推測Fusarium不是本試驗中草莓根腐病的主要致病菌，而相對豐度較大的Plectosphaerella可能起了更主要的作用。這也表明山東地區(qū)可能存在由Plectosphaerella引起的草莓萎蔫病，下一步將結(jié)合高通量測序結(jié)果，平板定向分離鑒定Plectosphaerella，明確其在山東地區(qū)草莓上的致病性。

4結(jié)論

綜上，施用枯草芽孢桿菌NCD-2和TB918可提高草莓根際土壤真菌群落多樣性，增加有益菌相對豐度，降低病原菌相對豐度，優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)；能有效防治草莓根腐病，增加冠徑、葉面積、葉片葉綠素含量等生長指標值，對作物有顯著的防病促生作用。結(jié)合高通量測序和真菌群落結(jié)構(gòu)分析，可以快速發(fā)現(xiàn)草莓根腐病發(fā)生過程中的關(guān)鍵致病菌Plectosphaerella和潛在生防菌Chaetomi-um，為植物病害防治提供一種新策略。