【關(guān)鍵詞】腺苷脫氨酶1；肝癌；增殖；遷移侵襲；Wnt/β-catenin信號通路

【中圖分類號】R735.7 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【收稿日期】2024-01-25

肝癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，死亡率接近發(fā)病率[1]。肝細(xì)胞癌（liver hepatocellular carci?noma，LIHC）是最常見的肝癌形式，占90% 以上的病例[2]。LIHC的危險因素多種多樣，包括肝炎病毒感染、酒精、非酒精性脂肪肝炎、年齡、性別等因素[3-5]。目前肝癌治療靶向藥物主要有索拉菲尼、侖伐替尼和瑞戈非尼等[6]，盡管取得了一些進(jìn)展，但肝癌細(xì)胞具有高度遷移性和侵襲性[7]，導(dǎo)致肝癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，治療效果不理想，其機(jī)制也尚未明了。因此，深入探討肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制對指導(dǎo)LIHC診斷預(yù)后具有重要意義。

腺苷脫氨酶1（adenosine deaminases acting onRNA 1，ADAR1）是一種雙鏈RNA編輯酶[8-9]，催化腺苷（A）的水解脫氨反應(yīng)，產(chǎn)生肌苷（I）。先前的研究表明，ADAR1 的異常表達(dá)與LIHC 的進(jìn)展密切相關(guān)[10-12]，ADAR1通過編輯細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶13（cyclin-dependent kinases 13，CDK13）、膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1（gliomaassociated oncogene 1，GLI1）和抗酶抑制因子（antizyme inhibitor 1，AZIN1）[13-15]進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和肝癌的發(fā)生發(fā)展。ADAR1具有2種亞型：組成性表達(dá)的p110（110 kD）和干擾素誘導(dǎo)表達(dá)的p150（150 kD）[16]。在LIHC 臨床樣本中，ADAR1 p110和p150處于高表達(dá)狀態(tài)，且與患者不良預(yù)后相關(guān)[17]。有研究表明，ADAR1 p110 通過上調(diào)整合素α2（integrinα 2，ITGA2）表達(dá)增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的增殖和侵襲能力[18]，但ADAR1 p150和ADAR1p110的作用是否相同，在肝癌研究中鮮有報道。本研究基于ADAR1 的2 個亞型p150 和p110 展開研究，探究其對肝癌增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞系及主要試劑

組織標(biāo)本：人肝癌組織和癌旁組織來源于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，本研究方案通過重慶醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究倫理委員會審批同意。

細(xì)胞系：人肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2均由重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室提供。

主要試劑：DMEM和Opti-EME培養(yǎng)基（Gibco）；胰酶（多沃生物）；胎牛血清（ExCell）；鼠尾Ⅰ型膠原（索萊寶）；Trizol和LipofectamineTM3000（Invitrogen）；DMSO（Sigma）；CCK-8（APE×Bio）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；2×通用SYBR GreenFast qPCR Mix（Abcolnal）；無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒Endo?Free Plasmid Midi Kit（康為生物）；Transwell 細(xì)胞小室和Matrigel 基質(zhì)膠（Coring）；ADAR1 抗體（正能生物）；GSK3β（proteintech）；β-catenin（proteintech）；p-β-catenin（protein?tech）；GAPDH和兔二抗（proteintech）。

質(zhì)粒：ADAR1-p110 表達(dá)質(zhì)粒由廣州復(fù)能基因公司將ADAR1-p110 的cDNA 序列（NM001025107.2）構(gòu)建到EXZ3143-M07載體中；ADAR1-p150表達(dá)質(zhì)粒由OriGene公司將ADAR1-p150 的cDNA 序列（NM 001111.4）構(gòu)建到pCMV6-Entry 載體中。靶向ADAR1 的小干擾RNA（siA?DAR-1、siADAR-2和siADAR-3）購自湖州河馬生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌細(xì)胞株（HepG2和Huh7）復(fù)蘇后，置于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基于5%二氧化碳，37 ℃的條件下培養(yǎng)，待愈合度達(dá)90%后用胰酶消化傳代。其中，對HepG2開展實(shí)驗(yàn)時，其細(xì)胞培養(yǎng)皿的表面需使用鼠尾Ⅰ型膠原提前處理促進(jìn)細(xì)胞伸展。

1.2.2 基因表達(dá)譜互動分析（GEPIA） 基因表達(dá)譜互動分析（http：//gepia.cancer-pku.cn）選取來源于TCGA 和GTEx數(shù)據(jù)庫369例肝癌腫瘤樣本和160例正常肝臟組織樣本，使用RNA 測序處理后輸出可視化結(jié)果。最終得到ADAR1 和GSK3β在肝癌與正常肝臟組織中的表達(dá)，并分析ADAR1基因在肝癌不同疾病分期中的表達(dá)水平及其對肝癌患者預(yù)后的影響。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到60% 左右時，按照LipofectamineTM3000 說明書，將ADAR 過表達(dá)質(zhì)?；騭iRNA（表1）分別配制成雞尾酒混合物轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后4～6 h，更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h 收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.4 細(xì)胞活力測定 將處理好的HepG2和Huh7細(xì)胞分別以每孔2×103個細(xì)胞的密度接種在96孔板中，每組3個孔。培養(yǎng)至相應(yīng)時間后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，孵育1 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測定吸光度（absorbance，A）值。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞被接種在6孔板中，培養(yǎng)到90%的融合度，利用槍頭進(jìn)行劃痕，然后用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后，加入無血清的DMEM 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，使用顯微鏡分別在0 h和48 h定點(diǎn)拍照記錄，觀察細(xì)胞的邊緣運(yùn)動。使用Image J軟件計算分析傷口相對遷移速度。

1.2.6 Transwell 實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞遷移和侵襲試驗(yàn)使用24孔Tran?swell 室和8 μm 聚碳酸酯膜（Coring，美國）進(jìn)行。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)是細(xì)胞在無血清饑餓2 h后，將細(xì)胞消化離心，用無血清培養(yǎng)基重懸，計數(shù)，稀釋至所需濃度，小室上層每孔接種2×104個細(xì)胞的懸液，下層加入完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中孵育48 h。拿出小室用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色。最后，用顯微鏡拍照觀察，計數(shù)穿膜細(xì)胞。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)需提前將基質(zhì)膠鋪被于小室中，其余步驟與Transwell遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR（qPCR） 采用TRizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取1 μg RNA按照PrimeScript RT Reagent Kit withgDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作手冊合成cDNA，使用2×通用SYBR Green Fast qPCR Mix 進(jìn)行qPCR。反應(yīng)條件如下：95 ℃循環(huán)3 min，95 ℃循環(huán)5 s，60 ℃循環(huán)30 s。所有qPCR引物均使用NCBI網(wǎng)站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在線設(shè)計（表2），由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。GAPDH基因作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blot檢測 使用RIPA 裂解液提取組織和細(xì)胞中的總蛋白并用BCA法定量。每個蛋白樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（0.45 μm）上。隨后用5%脫脂奶粉封閉膜后，與一抗（ADAR1，1∶2 000；GAPDH，1∶5000，GSK3β，1∶2000；β-catenin，1∶5000；p-β-catenin，1∶5 000）4 ℃孵育過夜，經(jīng)TBST緩沖液洗滌3次，與二抗在室溫下孵育1 h。TBST洗滌3次后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒（Beyotime Biotechnology）進(jìn)行顯色檢測。

1.2.9 蛋白-蛋白互作和富集分析 通過STRING在線網(wǎng)站（https：//cn.string-db.org/）進(jìn)行蛋白-蛋白互作（protein-proteininteraction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析，所得結(jié)果進(jìn)行可視化分析；篩選與ADAR1直接作用的Hub gene，再通過生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫DAVID（http：//david.ncifcrf.gov）對基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用Graph Pad Prism（9.5.1）對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和繪圖，2組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ADAR1在肝癌組織中高表達(dá)，并與預(yù)后不良有關(guān)

首先，本研究組通過生物信息學(xué)在線分析工具GEPIA對肝癌組織與癌旁組織中ADAR1的表達(dá)水平進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，肝癌組織中ADAR1表達(dá)顯著上調(diào)（圖1A），這提示ADAR1在肝癌的進(jìn)展中可能發(fā)揮促進(jìn)作用。此外，ADAR1在肝癌不同分期中，ADAR1表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.508，圖1B），但高表達(dá)患者相較于低表達(dá)患者的預(yù)后較差（圖1C）。最后，本研究組采用Western blot對8例臨床肝癌組織和癌旁組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肝癌組織相較于癌旁組織，ADAR1 p150和p110兩個亞型的蛋白質(zhì)表達(dá)水平均更高（圖1D）。這些結(jié)果表明，ADAR1 在肝癌中表達(dá)上調(diào)，且與預(yù)后不良密切相關(guān)。

2.2 過表達(dá)ADAR1 p150和p110均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

為驗(yàn)證肝癌組織中得到的結(jié)果，本研究組在Huh7 和HepG2 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ADAR1 過表達(dá)質(zhì)粒p150 和p110，通過Western blot和qPCR檢測細(xì)胞中ADAR1表達(dá)水平。結(jié)果表明，過表達(dá)組的ADAR1蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平均明顯升高（圖2A、B）。通過CCK-8檢測過表達(dá)ADAR1對細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，過表達(dá)ADAR1 p150和p110后細(xì)胞增殖能力明顯高于對照組（Plt;0.01，圖2C）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，劃痕后48 h，過表達(dá)ADAR1 p150和p110組傷口愈合能力顯著強(qiáng)于對照組（Plt;0.001、Plt;0.01，圖3A、B）。此外，Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)ADAR1 p150和p110組細(xì)胞穿孔數(shù)明顯多于對照組（Plt;0.05，圖3C、D）。以上結(jié)果表明過表達(dá)ADAR1 p150和p110均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

2.3 敲低ADAR1抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力

為進(jìn)一步分析ADAR1兩個亞型表達(dá)水平對肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，本研究設(shè)計了同時靶向2個亞型的siRNA序列，通過對肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA干擾ADAR1兩個亞型的表達(dá)。采用Western blot和qPCR檢測ADAR1的干擾效率。結(jié)果顯示，與對照siNC相比，siADAR組ADAR1兩個亞型的蛋白質(zhì)和RNA表達(dá)水平均明顯降低（Plt;0.001，圖4A、B）。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與對照組siNC相比，siADAR1組的Huh7和HepG2細(xì)胞活力顯著降低，尤其是在96 h 時最為明顯（Plt;0.001，圖4C）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siADAR1組細(xì)胞傷口愈合能力受到抑制（Plt;0.05，圖5A、B）。同時，Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)表明，siADAR1 組細(xì)胞遷移和侵襲能力受到抑制（Plt;0.05，圖5C、D）。以上結(jié)果表明，敲低ADAR1可以抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

2.4 ADAR1調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路

利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建ADAR1蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)蛋白關(guān)聯(lián)性獲取了前10的相關(guān)蛋白，其中包括糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）（圖6A）。通過DAVID數(shù)據(jù)庫對這些互作蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果顯示主要參與的生物過程包括：細(xì)胞增殖、間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化、干擾素刺激基因（interferon stimulated gene factor 3，ISGF3）表達(dá)調(diào)控、核糖核酸酶Ⅲ活性調(diào)控、RNA 結(jié)合域調(diào)控、Wnt信號通路等（圖6B、C）。Wnt信號通路是經(jīng)典的腫瘤調(diào)控通路，在支架蛋白的輔助下，β-連環(huán)蛋白（β-catenin）與GSK3β、APC基因產(chǎn)物形成復(fù)合體。當(dāng)激活Wnt信號之后，Wnt分子與跨膜受體Fzd結(jié)合，抑制GSK3β，使得β-catenin磷酸化程度降低，并抑制β-catenin降解，使其穩(wěn)定并聚集于細(xì)胞核內(nèi)，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄調(diào)控，參與腫瘤的調(diào)控。因此，本研究通過在肝癌細(xì)胞Huh7和HepG2里面過表達(dá)和敲低ADAR1 p150和p110，進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)分析Wnt信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)ADAR1 p150和p110后減少了GSK3β 含量，降低了β-catenin 的磷酸化水平，而對β-catenin 水平無明顯影響（圖6D）；相反，敲低ADAR1 p150和p110后GSK3β的含量升高，磷酸化β-catenin水平升高，同樣對β-catenin無明顯影響（圖6E）。綜上，這些數(shù)據(jù)表明ADAR1對肝癌細(xì)胞的影響可能是通過Wnt/β-catenin 信號通路發(fā)揮作用的。

3 討論

肝細(xì)胞癌嚴(yán)重威脅人類健康，是世界范圍內(nèi)的重要公共衛(wèi)生問題。近年來，肝細(xì)胞癌的研究持續(xù)受到關(guān)注[19]。因高度復(fù)制性和異質(zhì)性，其致病分子機(jī)制未完全解析[20]。因此，肝細(xì)胞癌的有效預(yù)防和治療面臨巨大挑戰(zhàn)。

ADAR1是一種多功能蛋白，在炎癥損傷[21]、細(xì)胞應(yīng)激[22]和免疫調(diào)控[23]等方面發(fā)揮重要作用。研究表明，ADAR1異常表達(dá)與卵巢癌[24]、乳腺癌[16]等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ADAR1有2種亞型：p150 和p110。p150 由干擾素誘導(dǎo)表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)；p110因缺乏核輸出信號（nuclearexport signal，NES）而定位于細(xì)胞核。在肝癌中，ADAR1 p110通過編輯一種RNA結(jié)合蛋白DDX1促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[25]，此外，ADAR1 p110還可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲[18]。目前尚未有研究報道p150對肝癌細(xì)胞惡性增殖的影響?；诖?，本研究同時探討了ADAR1兩種亞型對肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響，并對機(jī)制進(jìn)行初步研究。GEPIA在線網(wǎng)站分析結(jié)果顯示，與正常肝臟組織相比，ADAR1在肝癌組織中高表達(dá)，盡管在肝癌的不同分期中其表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但高表達(dá)ADAR1 的患者預(yù)后不良。此外，Western blot檢測臨床肝癌和癌旁組織表達(dá)，結(jié)果顯示，ADAR1p150和ADAR1 p110在肝癌組織中表達(dá)量均異常增高，這與在線分析數(shù)據(jù)是一致的。在肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ADAR1過表達(dá)質(zhì)粒，CCK-8、劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)證明ADAR1兩個亞型均能促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然后，通過轉(zhuǎn)染ADAR1小干擾質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)在ADAR1兩個亞型的表達(dá)量降低后，肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均受到明顯抑制。這些結(jié)果說明ADAR1與肝癌細(xì)胞的增殖和存活密切相關(guān)。

Wnt/β-catenin信號通路是一種復(fù)雜的蛋白網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，參與炎癥[26]、腫瘤[27]等多種疾病過程。GSK3β是Wnt/β-catenin信號通路中的負(fù)調(diào)控因子，β-catenin 是GSK3β 的下游底物。激活狀態(tài)下的GSK3β能夠磷酸化β-catenin并誘導(dǎo)其在蛋白酶體中的降解。既往研究表明，Wnt/β-catenin通路抑制劑可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，沉默ADAR1后β-catenin表達(dá)水平受到抑制，并逆轉(zhuǎn)由Wnt/β-catenin通路抑制劑導(dǎo)致的胃癌發(fā)生發(fā)展。此外，在乳腺癌細(xì)胞系中，ADAR1 p110過表達(dá)降低了GSK3β的表達(dá)，同時增加了β-catenin的活性，ADAR1敲除具有相反的效果。ADAR1 通過抑制GSK3β 活性，使β-catenin積累和核易位減少，從而介導(dǎo)ADAR1誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲和新生血管形成。目前尚未有ADAR1靶向Wnt/β-catenin信號通路在肝癌中的研究。本研究通過生物信息學(xué)和Western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在肝癌中，ADAR1 和Wnt/β-catenin 信號通路存在相關(guān)性。結(jié)果顯示，過表達(dá)ADAR1 p150和p110均能抑制GSK3β 表達(dá)，降低β-catenin 磷酸化水平，而對β-catenin無明顯影響；敲低ADAR1后GSK3β含量增加，并激活磷酸化β-catenin水平，β-catenin表達(dá)無顯著差異。這些數(shù)據(jù)提示，肝癌細(xì)胞中異常升高的ADAR1可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)肝癌的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，ADAR1在LIHC中高表達(dá)，并與不良預(yù)后相關(guān)。ADAR1 p150 和p110 均能促進(jìn)肝癌Huh7和HepG2細(xì)胞的增殖、遷移以及侵襲能力，其作用機(jī)制與Wnt/β-catenin信號通路存在一定相關(guān)性。但仍需更多的實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步探索ADAR1 與Wnt/β-catenin在LIHC發(fā)生發(fā)展過程中的作用和機(jī)制，為LIHC診斷和預(yù)后提供新的方向和途徑。

（責(zé)任編輯：李青穎）