【關鍵詞】淋巴結濾泡輔助T細胞淋巴瘤-血管免疫母細胞型；濾泡輔助T細胞表型；Epstein-Barr病毒編碼的小RNA；預后

【中圖分類號】R363 【文獻標志碼】A 【收稿日期】2024-04-23

血管免疫母細胞性T 細胞淋巴瘤（angioimmu?noblastic T-cell lymphoma，AITL）是外周T細胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）的常見類型之一，歐美約占PTCL病例的15%～20%[1-2]，我國占比更高。2022年第5版WHO血液淋巴系統(tǒng)腫瘤分類（5th edition of the WHO Classification of Haemato?lymphoid Tumours，WHO-HAEM5）將AITL重新命名為淋巴結濾泡輔助T細胞淋巴瘤-血管免疫母細胞型（nodal T-follicular helper cell lymphoma，angioimmunoblastic-type，nTFHL-AI）[3]。

nTFHL-AI主要影響疾病晚期的老年人，以全身性淋巴結腫大、肝脾腫大以及系統(tǒng)性癥狀為主要特征[4-6]。大多數病例包含Epstein-Barr 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）陽性B細胞顯著擴增，提示該病可能與免疫功能失調有關[7-8]。nTFHL-AI組織病理學特點主要是淋巴結結構部分或完全消失，腫瘤性T 細胞浸潤，高內皮靜脈（high endothelialveins，HEVs）和濾泡樹突細胞（follicular dendriticcells，FDCs）增生，以及EBV陽性B細胞增生。鑒于nTFHL-AI臨床病理特征復雜，致使準確診斷具有挑戰(zhàn)性。目前仍以傳統(tǒng)病理學診斷為主，必要時配合分子或遺傳學檢測。此外，nTFHL-AI預后較差，患者生存時間短?，F有治療方案如蒽環(huán)類藥物治療和造血干細胞移植療效有限。盡管單藥治療如苯達莫司汀、來那度胺、維布妥昔單抗和組蛋白去乙?；瘎┰谘泳徤踔林斡膊》矫嬲宫F出前景，但是復發(fā)或難治性nTFHL-AI患者的預后仍未明顯改善，亟需開發(fā)新的治療策略來改善患者生存結局。在這項回顧性研究中，本研究闡明了nTFHL-AI的臨床和病理特征，并揭示了潛在的預后因素，旨在為nTFHL-AI的臨床管理提供一些參考。

1 資料與方法

1.1 患者信息

本研究收集了2012年12月至2022年1月重慶醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理科（即重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科）63例nTFHL-AI病例信息和對應的福爾馬林固定石蠟包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）組織。根據最新WHO分類標準[3]，所有nTFHL-AI病例由2位及以上經驗豐富的病理專家閱片。所有實驗過程均經過重慶醫(yī)科大學倫理委員會批準（審批編號：2023071）。

1.2 組織形態(tài)學觀察及免疫組織化學檢測

在FFPE組織切片HE染色后顯微鏡下觀察組織形態(tài)學特點，并行免疫組織化學（immunohistochemistry，IHC）染色檢測，一抗包括CD2、CD3、CD5、CD7、CD4、CD8、CXCL13、BCL6、CD10、PD1、CD30、CD21、CD23、Ki67（福州邁新生物科技有限公司）。泛T抗原陽性定義為超過50%腫瘤細胞至少1個標記物（CD2、CD3、CD5或CD7）陽性，并伴有不同程度丟失。TFH標記物陽性定義為至少有兩種標記物（PD-1、BCL6、CD10和CXCL13）染色，且陽性細胞比例≥25%。CD30陽性細胞比例≥10%判定為陽性。

1.3 原位雜交檢測EBV編碼的小RNA

采用原位雜交（in situ hybridization，ISH）技術檢測EBV編碼的小RNA（EBV-encoded small RNA，EBER）1/2。顯微鏡下觀察EBV感染的淋巴細胞（主要觀察B細胞）陽性定義為EBER陽性并計數。

1.4 克隆性研究

為研究克隆性，本研究參照文獻方法檢測T細胞受體γ（T-cell receptor γ，TCRγ）、免疫球蛋白重鏈（immunoglobulinheavy chain，IgH）和免疫球蛋白κ 輕鏈（immunoglobulin κlight chain，Igκ）基因重排[9]。從FFPE 組織提取DNA，利用BioMed-2引物進行PCR擴增，擴增后的產物經處理后形成異源雙鏈核酸分子，并用聚丙烯酰胺電泳檢測。若電泳條帶清晰，片段大小與BIOMED-2引物系統(tǒng)中陽性對照片段相符，則判定為單克隆重排陽性，反之重排陰性。

1.5 反應評估

根據2014年Lugano反應評估標準，nTFHL-AI患者治療反應分為：完全緩解（complete remission，CR）、部分緩解（par?tial remission，PR）、疾病穩(wěn)定（stable disease，SD）和疾病進展（progressive disease，PD）[10]?？偡磻剩╫verall response rate，ORR）定義為達到CR或PR的百分比。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數據使用SPSS軟件（版本27.0）分析。2組之間臨床病理特征差異使用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。總體生存期（overall survival，OS）定義為從診斷之日起到死亡或最近1 次的隨訪日期。無進展生存期（progression-free sur?vival，PFS）定義為從初次診斷之日起到疾病進展、復發(fā)、任何原因死亡或最近1次隨訪的最早日期?？傮w生存期和無進展生存期用Kaplan-Meier法評估，并用log-rank檢驗比較。預后因素采用Cox比例風險回歸模型評估。檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 臨床特征

表1總結了患者臨床特征。本研究納入30名男性和33名女性，中位年齡67歲（范圍33～87歲）。在63名患者中，42名患者臨床信息可從重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院數據庫檢索獲取，21例患者僅于門診會診而未進一步檢查或者直接轉院，致使數據庫無法檢索其臨床檢驗及部分病理檢查結果。63名患者治療信息完整，數據庫查詢獲取42例患者治療方案，先前缺失的21例患者電話隨訪獲取了治療信息。其中6名（10%）拒絕任何形式的治療，57名（90%）接受化療。在接受化療的57名患者中，39名（68%）接受CHOP（環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松）或CHOP樣方案治療，16 名（28%）接受CHOEP（CHOP 聯(lián)合依托泊苷）或CHOEP樣化療，2名（4%）使用非蒽環(huán)類藥物治療。在接受化療的57名患者中，5名（9%）還同時接受西達本胺治療，1名（2%）同時采用來那度胺治療。此外，6名（11%）患者化療同時進行自體干細胞移植（autologous stem cell transplanta?tion，ASCT）。

2.2 組織病理學結果

大多數nTFHL-AI病例顯示淋巴結結構消失，伴分支狀HEVs和FDCs增生。部分病例可見胞漿透亮的腫瘤T細胞簇擁于血管周圍，增生的B 細胞散在分布于腫瘤T細胞間（圖1）。免疫組化檢測結果見表2。在56例中，38例（68%）CD4和CD8共表達。16例（29%）僅CD4陽性，2例僅CD8陽性（3%）。有37例（66%）CD4陽性腫瘤細胞占明顯優(yōu)勢，而僅3例（5%）CD8陽性腫瘤細胞占優(yōu)勢（圖2）。此外，16 例（29%）中CD4和CD8陽性腫瘤細胞無任何優(yōu)勢。在63位患者中，TFH 相關抗原的陽性率依次為PD1（86%）=BCL6（86%）gt;CD10（73%）gt;CXCL13（49%）。泛T抗原的陽性率依次為CD5（92%）、CD3（89%）、CD7（84%）、CD2（80%）；丟失比率依次為CD7（14%）gt;CD2（12%）gt;CD3（6%）=CD5（6%）（表3）。

2.3 克隆性結果

TCRγ、IgH和Igκ基因重排分別為37例（37/42，88%）、3例（3/42，7%）和3例（3/28，11%）（表2）。此外，TCRγ和Ig基因重排同時發(fā)生有4例。僅Ig基因重排而無TCRγ重排僅1例。

2.4 EBER狀態(tài)及其對nTFHL-AI影響

63 例nTFHL-AI 患者EBV 陽性有38 例（60%）?；贓BER陽性細胞占總組織細胞百分比將nTFHL-AI患者分成4組[11]：0%、≤1%、1%～lt;5%、≥5%，各組分別占比為40%（25/63）、14%（9/63）、29%（18/63）和17%（11/63）（表2）。有趣的是，本研究發(fā)現3例T細胞EBER陽性病例（圖3A、B）。另外，有1例EBER假陽性，是因為將嗜酸細胞誤認為EBER陽性所致（圖3C、D）。根據EBER狀態(tài)將nTFHL-AI患者分為EBER陽性和陰性組，利用卡方檢驗或Fisher精確檢驗比較2組與臨床病理特征關系（表4）。與EBER陰性組相比，EBER陽性組女性比例增高（P=0.035）。EBER 陽性組更傾向于表達CXCL13，表明兩者之間存在相關性（P=0.006）。

2.5 nTFHL-AI患者預后分析

本研究評估63例nTFHL-AI患者預后，中位OS為20個月，1 年、3 年和5 年的OS 率分別是59%、37% 和31%（圖4A）。中位PFS為15個月，1年、3年和5年的PFS率分別是51%、24%和16%（圖4B）。接受蒽環(huán)類藥物聯(lián)合化療患者的CR率約39%（表1）。

與CXCL13陽性組相比，CXCL13陰性組nTFHL-AI患者有更差的OS和PFS（P=0.003、P=0.040；圖5A）。CXCL13陽性組1年、2年和3年OS率分別為74%、63%和51%，陰性組對應的OS率分別為43%、28%和11%。同樣地，CXCL13陽性組1年、2年和3年PFS率分別為64%、49%和28%，陰性組對應的PFS率分別37%、23%和23%。BCL6陰性組1年、3年和5年OS率分別89%、78%和78%，陽性組對應的OS率分別55%、25%和21%。BCL6陰性組1年、3年和5年PFS率分別77%、62% 和41%，而陽性組為46%、16% 和11%。BCL6 陽性組比陰性組的OS和PFS明顯縮短（P=0.026、P=0.044；圖5B）。而CD10表達與否對患者1年、3年和5年OS率和PFS率影響不顯著（P=0.277、P=0.116；圖5C）。PD1陽性組1年、2年OS率分別61% 和46%，而陰性組對應OS率均為42%。PD1陽性組1年、2年PFS率分別52%和36%，陰性組則均為44%。PD1 表達對患者OS 和PFS 影響不明顯（P=0.842、P=0.912；圖5D）。

EBER陽性組1年、2年和3年OS率分別為71%、56%和44%，而陰性組對應OS率分別為40%、31% 和21%。EBER陽性組1年、2年和3年PFS率分別為55%、44%和28%，陰性組則為41%、23%和14%。與EBER陽性組相比，EBER陰性組OS 和PFS 更差（P=0.013，P=0.047；圖6A）。依據EBER陽性細胞占總組織細胞百分比將nTFHL-AI患者分為0%、≤1%、1%～lt;5%、≥5%四組，比較各組的1年、2年和3年生存率，提示EBER陽性細胞比例越低，患者OS越差（P=0.013，圖6B），但PFS無明顯差異（P=0.056，圖6B）。

2.6 危險因素分析

單因素分析提示包括年齡≥60歲（P=0.013）、晚期（Ⅲ/Ⅳ期）疾?。≒=0.046）、東部腫瘤協(xié)作組（eastern cooperative on?cology group，ECOG）評分≥2 級（Plt;0.001）、骨髓受累（P=0.010）、T 細胞淋巴瘤預后指數（prognostic index for T-celllymphoma，PIT）≥2分（P=0.012）、國際預后指數（internationalprognostic index，IPI）≥2分（P=0.038）、EBER陰性（P=0.011）、CXCL13 陰性（P=0.008）、BCL6 陽性（P=0.042）和Ki67 陽性（P=0.022）是OS 不良預后因素（表5）。上述因素除PIT 和BCL6外，也導致較差的PFS（表5）。鑒于本研究病例數有限，多因素COX回歸分析采用逐步向前/向后法，以P=0.050和P=0.100分別作為單因素進入模型和排除模型的閾值，結果提示骨髓受累、EBER陰性和Ki67陽性不僅是OS獨立不良預后因素（P=0.003、P=0.001、P=0.034，表6），也獨立負性影響PFS（P=0.021、P=0.003、P=0.021，表6）。

3 討論

nTFHL-AI是具有TFH表型的成熟T細胞淋巴瘤，以全身性淋巴結腫大和系統(tǒng)性癥狀為主要特征，伴有HEVs和FDCs顯著增生。EBV陽性B細胞增生可見于66%～81.6%的病例[11-12]。此外，nTFHLAI病例中EBV陽性B細胞和EBV陰性腫瘤T細胞是常見的，但有研究發(fā)現EBV 陽性的腫瘤T 細胞[13-14]。本研究也發(fā)現3例EBER 陽性的腫瘤T 細胞。鏡下觀察EBV感染的T細胞，形狀小而圓，能與較大的感染B細胞區(qū)分。為進一步確認EBV感染的是T還是B細胞，可以同時進行EBER-CD3和EBER-CD20雙染色來區(qū)分。

目前公認治療nTFHL-AI 的一線化療治療為CHOP方案，但患者預后通常不理想。雖然本研究一線治療緩解率與之前的報道相符[15]，但患者5年OS 率（31%）和PFS 率（16%）均低于之前報告比例[15-18]，這可能與本研究隊列中拒絕治療的患者較多（10%）有關。此外，盡管39名患者接受了CHOP方案治療，但其治療可能未達到最佳效果，因此開發(fā)最佳治療策略仍是必然需求。

在預后方面，BCL6陽性表達患者的生存結果似乎更差（OS vs. PFS，P=0.026 vs. P=0.044）。單因素分析顯示，BCL6 陽性是OS 不利預后因素（P=0.042）。BCL6作為一種轉錄抑制因子，在TFH發(fā)育中發(fā)揮調節(jié)作用。BCL6在nTFHL-AI患者中強陽性表達暗示其可能是一個潛在的治療靶點[19]。此外，BCL6表達與TET2突變存在明顯相關性。TET2作為雙加氧酶，能將5-甲基胞嘧啶轉化為5-羥甲基胞嘧啶，并在大多數nTFHL-AI中頻繁突變[20-21]。研究表明，TET2 突變可能導致高甲基化，進而促使BCL6過表達。此外，BCL6異常表達似乎會導致向TFH細胞偏向分化，最終導致人類T細胞淋巴瘤產生[22]。因此nTFHL-AI中TET2突變與BCL6過表達可能共存，并與患者不良預后相關。然而，BCL6在nTFHL-AI中的確切機制尚未完全闡明，需要進一步地研究。

本研究發(fā)現，CXCL13 陰性組患者與CXCL13陽性組相比，1年、2年和3年的OS和PFS顯著降低（P=0.003、P=0.040）。單因素分析表明，CXCL13陰性是nTFHL-AI患者OS和PFS的不利預后標志（P=0.008、P=0.025）。相反，CXCL13 陽性表達可能是nTFHL-AI患者的有利預后因素。作為一種趨化因子，CXCL13 通過與其受體CXCR5 相互作用，參與生發(fā)中心的形成[23]。然而，Kim TY等[24]認為，NK/T細胞淋巴瘤中，血清CXCL13水平越高，患者OS和PFS越低。這與本研究結果不一致，可能因為淋巴瘤亞型不同，前者是NK/T 細胞淋巴瘤，本研究為nTFHL-AI；其次，研究樣本不同，前者是血清水平，本研究則在組織水平檢測；最后，本研究樣本數量有限，患者隨訪時間僅3年，需要增加樣本量和延長隨訪時間來進一步驗證CXCL13對nTFHL-AI的預后影響。EBV狀態(tài)對nTFHL-AI患者生存和預后的影響仍有爭議[11，24-25]。在本研究中，與EBER陽性患者相比，EBER 陰性患者OS 和PFS 顯著縮短（P=0.013、P=0.047）。研究進一步發(fā)現，EBER陽性細胞比例較低與較差OS相關（P=0.013）。多因素量分析提示，EBER陰性表達是OS和PFS的獨立不良預后因素（P=0.001、P=0.003）。本研究中EBER 預后意義與先前文獻報道不一致，不排除樣本量有限，隨訪時間不足5年等原因，故增大樣本量和持續(xù)隨訪來進一步驗證EBER 對生存期的影響是必不可少的。此外，本研究還發(fā)現EBV狀態(tài)與CXCL13表達之間存在顯著相關性。EBER陽性組的CXCL13陽性表達率高于EBER 陰性組（P=0.006）。EBV 或EBER與CXCL13之間潛在關系可能源自一個假設：B 細胞被EBV 感染后遞呈病毒蛋白如LMP-1 和EBNA-1，同時上調B7（CD28配體），進而激活CD4陽性Th細胞，促進CXCL13生成，從而推動B細胞增殖和激活，形成一個免疫刺激的“正反饋循環(huán)”[26]。然而，目前對EBV或EBER 與CXCL13之間的關聯(lián)仍不明確，需要深入研究。

總之，本研究對nTFHL-AI患者臨床病理特征和預后因素進行分析，為該病的管理提供了一些見解。研究表明，CXCL13陽性表達與患者良好預后相關，而BCL6 陽性和EBER 陰性則是不利預后因素，特別是EBER陰性是一個顯著的獨立不良預后因素。

（責任編輯：李青穎）