摘 要：低溫脅迫制約了葫蘆科作物冬季栽培。首先綜述了選擇育種、引種、雜交及雜種優(yōu)勢利用在葫蘆科作物耐低溫育種中的應(yīng)用，并列舉了當(dāng)前保存葫蘆科種質(zhì)的資源庫，然后綜述了倍性育種及嫁接導(dǎo)致的可遺傳變異在耐低溫育種中的潛在作用以及葫蘆科基因組測序現(xiàn)狀，并列舉了響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)基因或位點，整理了基因編輯應(yīng)用于葫蘆科耐低溫性研究的最新進展，最后介紹了葫蘆科作物響應(yīng)低溫脅迫的相關(guān)表現(xiàn)，為耐低溫性評價提供參考。

關(guān)鍵詞：葫蘆科；育種；耐低溫；基因編輯

中圖分類號：S642+S65 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）08-001-07

Research progress on low temperature tolerance breeding of Cucurbitaceae crops

WU Zhengjing1， ZHANG Hao1， LIU Sujuan1， AN Bingjie1， WU Jingjing1， LONG Yuan1， SONG Chunlei2

（1. College of Horticulture and Plant Protection， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， Henan， China; 2. Agricultural and Rural Bureau， Xin'an County， Xin’an 471899， Henan， China）

Abstract： Low temperature stress restricts winter cultivation of Cucurbitaceae crops. This review first summarizes the application of selective breeding， introduction， hybridization and heterosis utilization in low temperature tolerance breeding of Cucurbitaceae， and lists the current resource libraries for Cucurbitaceae germplasm preserving. Subsequently， the potential roles of heritable variations caused by ploidy breeding and grafting in low temperature tolerance breeding and the current status of genome sequencing in the Cucurbitaceae family were reviewed. Relevant genes or loci responding to low temperature stress were listed， and the latest progresses in gene editing applications for low temperature tolerance research in the Cucurbitaceae family were summarized. Finally， the relevant performances of Cucurbitaceae crops in response to low temperature stress were introduced， which provided reference for the evaluation of low temperature tolerance.

Key words： Cucurbitaceae; Breeding; Low temperature resistance; Gene editing

目前，葫蘆科作物至少有965種，并分為95屬，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，對低溫脅迫的耐受性普遍較低。全球范圍內(nèi)栽培的葫蘆科作物主要有西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜等，此外，絲瓜、苦瓜、冬瓜和葫蘆（瓠瓜）在亞洲也較常見，葫蘆是葫蘆科砧木的重要材料。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，2022年全球主要葫蘆科作物產(chǎn)值高達1480億美元，其中僅亞洲地區(qū)就占比82.5%[1]。低溫脅迫會導(dǎo)致植物出現(xiàn)多種生理異常，統(tǒng)稱為低溫?fù)p傷（chilling injury，CI），低溫?fù)p傷最具代表性的特征是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損[2]，植株生長發(fā)育出現(xiàn)異常。

遺傳育種工作者利用傳統(tǒng)育種手段評價了大量葫蘆科種質(zhì)資源，對其耐低溫性的遺傳規(guī)律進行研究[3-5]，培育出一系列耐低溫新品種，為葫蘆科耐低溫資源的評價和利用奠定了基礎(chǔ)。近年來，通過基因組測序和基因功能分析，深入研究了在葫蘆科作物生長發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用的基因和位點；CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)允許靶向修飾特定基因，對參與低溫響應(yīng)的相關(guān)基因與位點有了更清晰的理解，有助于培育對低溫具有更強耐受性的葫蘆科新品種。

1 傳統(tǒng)育種手段

1.1 選擇育種與引種

葫蘆科耐低溫選擇育種已開展多年，但天然耐低溫種質(zhì)的缺乏導(dǎo)致有關(guān)耐低溫選擇育種的報道較少；引種是篩選出能夠適宜當(dāng)?shù)卦耘喹h(huán)境且具有較強低溫耐受性品種的常用手段，例如濰坊地區(qū)引入節(jié)瓜碧綠翡翠[6]，上海地區(qū)引入苦瓜綠箭霸王[7]。

1.2 雜交育種及雜種優(yōu)勢利用

育種工作者常通過雜交以及對雜交后代的篩選、純化，獲得具有優(yōu)良親本性狀的新品種[8-9]。雜種優(yōu)勢利用是葫蘆科育種最常用的手段，其親本組配特別強調(diào)雜種一代的優(yōu)勢表現(xiàn)，近幾年利用雜種優(yōu)勢培育出的耐低溫葫蘆科新品種有甜瓜金蜜一號[10]、西葫蘆京葫36[11]、南瓜國品天香[12]和節(jié)瓜花玉女[13]等。雌性系常作為雜種優(yōu)勢利用的母本材料，能夠降低育種成本，研究人員已經(jīng)利用全雌性母本培育出一系列葫蘆科耐低溫新品種，例如黃瓜欣劍[14]和苦瓜秀玉1號[15]等。

目前保存有葫蘆科種質(zhì)資源的主要數(shù)據(jù)庫、機構(gòu)和項目如表1所示。

1.3 誘變育種

誘變育種具有耗時短、成本低、操作簡單、變異頻率高和范圍廣等特點。化學(xué)誘變無需物理誘變所用的昂貴設(shè)備，且產(chǎn)生點突變的頻率更高，常用于葫蘆科的抗逆性育種。常用的化學(xué)誘變劑有甲基磺酸乙酯（EMS）和疊氮化鈉（NaN3）等，Khan等[16]認(rèn)為，NaN3誘導(dǎo)葉綠素和植物形態(tài)突變的頻率高于EMS。葫蘆科作物通常選擇子葉或種子作為誘變材料，因為其細(xì)胞分裂旺盛，易發(fā)生突變。確定誘變劑最佳劑量的原則是以更少的損失獲得更多的突變型，半致死劑量（LD50）通常被認(rèn)為是誘變的最佳濃度[17]。楊國志[18]利用0.5～2.0 mmol·L-1 NaN3處理西瓜種子，然后選擇再生率接近50%的處理時間和濃度（1.5 h，1.5 mmol·L-1）為最佳誘變方案，最終誘變并篩選出在低溫脅迫下表現(xiàn)良好的西瓜植株。多種技術(shù)組合可以提高育種效率，例如組織培養(yǎng)用于縮短時間，誘變用于拓寬變異，標(biāo)記檢測用于鑒定變異[19]；對同一材料施加多種誘變劑也能有效拓寬突變譜。

1.4 倍性育種

葫蘆科單倍體育種一般通過花藥離體培養(yǎng)、輻射花粉和離體胚挽救獲得單倍體植株[20]，然后通過秋水仙素處理使其恢復(fù)正常染色體數(shù)，相對于雜交育種，可縮短育種年限，例如通過單倍體技術(shù)快速純化獲得的黃瓜耐低溫系H064-1-2[21]。多倍體育種通過人工誘變或基因組學(xué)等手段使染色體組加倍，常應(yīng)用于三倍體無籽西瓜育種。楊炳艷等[22]發(fā)現(xiàn)西瓜83166同源三倍體的耐冷性強于二倍體；劉文革等[23-24]研究不同倍性的西瓜發(fā)現(xiàn)，多倍體西瓜的耐冷能力高于二倍體西瓜。

1.5 嫁接

Janos Taller等[25-26]通過開展辣椒種內(nèi)嫁接并繁殖接穗后代，再加以選擇，培育出一系列綜合性狀優(yōu)良且穩(wěn)定的辣椒新品種。嫁接技術(shù)廣泛應(yīng)用于葫蘆科作物栽培，耐低溫南瓜砧木增強了西瓜[27]和南瓜[28]接穗的低溫耐受性。葫蘆科耐低溫砧木與低溫敏感接穗間存在miRNAs[29]和移動mRNA[30]的交流與表達變化，且異源嫁接組合比同源嫁接組合的交流更頻繁，低溫耐受性也更強。南瓜和黃瓜的嫁接試驗結(jié)果表明，嫁接黃瓜自交后代發(fā)生可遺傳的變異[31]。

2 分子育種

全基因組測序和相關(guān)基因功能的研究為分子育種開辟了道路，使基因編輯成為葫蘆科耐低溫育種的新途徑。

2.1 葫蘆科作物基因組測序

2009年，首個葫蘆科作物黃瓜的基因組測序完成[32]，第二個是甜瓜[33]，第三個是西瓜[34]。截至目前，世界各地的研究人員先后完成了葫蘆科中至少87個品種的基因組測序[35]，有苦瓜[36]、絲瓜[37]、南瓜[38]、波棱瓜[39]、刺角瓜[40]和冬瓜[41]等。復(fù)雜的基因組序列及注釋可以使人們對基因功能的認(rèn)識更加清晰。

2.2 葫蘆科作物參與低溫響應(yīng)的相關(guān)基因或位點

QTL定位已應(yīng)用于識別葫蘆科作物中不同性狀的相關(guān)位點[42-44]。表2列出了葫蘆科作物參與低溫響應(yīng)的相關(guān)基因。

Chung等[45]認(rèn)為黃瓜幼苗的耐低溫性是由多個位點的等位基因控制的，其中一部分遺傳自母本Chipper的葉綠體基因組；同樣，耐低溫黃瓜NC76和Chipper與低溫敏感品種經(jīng)低溫處理后在葉綠體相關(guān)基因CSatpB和CSycf1上存在差異[46]。Dong等[47]發(fā)現(xiàn)，生長素反應(yīng)因子Csa6G445210和乙烯反應(yīng)跨膜蛋白基因Csa6G445230可能是黃瓜幼苗耐低溫性的候選基因。黃瓜葉片中有37個CsaGRAS對短期或長期低溫脅迫有響應(yīng)，存在相互作用，并可能是CBF耐低溫途徑的下游因子[48]。Zhao等[49]報道了褪黑素通過上調(diào)CsZat12轉(zhuǎn)錄水平來緩解黃瓜幼苗遭受的低溫?fù)p傷。趙振翔等[50]認(rèn)為，CsDMEs參與了黃瓜的低溫響應(yīng)。袁曉等[51]發(fā)現(xiàn)低溫處理誘導(dǎo)了黃瓜幼苗和葉片中GolS2的表達。

水楊酸與CBFs（特別是CBF3和CBF4）在西瓜耐低溫響應(yīng)過程中具有協(xié)同作用[52]，同樣，南瓜CmoCBF1和CmoCBF3的mRNA豐度在低溫脅迫下被高度誘導(dǎo)[28]。Yan[19]等在西瓜基因組中鑒定出40個ClHDZs，一半的ClHDZs在低溫下表現(xiàn)為轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)（ClHDZ18、ClHDZ30、ClHDZ35等），少數(shù)表現(xiàn)為下調(diào)（ClDHZ3、ClHDZ23）。AtPDLP5控制擬南芥細(xì)胞間通信和防御信號，而西瓜的同源基因Cla003949在低溫下表達上調(diào)[53]。

南瓜中大多數(shù)CmoGS在低溫下RNA豐度會發(fā)生變化，但變化趨勢略有不同，與短期低溫脅迫相比，長期低溫脅迫下的變化更為顯著[54]。低溫脅迫下南瓜砧木上調(diào)了西瓜接穗中多胺代謝通路關(guān)鍵基因ADC的表達，提高了嫁接植株的低溫耐受性[27]。南瓜應(yīng)激響應(yīng)基因CmNAC1是ABA信號通路的關(guān)鍵因子，在適應(yīng)低溫中發(fā)揮正向作用[55]。將南瓜耐低溫株系和低溫敏感株系對比發(fā)現(xiàn)，CmRCC1[56]和CmoDof4.6[57]對低溫有響應(yīng)表達。

低溫弱光下絲瓜G6PDH、PER5和ATPβ的表達量呈先上升后下降的趨勢[58]，與其類似的還有LcUBQ[59]。CmNCED3通過提高脫落酸水平來增強甜瓜幼苗的耐低溫性[60]。甜瓜在低溫處理后有11個CmWRKYs表達量顯著上調(diào)[61]。CmAHP1～CmAHP5均參與了甜瓜低溫響應(yīng)，其中CmAHP4可能是關(guān)鍵的候選基因[62]。杜文麗等[63]從苦瓜中篩選出WRKY23、MYB108和ERF017等低溫響應(yīng)候選基因。趙添悅等[64]發(fā)現(xiàn)，冬瓜中BhWRKY2、BhWRKY5和BhWRKY39參與了低溫響應(yīng)。

2.3 通過基因編輯增強葫蘆科作物耐低溫性

目前，研究人員更傾向于使用CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，這主要是由于ZFNs和TALENs的使用需要定制蛋白，而設(shè)計CRISPR靶向方案會更容易。生長素和分裂素協(xié)同作用參與葫蘆科作物耐低溫性，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除黃瓜CsHEC1，可以抑制其生長素合成[65]；敲除CsHEC2可抑制分裂素水平，而過表達CsHEC2可提高分裂素水平[66]。ClCOMT1過表達導(dǎo)致西瓜植株中褪黑素含量顯著增加，低溫耐受性也得到增強[67]。植物低溫耐受性與乙烯水平有關(guān)，甜瓜CmNAC-NOR敲除植株中的NAC結(jié)構(gòu)域被破壞，乙烯生成受到抑制[68]，同樣，CmACO1敲除也導(dǎo)致乙烯含量降低[69]；在ROS1和CTR1敲除的甜瓜中則觀察到更早的乙烯生成[70]，這對耐低溫葫蘆科新品種的培育具有重要意義。

3 葫蘆科作物響應(yīng)低溫的相關(guān)表現(xiàn)

低溫脅迫的初始表現(xiàn)是葉片細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，電解質(zhì)外滲[28]，而無機鹽、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)通過維持細(xì)胞膜形態(tài)結(jié)構(gòu)來防御低溫?fù)p傷[71]。低溫會誘導(dǎo)葉片發(fā)生一系列氧化反應(yīng)并生成活性氧，而不飽和脂肪酸、丙二醛含量和抗氧化酶（SOD、POD、CAT等）活性可反映葫蘆科作物低溫脅迫下的氧化應(yīng)激程度[72]。水楊酸可調(diào)節(jié)抗氧化代謝[52]，其含量與黃瓜幼苗低溫耐受性呈正相關(guān)[73]。α-亞麻酸參與南瓜早期冷響應(yīng)[28]；腐胺積累也可增強西瓜接穗的耐低溫性[27]。低溫脅迫可影響黃瓜類囊體和葉綠體膜超微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低葉綠素含量[30]。在植物激素中，脫落酸、生長素、赤霉素、乙烯和水楊酸是葫蘆科低溫響應(yīng)的正或負(fù)調(diào)節(jié)因子[52]。根、莖鮮質(zhì)量可作為南瓜耐低溫性的評價指標(biāo)[57]；葉片生長角度與狀態(tài)可反映甜瓜苗期耐低溫能力[74]。

4 結(jié)論與展望

選擇育種、引種、雜交及雜種優(yōu)勢利用對葫蘆科作物耐低溫育種做出了重要貢獻；誘變能夠有效獲得耐低溫新種質(zhì)且具有低成本的優(yōu)勢；倍性育種已被證實能夠提高葫蘆科作物低溫耐受性；嫁接可導(dǎo)致葫蘆科作物產(chǎn)生遺傳變異，有希望成為耐低溫育種新途徑。基因編輯有可能成為改良葫蘆科耐低溫性狀的新流程。葫蘆科作物主要起源于溫?zé)岬貐^(qū)，自然界缺少天然的耐低溫種質(zhì)，所以選種、引種和雜交等手段對葫蘆科耐低溫性可能僅具有改良作用，難以使其大幅提高；通過誘變或基因工程等途徑進行葫蘆科耐低溫新種質(zhì)創(chuàng)新是未來的主要方向。

雜種優(yōu)勢群的劃分為葫蘆科耐低溫育種的親本選配提供了便利，而測序及分子標(biāo)記是劃分雜種優(yōu)勢群的重要工具[75]。新興的快速育種技術(shù)（speed breeding，SB）可通過促進早花加速育種，可以有效縮短耐低溫育種時間[76]，具體操作需要根據(jù)生長周期進行適當(dāng)調(diào)整。雙單倍體（double haploid，DH）育種可以在1 a內(nèi)培育出純合自交系，同時消除不需要的等位基因[77]，通過DH開發(fā)的純合西瓜[78]是培育耐低溫品種的理想材料。TILLING是一種全新的反向遺傳學(xué)研究方法，借助高通量測序手段，能夠快速有效地鑒定出誘變?nèi)后w中的點突變[79]，推進葫蘆科耐低溫性研究。下一代育種技術(shù)（NBT）包含一系列傳統(tǒng)育種手段與基因組學(xué)工具，賦予了研究人員定向控制低溫響應(yīng)基因的能力[80]。

葫蘆科種質(zhì)資源的收集有助于發(fā)現(xiàn)耐低溫材料，推進耐低溫新品種的選育。種質(zhì)資源庫能夠有效保護種質(zhì)資源安全和遺傳多樣性，但其具有延時性，所以務(wù)必要及時、定時更新資源庫的種質(zhì)收藏。世界蔬菜中心（中國臺灣）（World Vegetable Center，Taiwan，China）于2006年啟動全球葫蘆科育種計劃（global cucurbit breeding program），至今已與亞洲數(shù)十個私營種質(zhì)企業(yè)達成合作，有利于發(fā)現(xiàn)更多未開發(fā)的葫蘆科耐低溫種質(zhì)[81]。

綜上，傳統(tǒng)育種手段與分子育種技術(shù)相輔相成、相得益彰，勢必將更好地推進葫蘆科耐低溫新品種的培育。

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