關鍵詞 碳點；熒光；納米材料；潛在手??；手印顯現

犯罪現場遺留的手印通常為潛在手印，很難用肉眼清晰觀察，因此，高質量顯現潛在手印是手印分析和鑒定的前提[1-2]。近年來，研究者開發(fā)了一系列新型的納米發(fā)光材料并將其用于傳統的手印顯現，由此建立了手印納米熒光顯現方法[3]。由于納米熒光材料的發(fā)光機理為光致發(fā)光，如果光源選擇不恰當，會激發(fā)顯現材料和客體背景同時產生熒光，產生客體背景熒光干擾[4]。目前，解決客體背景熒光干擾的兩個有效途徑為基于上轉換發(fā)光材料的手印顯現和基于長余輝發(fā)光材料的手印顯現[5]。上轉換發(fā)光材料的激發(fā)光源通常為紅外光源，具有便攜性差和成本高的缺點；長余輝發(fā)光材料的激發(fā)光源通常為紫外光源，不僅會對操作人員的健康造成直接威脅，而且會對手印中的接觸DNA 產生潛在傷害[4，6-7]。碳點（Carbon dots， CDs）作為一種新型的納米熒光材料具有對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性，已被廣泛應用于生物成像領域[8-10]。將CDs 應用于手印顯現，可通過靈活改變激發(fā)光波段降低客體背景熒光干擾。因此，CDs 是實現手印高質量與低背景顯現的理想材料。

2015 年， Fernandes 等[11]首次將CDs 與SiO2、TiO₂和鋰藻土（Laponite）形成的3種納米復合物用于潛在手印的顯現，在410 nm 紫光、440 nm 藍紫光和470nm藍光激發(fā)下，手印表面分別產生了藍色、綠色和紅色熒光。此后，研究者對基于CDs 材料的手印顯現進行了深入研究。一方面，將CDs 與不同基質形成的摻雜型復合物用于手印顯現，如2016年，Li等[12]將CDs 與淀粉（Starch）結合形成的納米復合物用于手印顯現；2018 年，Peng等[13]將CDs 與SiO₂微球結合形成的納米復合物用于手印顯現；2019年，Zhai等[14]將CDs與蒙脫土（Montmorillonite）形成的納米復合物用于手印顯現；2021年，Sekar[15]、He[16]和Ding[17]等分別將CDs 與SiO₂、B₂O₃和Fe₃O₄@SiO₂形成的納米復合物用于手印顯現。另一方面，將CDs與不同殼層形成的核殼型復合物用于手印顯現，如2017年，Zhao等[18]將CDs@SiO₂納米復合物用于手印顯現；2018 年， Yadav 等[19]將CDs@TiO₂納米復合物用于手印顯現；2021年， Hu等[20]將CDs@SiO₂納米復合物用于手印顯現。雖然基于CDs納米復合物的手印顯現方法研究已經取得了長足發(fā)展，但是仍存在著以下亟需解決的問題：（1）激發(fā)光源多為紫外光源，對操作人員和生物物證均存在潛在危害；（2）產生的熒光多為藍光，與客體背景之間的對比反差較低；（3）手印顯現的靈敏度和選擇性均有待提高。

鑒于此，本研究采用溶劑熱法合成了熒光CDs，并將其制備成CDs-淀粉熒光復合物，用于潛在手印的熒光顯現，最后從定性和定量兩個層面詳細考察了手印顯現的效果。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Talos F200X 透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；GeminiSEM 300掃描電子顯微鏡（德國ZEISS 公司）；Zetasizer Nano ZS ZEN3600 納米粒度儀和Zeta 電位分析儀（英國Malvern 公司）；SmartLab SE X 射線衍射儀（日本Rigaku 公司）；K-Alpha X 射線光電子能譜儀（美國Thermo Scientific 公司）；TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；UV-2600 紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu 公司）；CaryEclipse 熒光分光光度計（美國Agilent 公司）。

一水合檸檬酸（CA，分析純）、尿素（UR，分析純）、乙二醇（EG，分析純）、無水乙醇（分析純）、淀粉（分析純）、納米SiO₂（99.5%）、蒙脫土、高嶺土（化學純）、硅藻土和氧化鎂（分析純）購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 CDs的合成

將0.2101 g（1 mmol）CA 與0.5405 g（9 mmol）UR 混合，加入20.00 mL EG，超聲溶解。將上述溶液轉移至50 mL 水熱合成反應釜中，于180 ℃密封反應4 h 后，自然冷卻至室溫。將反應產物在9500 r/min 下離心15 min， 取上層液體用22 μm 微孔濾膜過濾，得到CDs 懸浮液。將此懸浮液裝入透析袋（截留分子量MWCO 500），在去離子水中透析72 h，最終得到純化的CDs 懸浮液。將純化后的CDs 懸浮液真空冷凍干燥，得到CDs 粉末。

1.2.2 CDs復合物的制備

向0.40g淀粉中加入290 μL 無水乙醇，形成濃稠的糊狀物，再向其中加入60 μL CDs 懸浮液，混勻，置于50 ℃恒溫干燥箱中烘干1 h 得到固體產物，研磨后得到CDs-淀粉復合物。采用類似方法制備CDs與納米SiO₂、蒙脫土、高嶺土、硅藻土以及氧化鎂等其它基質結合的復合物。

1.2.3 手印顯現與熒光增強

用制得的CDs 復合物粉末對手印進行刷顯。采用多波段光源對顯現后的手印進行激發(fā)，并搭配濾光片在暗場條件下拍照固定。拍攝參數設定為：光圈值f4、曝光時間0.5 s、感光度200。

1.2.4 手印顯現效果的表征

參照文獻[21]的方法表征手印顯現的對比度。將CDs 復合物、客體和CDs 復合物顯現后的手印樣本固定在樣品架上，采用Cary Eclipse 型熒光分光光度計分別測定三者的熒光發(fā)射光譜（檢測參數：激發(fā)波長為415 nm、激發(fā)狹縫為10 nm、發(fā)射狹縫為5 nm、PMT 檢測電壓為500 V）。將熒光發(fā)射光譜數據導入Origin 軟件中，分析手印顯現信號和客體背景噪聲之間的強度差異。

參照文獻[22]的方法考察手印顯現的選擇性。將手印顯現照片導入Image J 軟件中，利用StraightLine 工具將直線穿過數組乳突紋線及小犁溝，得到對應的手印分析選區(qū)。利用Plot Profile 工具處理得到此選區(qū)的灰度曲線，分析波峰（對應乳突紋線）與波谷（對應小犁溝）之間的強度差異。

2 結果與討論

2.1 CDs的性能表征

CDs的透射電子顯微鏡（TEM）照片如圖1A 所示，其形貌近似為球形，顆粒尺寸較小，具有良好的單分散性。CDs的TEM 照片的粒徑分布統計結果（見電子版文后支持信息圖S1）表明其平均粒徑（Mean size）為2.46 nm。CDs懸浮液的動態(tài)光散射（DLS）表征結果（見電子版文后支持信息圖S2）表明其平均粒徑（Z-average）為2.56 nm。通過以上兩種方法測出CDs 的平均粒徑結果差別不大，證明CDs 懸浮液具有均一的分散性。CDs 的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）照片如圖1A 插圖所示，可以觀察到明顯的晶格條紋，說明其具有高度結晶化的結構。經測量， CDs 的晶格間距為0.2558 nm， 對應且略大于石墨的100 晶面間距（0.2139 nm）。CDs 的X 射線衍射（XRD）圖如圖1B 所示，其衍射峰的位置及強度與六方晶系石墨的標準衍射譜圖（JCPDS No. 41-1487）較一致，說明CDs 具有石墨的晶體結構。在24.06o 處出現了較強的衍射峰，可計算出CDs 的晶面間距為0.3696 nm，對應且略大于石墨的002 晶面間距（0.3376 nm）。HRTEM 和XRD 表征結果表明， CDs 的晶格間距均大于其對應的石墨晶面間距，這是由于石墨烯邊緣的某些官能團的空間位阻效應或者因sp3 雜化引起的面內變形效應所導致[23]。CDs 的拉曼（Raman）光譜如圖1C 所示， D 帶位于1366 cm^–1 處，對應于無序的sp2 碳結構；G 帶位于1587 cm^–1 處，對應于有序的結晶石墨碳結構[24]。經計算， D 帶與G 帶的強度比值（ID/IG）為1.08，說明CDs 中無序碳原子與有序碳原子的比例大致相當，但前者略多。CDs 的X 射線能譜（EDS）表征結果見電子版文后支持信息圖S3 和S4，在選區(qū)內可觀察到C、O 和N 元素均勻分布，其中， C、O 和N 元素的原子百分比分別為77.24%、22.31%和0.44%。CDs 的X 射線光電子能譜（XPS）全譜如圖1D 所示，其中， C、O 和N 元素的原子百分比分別為64.63%、28.17%和6.12%。需要指出的是， CDs 的EDS 和XPS 分析結果存在差異，這是因為CDs 被分散在超薄碳膜上進行EDS 檢測，基底中大量C 元素會影響EDS 分析的準確度，因此，XPS 分析結果更準確。CDs 的C 1s 高分辨XPS 譜圖如電子版文后支持信息圖S5 所示，峰值位于284.58、285.60、286.68 和288.57 eV 處的曲線分別對應于sp² 碳（C=C/C—C）、sp³ 碳（C?O/C?N）、sp2 碳（C=O/C=N）和羧基碳（?COOH）[23， 25]。CDs 的O 1s 高分辨XPS圖如電子版文后支持信息圖S6所示，峰值位于531.20 和532.40 eV 處的曲線分別對應于C=O 和C?O[26]。CDs 的N 1s 高分辨XPS 譜圖如電子版文后支持信息圖S7 所示，峰值位于398.38、399.49 和401.28 eV 的曲線分別對應吡啶氮、吡咯氮和石墨氮[23]。CDs 的傅里葉變換紅外（FTIR）光譜如圖1E 所示，在3420 cm–1 處出現了O—H 鍵的伸縮振動峰，在2934 與2853 cm^–1 處分別出現了C—H 鍵的反伸縮與伸縮振動峰，在1630 與1387 cm^–1 處分別出現了羧酸陰離子（COO–）的反伸縮與伸縮振動峰，在1096 cm^–1 處出現了C—H 鍵的彎曲振動峰[27]。XPS 和FTIR 的分析結果表明， CDs 表面含有羧基基團。CDs 懸浮液的Zeta 電位表征如電子版文后支持信息圖S8 所示， Zeta 電位為–13.5 mV， 說明CDs 懸浮液帶負電荷，進一步驗證了CDs 表面含有羧基基團。從電子版文后支持信息圖S8 的插圖中可見，純化的CDs 懸浮液呈淺褐色，可以長期穩(wěn)定保存，這是由于羧基基團可使CDs 穩(wěn)定存在于水中。CDs 懸浮液的紫外-可見吸收光譜（UV-vis）如圖1F 所示，在300～400 nm 范圍內出現了較寬的紫外吸收峰，并在335.8 nm 處出現了最強紫外吸收峰，這是由于C=O和C=N 的n→π*躍遷所致[23]。CDs 懸浮液的熒光光譜（FS）如圖1F 所示，最大發(fā)射波長λEm.（max）為543.0 nm， 對應的最大激發(fā)波長λEx.（max）為463.0 nm。由圖1F 中的插圖可見，純化的CDs 懸浮液在450 nm藍光激發(fā)下能夠產生明亮的綠色熒光。

2.2 CDs熒光性質的影響因素

CDs具有對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性，即可通過調整激發(fā)波長λEx. 改變發(fā)射波長λ_Em.[28]。合成條件（反應溫度、反應時間和原料比例等）對CDs最大激發(fā)波長λ_Ex.（max）和最大發(fā)射波長λ_Em.（max）的影響非常明顯。

2.2.1 激發(fā)光源的影響

在n（CA）∶n（UR）=1∶9、EG用量為20.00mL、反應溫度為180 ℃、反應時間為4 h 條件下合成CDs，考察CDs 的λEm.隨λEx.的變化情況。如圖2A 所示，當λ_Ex.從380 nm 紅移至510 nm 時， λ_Em.也隨之產生了明顯的紅移現象，并且熒光發(fā)射強度呈現先增高后降低的趨勢; 由圖2B 可進一步看出， λ_Em.隨λ_Ex.從479 nm 紅移至556 nm。由圖2C 中可更直觀看出， CDs 具有對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性。如圖2D 所示，通過調整激發(fā)光源的波長并搭配濾光片，可在暗場下觀察到同一CDs 懸浮液所產生的多色熒光，覆蓋了從藍光到紅光的區(qū)域。

2.2.2 反應條件的影響

固定n（CA）∶n（UR）=3∶7、EG 用量為20.00 mL， 通過調整反應溫度（140～200 ℃）和反應時間（2～12 h）合成不同的CDs，同時考察CDs 的最大激發(fā)波長λ_Ex.（max）（圖3A）與最大發(fā)射波長λ_Em.（max）（圖3B）的變化情況，結果表明， CDs 的λ_{Ex/Em.（max）} 隨著反應溫度的升高或反應時間的延長均產生不同程度的紅移現象。在140～180 ℃范圍內， λ_{Ex./Em.（max）} 的紅移程度均隨著反應時間的延長呈現先快速增大后趨于平穩(wěn)的趨勢，并且反應溫度越高， λ_{Ex./Em.（max）} 趨于平穩(wěn)的時間越提前；甚至在200 ℃時， λ_{Ex./Em.（max）} 的紅移程度在反應初期即出現平穩(wěn)趨勢。據文獻[23]報道， CDs 石墨化程度的加劇以及CDs 顆粒尺寸的增大均會導致其λ_{Ex./Em.（max）} 產生紅移現象。在本反應體系中，反應溫度升高或反應時間延長會加劇CDs 的石墨化程度，也會增強CDs 顆粒的聚集效應，進而促進CDs 的λ_{Ex./Em.（max）}紅移。因此，反應溫度越高、反應時間越長， CDs 的λ_{Ex./Em.（max）}的紅移程度越大。

2.2.3 反應原料的影響

固定EG 用量為20.00 mL、反應溫度為180℃、反應時間為4 h， 通過調整n（CA）∶n（UR）合成不同的CDs，同時考察不同CDs 的λEx.（max） 與λ_Em.（max） 的變化情況（圖4）。結果表明，隨著n（CA）∶n（UR）升高，CDs 的λ_Ex.（max） 與λ_Em.（max） 均產生不同程度的紅移， λ_Ex.（max） 呈現出先增加后平穩(wěn)的趨勢， λ_Em.（max）呈現出逐漸增加的趨勢。由于CA 的分解溫度（175 ℃）高于UR 的分解溫度（135 ℃）， 因此，在高溫條件下， CA 比UR 更穩(wěn)定且更傾向于石墨化。在本反應體系中，隨著n（CA）∶n（UR）升高，CDs的石墨化程度加劇，進而促進CDs 的λ_{Ex./Em.（max）}紅移。因此， n（CA）∶n（UR）越高，CDs的λ_{Ex./Em.（max）}的紅移程度越大。

2.3 CDs復合物的制備及性能表征

固態(tài)CDs 具有較強的聚集誘導熒光猝滅效應[29]，因而不能直接應用于手印熒光顯現。通常，將CDs均勻分散于固體基質中，可有效防止其熒光猝滅[30-33]，保證手印的高質量顯現。本研究選用質地疏松且光學惰性的淀粉、納米SiO₂、蒙脫土、高嶺土、硅藻土和氧化鎂作為基質，并與CDs形成熒光復合物。具體操作步驟如下：固定基質的質量不變，向其中添加適量無水乙醇以形成糊狀物，再向其中加入不同體積的CDs 懸浮液，經充分混合烘干，得到一系列CDs熒光復合物。系列CDs熒光復合物分別在365、415和450nm 激發(fā)光下的熒光發(fā)射強度如圖5 所示， CDs-淀粉復合物在3種激發(fā)光下的熒光發(fā)射強度均最高，為后續(xù)手印熒光顯現的最佳選擇。系列CDs熒光復合物的最優(yōu)配方見電子版文后支持信息表S1。

CDs-淀粉復合物的掃描電子顯微鏡（SEM）照片如圖6A 所示，其形貌為微米級的不規(guī)則多面體，并且分散性較好。CDs-淀粉復合物的EDS 表征如圖6B 和6C 所示，在選區(qū)內可觀察到C、O 和N 元素的均勻分布情況，其中C 和O 元素的原子百分比分別為84.24%和15.76%，而N 元素并未被檢出。根據前文所述， N 元素在CDs 中的含量較低（6.12%）， CDs 在復合物中的含量也較低，而淀粉中含有大量的C 和O 元素，使得N 元素的含量未達到EDS 的檢測極限，故未被檢出。純淀粉和CDs-淀粉復合物的FTIR 光譜如圖6D 所示，兩者的譜圖大致相同，進一步證明了CDs 在復合物中的含量極低，不足以出現CDs 的特征峰。CDs-淀粉復合物的熒光光譜如圖6E 所示，分別采用多波段光源中3 種常見的波段（ 365、415、450 nm）激發(fā)， CDs-淀粉復合物能夠在440、508 和525 nm 處產生較強的熒光發(fā)射峰，說明CDs-淀粉復合物具有對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性?？紤]到365 nm 紫外光對操作人員及手印物質中接觸DNA 的潛在危害，實驗應盡量選取415 和450 nm 的激發(fā)光。CDs-淀粉復合物在明場及415 nm 藍紫光激發(fā)下的暗場照片如圖6F 所示，通過調整濾光片，可在暗場下觀察到同一CDs-淀粉復合物所產生的多色熒光從藍光區(qū)覆蓋到紅光區(qū)。

2.4 碳點復合物的手印顯現應用

2.4.1 手印顯現的熒光調諧

采用CDs-淀粉熒光復合物對油漆木表面潛在手印進行顯現（圖7A），再利用多波段光源中的365、415 和450 nm 等常見波段進行激發(fā)，同時搭配紅、橙、黃、黃綠、綠、青和藍等多種濾光片進行觀察，手印熒光顯現的效果如圖7B～7H 所示，通過選用不同波段的激發(fā)光并搭配合適的濾光片，顯現后的手印能夠產生明亮的紅、橙、黃、黃綠、綠、青和藍7 種顏色的熒光。本方法利用CDs-淀粉復合物對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性實現了潛在手印的多色熒光顯現模式，可以通過靈活選擇不同波段的激發(fā)光降低客體背景熒光的干擾，進而提高手印顯現的對比度。

2.4.2 手印顯現效果的考察

本研究選用背景復雜的大理石作為承痕客體，采用CDs-淀粉熒光復合物對客體表面的潛在手印進行粉末法顯現（圖8A），利用415nm 波段光進行激發(fā)，搭配綠色濾光片進行拍照（圖8A′），并從對比度、靈敏度和選擇性3 個方面對手印顯現效果進行考察。

手印顯現的對比度是指手印顯現信號與客體背景噪聲之間的對比差異程度[34]。從視覺感官效果定性考察，如圖8A′所示，手印部位產生了明亮的綠色熒光，而客體部位呈現為暗色，兩者之間的視覺反差明顯。從光譜表征結果定量考察，如圖8E 所示， CDs-淀粉復合物在508 nm 處產生了很強的熒光發(fā)射峰，對應于手印顯現信號；大理石客體在400～600 nm 范圍內產生了微弱的熒光發(fā)射峰，對應于客體背景噪聲；顯現后的手印在486nm 處產生了較強的熒光發(fā)射峰。顯現粉末大量吸附在乳突紋線部位而極少吸附在小犁溝部位，使顯現粉末不能將客體完全覆蓋，因此顯現后手印的熒光強度介于手印顯現信號和客體背景噪聲之間，但明顯強于客體背景噪聲。綜上所述，本方法具有較高的顯現對比度。

手印顯現的靈敏度是指顯現手印各級特征的清晰程度與精細程度[34]。從乳突花紋的一級特征考察，如圖8A′所示，乳突紋線連貫清晰。從乳突花紋的二級特征考察，皺紋（圖8B）和結合（圖8C）特征反映明顯；從乳突花紋的三級特征考察，如圖8D 所示，汗孔特征及乳突紋線的邊緣形態(tài)清晰可見。綜上所述，本方法具有較高的顯現靈敏度。

手印顯現的選擇性是指顯現試劑與手印物質之間的特異性結合程度[34]。從視覺感官效果定性考察，如圖8B～8D所示，乳突紋線部位產生了明亮的綠色熒光，小犁溝及皺紋等部位呈現為暗色，兩者之間的視覺反差明顯。從灰度表征結果定量考察，如圖8F所示，乳突紋線部位因吸附顯現粉末而呈現出亮色，其灰度值較高，對應于波峰；小犁溝等部位因極少吸附顯現粉末而表現為暗色，其灰度值較低，對應于波谷。從灰度曲線（圖8F）中可以看出，波峰與波谷分布均勻且差異明顯，說明顯現粉末均勻吸附于乳突紋線部位。綜上所述，本方法具有較高的顯現選擇性。

2.4.3 手印顯現適用性考察

選擇玻璃、瓷磚、理石、地板、金屬、塑料和紙張作為承痕客體（圖9A～9L），采用CDs-淀粉熒光復合物對客體表面的潛在手印進行粉末法顯現，適當選取365、415 和450 nm 波段光進行激發(fā)，搭配合適的濾光片進行觀察（圖9A′～9L′），考察手印顯現方法的適用性。如圖9A′～9H′所示，在弱背景熒光客體的情況下，選用415 nm 的藍紫光激發(fā)并搭配綠色濾光片，即可滿足手印顯現的高對比度。如圖9I′～9L′所示，在強背景熒光客體的情況下，有時還需選用其它波段（365 和450 nm）的激發(fā)光并搭配其它顏色的濾光片，才能實現足夠的顯現對比度。顯現結果表明，通過改變激發(fā)光波段和合理采用濾光片，能夠在很大程度上降低客體背景噪聲對手印顯現信號的干擾。綜上所述，本方法適用于常見光滑客體表面潛在手印的高對比度、高靈敏度和高選擇性顯現，具有較強的實用性。

3 結論

以CA和UR為反應原料、EG為反應溶劑，采用溶劑熱法合成了熒光CDs，進一步制備了CDs熒光復合物，并對CDs及其復合物的物理性能進行了表征?？疾炝撕铣杉爸苽錀l件對CDs 及其復合物光學性質的影響，證實了CDs及其復合物具有對激發(fā)光依賴的熒光發(fā)射特性。將CDs 復合物用于潛在手印的高質量顯現中，并從定性和定量兩個層面對手印顯現的對比度、靈敏度和選擇性進行了詳細探討。CDs與手印遺留物質的結合目前大多為非特異性吸附，如果將CDs 表面修飾特定基團（如羧基、胺基等）或者特殊物質（如抗體、適配體等），進而實現潛在手印的靶向性顯現，甚至實現手印特殊遺留物質的定性及定量檢測，這將在很大程度上提升手印顯現方法的檢測性能。后續(xù)將深入開展基于CDs的手印靶向顯現研究。