摘要 蛋白質(zhì)翻譯后修飾是賦予蛋白質(zhì)生理功能的關(guān)鍵機(jī)制，其中可逆的磷酸化修飾在眾多生命活動(dòng)中起著開(kāi)/關(guān)的作用，其異常變化通常與多種重大疾病過(guò)程密切相關(guān)。近年來(lái)，借助蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)和方法，磷酸化蛋白質(zhì)的高通量、高精度定性與定量分析方法也得到了快速發(fā)展。本文綜述了近年來(lái)基于“自下而上”策略的磷酸化蛋白質(zhì)定量與化學(xué)計(jì)量分析方法的研究進(jìn)展，包括磷酸化肽的富集方法、磷酸化肽質(zhì)譜碎裂方式、定量分析方法以及磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量分析方法，并對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)研究的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了討論。

關(guān)鍵詞 磷酸化蛋白質(zhì)；富集方法；質(zhì)譜；定量方法；化學(xué)計(jì)量；評(píng)述

蛋白質(zhì)翻譯后修飾（Post-translational modifications， PTMs）是賦予蛋白質(zhì)生理功能的關(guān)鍵機(jī)制，包括磷酸化、糖基化和泛素化乙?；萚1]。PTMs 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期、發(fā)育與分化、細(xì)胞凋亡以及多種代謝通路調(diào)控中發(fā)揮了極為重要的作用[2-3]。經(jīng)磷酸化修飾的蛋白質(zhì)在催化、調(diào)節(jié)及蛋白相互作用等方面發(fā)揮著重要作用，是很多生命過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控“開(kāi)關(guān)”[4]，許多重大疾?。ㄈ缧难芗膊　┌Y、神經(jīng)退行性疾病等）已被證明與一些蛋白質(zhì)的磷酸化水平變化密切相關(guān)。因此，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)的定量與化學(xué)計(jì)量分析對(duì)理解生命體代謝過(guò)程、疾病發(fā)生機(jī)制以及個(gè)體預(yù)防治療等均具有重要意義[5]。

質(zhì)譜技術(shù)具有高靈敏度、高精密度和高通量等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析。然而，由于磷酸化蛋白質(zhì)的豐度極低，并且易受到生物基質(zhì)中高豐度肽段信號(hào)的干擾，采用質(zhì)譜技術(shù)很難對(duì)磷酸化肽直接進(jìn)行檢測(cè)[6]。因此，對(duì)磷酸化肽進(jìn)行高效、高特異性富集是實(shí)現(xiàn)對(duì)其準(zhǔn)確定性和定量分析的必要條件。針對(duì)上述問(wèn)題，研究者開(kāi)發(fā)了多種針對(duì)磷酸化肽富集和定量分析的方法，以提高磷酸化肽的質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度和定量分析的準(zhǔn)確性，在此基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了不同的質(zhì)譜分析技術(shù)和基于“自下而上”

策略的磷酸化蛋白質(zhì)定量和化學(xué)計(jì)量分析方法。本文介紹了磷酸化肽常用的富集方法、碎裂方式以及定量方法，總結(jié)了磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量學(xué)及其研究方法近年來(lái)的研究進(jìn)展，并討論了其未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。

1 磷酸化肽的分離富集方法

目前，對(duì)于磷酸化蛋白質(zhì)的定量和化學(xué)計(jì)量分析多采用“自下而上”的研究策略，首先將蛋白質(zhì)酶解成肽段，再利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)這些肽段進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定和研究。對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行高效、高特異性的富集分離是實(shí)現(xiàn)高精度定性和定量分析的關(guān)鍵步驟[7]。研究者已基于磷酸化肽段化學(xué)特性開(kāi)發(fā)了不同富集方法，大體可分為金屬離子親和色譜法、離子交換色譜法和免疫親和富集法（作用于pTyr 結(jié)構(gòu)域）等[8]。

固定化金屬親和色譜法（Immobilized metal-ion affinity chromatography， IMAC）[9]和金屬氧化物親和色譜法（Metal oxide affinity chromatography， MOAC）[10]是兩種最普遍的富集pSer、pThr 和pTyr 的親和色譜技術(shù)[11]。IMAC 方法利用螯合作用將金屬陽(yáng)離子（Fe3+、Ga3+和Zr4+等）固定在磁珠、二氧化硅或樹(shù)脂等基質(zhì)上，再通過(guò)與帶負(fù)電荷磷酸基團(tuán)的親和作用實(shí)現(xiàn)對(duì)磷酸化肽的選擇性保留。MOAC 主要是利用兩性金屬氧化物（如TiO2、ZrO2 和Fe3O4 等）[12]和磷酸根基團(tuán)的結(jié)合作用富集磷酸化肽。Jensen 等[13]發(fā)現(xiàn)IMAC 更適宜多磷酸化肽富集而MOAC 更適宜單磷酸化肽富集。Thingholm 等[14]基于這兩個(gè)特點(diǎn)，將這兩種技術(shù)聯(lián)用，有效增加了磷酸化肽鑒定覆蓋率。

離子交換色譜技術(shù)是基于帶負(fù)電荷的磷酸化肽與色譜基質(zhì)上的離子交換基團(tuán)發(fā)生靜電相互作用，主要有強(qiáng)陽(yáng)離子交換法（Strong cation exchange， SCX）和強(qiáng)陰離子交換法（Strong anion exchange， SAX）。Quan 等[15]發(fā)現(xiàn)SCX 主要是吸附一些堿性磷酸化肽段（pIgt;8.0），而SAX 主要是吸附一些酸性磷酸化肽段（pI 介于2.91～6.45 之間）和一些強(qiáng)酸性磷酸化肽段（pIlt;3.0）。免疫親和富集方法基于抗原-抗體反應(yīng)，其特異性更強(qiáng)，但由于抗體開(kāi)發(fā)周期長(zhǎng)、價(jià)格昂貴以及結(jié)果重現(xiàn)性不佳等問(wèn)題，主要用于富集豐度較低的酪氨酸磷酸化肽（pTyr）。SH2 結(jié)構(gòu)域是已知最大的一類(lèi)pTyr 識(shí)別結(jié)構(gòu)域[16]。Bian 等[17]使用SH2 超親體并結(jié)合Ti4+-IMAC，實(shí)現(xiàn)了pTyr 的高特異性富集，從9 個(gè)人類(lèi)細(xì)胞系中鑒定了約20000 個(gè)不同的pTyr和1000 余個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，其中36%的位點(diǎn)為首次鑒定。

N-磷酸化發(fā)生在堿性氨基酸上，形成磷酰胺鍵（P—N）。針對(duì)N-磷酸化肽的富集，已開(kāi)發(fā)出pHis 抗體[18]和pArg 抗體[19]用于實(shí)現(xiàn)pHis 和pArg 肽段的有效富集。此外，基于IMAC 材料親和色譜保留時(shí)間差異的方法也被用于pHis 和pLys 肽段的有效富集[20-21]。為了提高N-磷酸化肽的覆蓋率，研究者又開(kāi)發(fā)了多種富集N-磷酸化肽的方法。如Hu[22]等制備了具有核殼結(jié)構(gòu)的亞二微米硅球，在硅球表面鍵合雙二甲基吡啶胺雙鋅分子，在中性條件下基于該材料的On-tip 富集方法實(shí)現(xiàn)了N-磷酸化肽段的高效、高選擇性和快速富集，結(jié)合液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)，從HeLa 細(xì)胞中鑒定到3384 個(gè)N-磷酸化位點(diǎn)。然而， P—N 磷酰胺鍵具有較高的吉布斯自由能，在富集過(guò)程中易發(fā)生水解，因此，對(duì)于N-磷酸化肽的高效富集和檢測(cè)仍是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的研究工作。

2 磷酸化肽的質(zhì)譜碎裂方式

磷酸化肽離子的二級(jí)碎裂解離和解析是“自下而上”的磷酸化蛋白鑒定與定量分析策略的關(guān)鍵，因此磷酸化肽離子的碎裂方式在分析檢測(cè)磷酸化位點(diǎn)過(guò)程中至關(guān)重要[23]。常用的磷酸化肽離子質(zhì)譜碎裂方式包括碰撞誘導(dǎo)解離（Collision-induced dissociation， CID）、高能碰撞誘導(dǎo)解離（Higher-energy collisionaldissociation， HCD）、電子捕獲解離（Electron capture dissociation， ECD）、電子轉(zhuǎn)移解離（Electrontransfer dissociation， ETD）和紫外光誘導(dǎo)光解離（Ultraviolet photodissociation， UVPD）等。

CID 和HCD 是質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中常用的磷酸化肽碎裂方法，均通過(guò)碰撞裂解肽段生成碎片離子，以獲得關(guān)于肽段的結(jié)構(gòu)和序列信息。CID 是通過(guò)氣相肽離子與惰性氣體（例如氦、氮）碰撞增加肽離子的內(nèi)能，進(jìn)而使肽離子碎裂[24-25]。雖然CID 的效率高，易于實(shí)現(xiàn)，但是CID 碎裂會(huì)造成磷酸化肽母離子及其b 型和y 型離子的非序列性中性丟失，丟失的中性部分可能是磷酸基團(tuán)，影響磷酸化狀態(tài)和結(jié)構(gòu)的分析。HCD 是通過(guò)高能碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生碎片離子，常用于離子阱式質(zhì)譜儀（如Orbitrap），利用多極碰撞單元或碰撞池實(shí)現(xiàn)， HCD 碰撞的能量比CID 強(qiáng)很多，因此會(huì)產(chǎn)生更多的碎片離子[26]，與CID 相比， HCD 碎裂中b 型和y 型離子仍然會(huì)經(jīng)歷中性丟失，盡管中性丟失發(fā)生的頻率或程度較小，但仍會(huì)阻礙鑒定和位點(diǎn)定位[27]。

ECD 和ETD 都是利用電子與磷酸化肽離子的相互作用實(shí)現(xiàn)碎裂。ECD 依賴(lài)于多電荷氣相陽(yáng)離子對(duì)低能電子的捕獲，通過(guò)低能量的自由電子與質(zhì)子化的多電荷蛋白質(zhì)或肽離子相互作用放熱而瞬間發(fā)生碎裂，主要產(chǎn)生由N—C 鍵斷裂形成的c 和z 類(lèi)型碎片離子[28]。Kruger 等[29]發(fā)現(xiàn)CID 能產(chǎn)生更多的碎片離子，而ECD 能解離不同類(lèi)型的化學(xué)鍵，將ECD 與CID 聯(lián)用可提高磷酸化蛋白測(cè)序的效率與準(zhǔn)確度，增加磷酸化肽段鑒定覆蓋率。ETD 利用低電子親和力的陰離子將電子轉(zhuǎn)移到多電荷肽陽(yáng)離子，使其發(fā)生裂解，通過(guò)離子阱可有效地捕獲陰離子試劑和陽(yáng)離子肽[30]。主要產(chǎn)生由N—C 鍵α 斷裂形成的c 和z 類(lèi)型碎片離子，可以有效保留肽段骨架信息和磷酸化修飾信息，同時(shí)克服了ECD 中熱電子傳遞和轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。ECD 和ETD 在碎裂磷酸化肽中主要存在兩個(gè)問(wèn)題：（1）ECD 和ETD 的碎裂效率均取決于母離子的電荷狀態(tài)，對(duì)于三電荷及更高電荷的肽都表現(xiàn)出良好碎裂效率，但對(duì)于最常見(jiàn)的雙電荷磷酸化肽的碎裂效率不足；（2）ECD 和ETD 碎裂頻率較低，需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)母離子解離，相對(duì)于碰撞碎裂的方法需要更長(zhǎng)的循環(huán)時(shí)間，對(duì)鑒定磷酸化肽的數(shù)量有影響[31]。

EThcD 融合了ETD 和高能碰撞解離HCD 兩種技術(shù)，其原理是先將較低能量的電子轉(zhuǎn)移解離，保留更多的修飾位點(diǎn)信息，然后通過(guò)高能碰撞解離產(chǎn)生更多的碎片離子，提供更詳細(xì)的序列信息，目前被廣泛應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)[32-33]。雖然EThcD 鑒定的磷酸化肽數(shù)目少于HCD，但其序列覆蓋率和位點(diǎn)定位的置信度比ETD 和HCD 顯著增加。磷酸化肽段經(jīng)ETD、HCD 和EThcD 碎裂后的MS/MS 譜圖見(jiàn)圖1，經(jīng)ETD 碎裂后磷酸化肽段序列覆蓋率較低，經(jīng)HCD 碎裂產(chǎn)生足夠多的b 離子和y 離子，但伴隨著大量中性損失；經(jīng)EThcD碎裂后的光譜圖提供了足夠的序列覆蓋，且沒(méi)有顯著的修飾中性損失[34]。Penkert等[34]使用含有磷酸化的合成肽驗(yàn)證了EThcD 技術(shù)碎裂雙電荷磷酸化肽的能力，證明EThcD 在雙電荷磷酸肽的碎裂過(guò)程中優(yōu)于ETD，并認(rèn)為EThcD 是鑒定蛋白質(zhì)中不穩(wěn)定的磷酸化新位點(diǎn)的首選方法。

UVPD 是利用紫外光激發(fā)磷酸化肽內(nèi)的鍵，引發(fā)磷酸化肽的離子解離，產(chǎn)生碎片離子，通過(guò)質(zhì)譜對(duì)離子質(zhì)荷比進(jìn)行分析得到磷酸化位點(diǎn)和序列信息[35]。與HCD 相比， UVPD 產(chǎn)生的修飾損失顯著減少（如單、雙、三和四磷酸化肽離子分別減少47%、40%、50%和58%）， b 離子和y 離子損失也較少，并且顯示的離子得分顯著增加，如圖2 所示[36]。相比HCD， UVPD 提供的譜圖信息更多，能顯著減少磷酸化修飾基團(tuán)的損失，并實(shí)現(xiàn)在納秒時(shí)間尺度內(nèi)深度分析磷酸化蛋白質(zhì)組樣品[36]。Robinson 等[37]發(fā)現(xiàn)，與HCD 相比， UVPD 提供了更多類(lèi)型的子離子，并改善了子離子上的磷酸基團(tuán)信息的保留，雖然陰性模式UVPD 在檢測(cè)和測(cè)序高酸性磷酸化肽方面更優(yōu)，但由于陰性模式下的電離效率較低，在進(jìn)行大規(guī)模分析時(shí)可能無(wú)法充分覆蓋整個(gè)樣品的范圍，因此， UVPD 適于與其它質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合（如HCD），充分利用各自的優(yōu)勢(shì)，提高磷酸化蛋白質(zhì)的檢測(cè)和測(cè)序能力，從而獲得更可靠的結(jié)果。不同磷酸化肽碎裂方式的優(yōu)缺點(diǎn)見(jiàn)表1。

3 磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析方法

磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析主要采用“自下而上”的研究策略。相較于蛋白質(zhì)組，磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析更困難，具體表現(xiàn)在：（1）生物樣品中非磷酸化肽含量較多，干擾磷酸化肽的質(zhì)譜信號(hào)；（2）由于磷酸化肽段具有負(fù)電性，在質(zhì)譜正離子模式下較難帶正電荷，離子化效率低；（3）磷酰鍵比肽鍵更易斷裂，增加了磷酸化肽定量的難度[38]。磷酸化肽段的定量分析方法有很多種，根據(jù)所用的質(zhì)譜信息可分為一級(jí)質(zhì)譜定量（MS1）和二級(jí)質(zhì)譜定量（MS2），如圖3 所示[11]。根據(jù)前處理過(guò)程的不同， MS1 定量又可分為非標(biāo)記定量（Label-free）、代謝標(biāo)記定量（Metabolic labeling）和化學(xué)標(biāo)記定量（Chemical labeling）等；MS2定量主要是等重標(biāo)記定量法。

3.1 非標(biāo)記定量方法

Label-free 方法的準(zhǔn)確性主要取決于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)的穩(wěn)定性。Label-free 主要有兩種方法：其一為譜圖計(jì)數(shù)法，對(duì)獲得的目標(biāo)肽段二級(jí)質(zhì)譜圖數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)和比較，以此作為蛋白質(zhì)表達(dá)量差異的定量依據(jù)；其二為離子強(qiáng)度法，利用測(cè)定的多肽母離子的色譜峰面積實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)量的定量分析[39]。與標(biāo)記法相比， Label-free 無(wú)需使用特殊介質(zhì)或昂貴的試劑，避免了在標(biāo)記過(guò)程帶來(lái)的實(shí)驗(yàn)誤差，同時(shí)不需要考慮標(biāo)記效率[40]。但是， Label-free 數(shù)據(jù)處理過(guò)程復(fù)雜、對(duì)儀器性能要求高、不適用于低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)。目前，已有研究者將Label-free 應(yīng)用于重大疾病相關(guān)磷酸化蛋白質(zhì)的定量分析，如Liu 等[41]利用高分辨率質(zhì)譜法和開(kāi)放式搜索方法對(duì)胃癌患者的腫瘤及癌組織的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行Label-free 定量分析，共鑒定了832 個(gè)與胃癌相關(guān)的磷酸化位點(diǎn)，為尋找放射治療耐藥性的重要靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。此外， Label-free 也應(yīng)用在識(shí)別生物標(biāo)志物方面，如De Oliveira 等[42]為識(shí)別胃腺癌患者血清生物標(biāo)志物，使用Label-free 對(duì)胃腺癌患者血清和非癌癥患者血清中的33 種肽進(jìn)行了差異定量分析，其中，19 種肽在胃腺癌患者血清樣品中表達(dá)上調(diào)， 14 種肽表達(dá)下調(diào)。該研究表明，蛋白酶MMP-7 是一種有前景的生物標(biāo)志物。

3.2 代謝標(biāo)記定量方法

代謝標(biāo)記定量方法是通過(guò)細(xì)胞正常代謝使蛋白質(zhì)帶上同位素標(biāo)簽。典型的代謝標(biāo)記定量方法為氨基酸穩(wěn)定同位素標(biāo)記法（Stable isotope labeling by amino acid in cell culture， SILAC）[43]。SILAC 將輕、中或重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸（賴(lài)氨酸和精氨酸）加入細(xì)胞培養(yǎng)基，通過(guò)細(xì)胞的正常代謝，新合成的蛋白會(huì)帶上穩(wěn)定同位素標(biāo)簽，將各類(lèi)型蛋白質(zhì)等量混合后進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)比較一級(jí)質(zhì)譜圖中同位素峰形的面積而進(jìn)行相對(duì)定量分析[44]。SILAC 的主要優(yōu)勢(shì)是在實(shí)驗(yàn)樣品前處理時(shí)進(jìn)行標(biāo)記，從而將平行樣品處理過(guò)程中可能引起的誤差降至最低。但是， SILAC 需要經(jīng)過(guò)多次細(xì)胞分裂才能確保定量分析穩(wěn)定，因此不適合定量分析初代細(xì)胞。由于SILAC 可用于分析細(xì)胞、組織和體液等，因而被廣泛應(yīng)用于表征不同的生物樣本蛋白質(zhì)磷酸化差異[45]。Stepath 等[46]評(píng)估了Label-free、SILAC 和TMT 方法對(duì)磷酸化位點(diǎn)量化方面的性能，發(fā)現(xiàn)SILAC 在磷酸化位點(diǎn)的量化方面表現(xiàn)出較高的精度，是分析細(xì)胞培養(yǎng)模型中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的首選方法。Erber 等[47]利用SILAC 技術(shù)研究海馬神經(jīng)元HT-22 細(xì)胞中急性和慢性缺鐵引起的磷酸化信號(hào)通路的變化，發(fā)現(xiàn)超過(guò)10%的磷酸化位點(diǎn)的相對(duì)豐度變化超過(guò)2 倍，表明缺鐵和缺氧顯著影響神經(jīng)元細(xì)胞中的磷酸化信號(hào)通路。一些SILAC 衍生方法也被應(yīng)用于磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，如脈沖式穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（Pulsed SILAC， pSILAC）[48]、高級(jí)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（Super-SILAC）[49]等。與SILAC 直接分析混合后的輕重標(biāo)記的樣品不同， Pulsed SILAC 技術(shù)是在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中將“輕”、“中”、“重”氨基酸交替加入到培養(yǎng)基中，并培養(yǎng)特定時(shí)間，以跟蹤和定量分析蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化[50]。Wu 等[51]基于Pulsed SILAC 開(kāi)發(fā)出差異同位素標(biāo)記技術(shù)（DeltaSILAC）新策略，將細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行SILAC 標(biāo)記，比較不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白質(zhì)組成的變化，該方法可以直接考察磷酸位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)壽命的影響，進(jìn)一步分析磷酸化位點(diǎn)對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)壽命的影響。

3.3 化學(xué)標(biāo)記定量方法

化學(xué)標(biāo)記定量方法是采用物理和化學(xué)性質(zhì)相似的化學(xué)試劑對(duì)生物樣品進(jìn)行標(biāo)記，再采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對(duì)生物樣品進(jìn)行定量分析。近十年來(lái)，化學(xué)同位素標(biāo)記受到越來(lái)越多的關(guān)注，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物樣品中內(nèi)源性代謝物的準(zhǔn)確定量分析[52]。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)中最常用的化學(xué)標(biāo)記定量方法是穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記定量分析方法（Stable-isotope dimethyl labeling），該方法具有良好的標(biāo)記效率、簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)過(guò)程以及低廉的試劑成本，可用于分析多種類(lèi)型樣本。二甲基標(biāo)記采用甲醛（CH2O）和氰代硼氫化鈉（NaBH3CN）兩種穩(wěn)定的同位素試劑標(biāo)記蛋白質(zhì)/肽的N 端或賴(lài)氨酸的氨基基團(tuán)，使蛋白質(zhì)/肽標(biāo)記上不同的標(biāo)簽[53]，可在每個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)與非標(biāo)記對(duì)應(yīng)物間產(chǎn)生28 個(gè)質(zhì)量單位值差，在每個(gè)對(duì)應(yīng)標(biāo)記同位素上產(chǎn)生4 個(gè)質(zhì)量單位值差，并且不會(huì)產(chǎn)生任何可檢測(cè)的副產(chǎn)物[54]。由于二甲基適用性強(qiáng)，因而被廣泛應(yīng)用于重大疾病的磷酸化組學(xué)定量分析。Liu 等[55]使用穩(wěn)定同位素二甲基標(biāo)記結(jié)合高分辨率質(zhì)譜法，在5-Fu耐藥細(xì)胞系Bel/5-Fu 中共確定了8272 種獨(dú)特的蛋白質(zhì)和22095 個(gè)具有高定位置信性的磷酸化位點(diǎn)，并確定了肝細(xì)胞癌中減弱化學(xué)耐藥性的潛在靶點(diǎn)。

3.4 等重標(biāo)記定量方法

等重標(biāo)記定量方法的原理是基于報(bào)告區(qū)與平衡區(qū)具有相同數(shù)量的總重同位素，當(dāng)報(bào)告離子斷開(kāi)后即可通過(guò)比較樣品之間相對(duì)報(bào)告離子強(qiáng)度對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，包括同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量分析（Isobaric Tags for relative and absolute quantitation， iTRAQ）[56]、串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（Tandem mass tags， TMT）[57]、氘同位素標(biāo)記定量分析（Deuterium （2H） isobaric aminereactive tag， DiART）以及組合等壓質(zhì)量標(biāo)簽（Combinatorial isobaric mass tags， CMTs）等。

3.4.1 同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量分析

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量分析（iTRAQ）的原理是利用多種同位素試劑標(biāo)記蛋白多肽N 末端或賴(lài)氨酸側(cè)鏈基團(tuán)，經(jīng)高精度串聯(lián)質(zhì)譜分析實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組定量分析。目前， iTRAQ 試劑有4-plex 和8-plex，可分別標(biāo)記4 組或8 組樣品，包含與氨基結(jié)合的反應(yīng)基團(tuán)、不同分子量的報(bào)告基團(tuán)以及不同分子量的質(zhì)量平衡基團(tuán)，當(dāng)不同的報(bào)告基團(tuán)分別與對(duì)應(yīng)的平衡基團(tuán)結(jié)合后會(huì)達(dá)到相同的質(zhì)量，但在MS/MS 碎裂后產(chǎn)生獨(dú)特的報(bào)告離子，以此對(duì)多肽進(jìn)行定量分析[58]。iTRAQ 標(biāo)記無(wú)偏倚且掃描范圍廣，可用于絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)上的磷酸化定量分析[59]。為了鑒定參與調(diào)節(jié)MAT-LyLu 細(xì)胞轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，Xu 等[60]分別用TTX-S VGSCs 的特異性抑制劑HNTX-Ⅲ和激活劑JZTX-Ⅰ處理細(xì)胞，然后進(jìn)行了基于iTRAQ 的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，與對(duì)照組相比，在HNTX-Ⅲ和JZTX-Ⅰ處理組中分別鑒定出554 種和1779 種獨(dú)特的磷酸化蛋白，其中， 55 種和36 種磷酸化蛋白質(zhì)被鑒定為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。差異表達(dá)的磷酸化蛋白與前列腺腫瘤的遷移和侵襲顯著相關(guān)，因此有望成為前列腺癌癥精確藥物的潛在生物標(biāo)記物。

3.4.2 串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽

TMT 標(biāo)記具有通量高、準(zhǔn)確性高、對(duì)低豐度蛋白的鑒定效率高等優(yōu)點(diǎn)，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行全蛋白質(zhì)組定量分析，最新的16-Plex TMT 標(biāo)記允許對(duì)多達(dá)16 個(gè)樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組定量分析[61]。基于SPS-MS3-TMT（Synchronous precursor selection-MS3）的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析的主要流程如圖4 所示[25]。TMT 標(biāo)記定量磷酸化肽的方法已被廣泛應(yīng)用。Friedrich 等[62]使用TMT 標(biāo)記，在非小細(xì)胞肺癌、亞型腺癌和鱗狀細(xì)胞癌中定量分析8000 余種蛋白質(zhì)，并確定了超過(guò)1400 個(gè)磷酸位點(diǎn)，為肺癌相關(guān)癌基因、腫瘤抑制因子及信號(hào)通路的蛋白質(zhì)豐度和磷酸位點(diǎn)調(diào)節(jié)提供了相關(guān)定量信息。人參皂苷是一種重要的抗癌活性成分， Zou 等[63]利用TMT 標(biāo)記定量分析人參皂苷治療后乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞中磷酸化蛋白質(zhì)組的變化，在皂苷處理后的MDA-MB-231 細(xì)胞中鑒定出13 個(gè)位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)發(fā)生變化，分析了人參皂苷的抗癌作用機(jī)制。TMT 標(biāo)記反應(yīng)通常在磷酸化肽富集之前，但TMT 標(biāo)記對(duì)肽標(biāo)記后會(huì)改變其化學(xué)性質(zhì)，從而導(dǎo)致TiO2 富集磷酸肽的選擇性發(fā)生變化， Ogata 等[64]設(shè)計(jì)了一種納米級(jí)固相TMT 標(biāo)記反應(yīng)器，在磷酸化肽富集后進(jìn)行TMT 標(biāo)記，通過(guò)優(yōu)化固相TMT 標(biāo)記反應(yīng)器中的pH 值、反相吸附劑和離子成功標(biāo)記磷酸化肽，只需要少量TMT 試劑標(biāo)記磷酸肽即可完成測(cè)定。此研究有助于納米級(jí)TMT 標(biāo)記應(yīng)用于大規(guī)模磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

3.5 微量樣品中磷酸化蛋白質(zhì)的定量策略

磷酸化蛋白質(zhì)定量組學(xué)分析通常采用數(shù)據(jù)依賴(lài)采集模式（Data dependent acquisition， DDA）采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在該模式下，需要有足夠高豐度的磷酸肽離子才能實(shí)現(xiàn)有效的MS1 和MS2 分析。由于生物樣本中磷酸化蛋白質(zhì)豐度低，并且在正離子模式下質(zhì)譜對(duì)磷酸化肽離子化效率較差，目前多需使用300～1000 μg 的提取蛋白才能實(shí)現(xiàn)可重復(fù)性的深度磷蛋白質(zhì)組鑒定[65]。然而，臨床樣品通常只能提供少于10 μg 的提取肽，在如此微量的樣品中實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白定量分析是一項(xiàng)重要且艱巨的任務(wù)。Budnik 等[66]利用等重標(biāo)記法的MS1 信號(hào)強(qiáng)度取決于所有通道混合后的肽段總含量且各樣品的MS2 定量離子信號(hào)互不干擾這一特性，開(kāi)發(fā)了一種高通量SCoPE-MS（Single cell protEomics by mass spectrometry）方法，用于分析單細(xì)胞蛋白質(zhì)組。選擇TMT 標(biāo)簽的其中一個(gè)通道標(biāo)記200 個(gè)細(xì)胞樣品作為“Carrier”以提高M(jìn)S1 信號(hào)強(qiáng)度，其余通道標(biāo)記待測(cè)單細(xì)胞樣品，所有通道混合后進(jìn)行定量分析，在單細(xì)胞水平的蛋白質(zhì)組學(xué)分析實(shí)驗(yàn)中，實(shí)現(xiàn)了對(duì)平均細(xì)胞直徑僅為11 μm 的Jurkat 和U-937 細(xì)胞的蛋白質(zhì)定量分析。上述的“Carrier”策略為微量樣本中磷酸化蛋白質(zhì)組的定量分析提供了新思路[67-69]。Yi 等[70]開(kāi)發(fā)了一種BASIL（Boosting to amplify signal with isobaric labeling）等重標(biāo)記策略，選擇TMT 的一個(gè)通道標(biāo)記“Carrier”樣品，與其它通道混合后進(jìn)行磷酸化肽富集和質(zhì)譜檢測(cè)，該設(shè)計(jì)顯著增強(qiáng)了磷酸化肽的可檢測(cè)性和可識(shí)別性，使可量化磷酸化位點(diǎn)的總數(shù)增加了4 倍以上。但是，在BASIL 策略中，研究樣品和“Carrier”樣品是在混合之后進(jìn)行磷酸化肽富集和檢測(cè)，每次分析都需要進(jìn)行磷酸化肽富集處理，因而每個(gè)通道至少需要10 μg 的研究樣品才能滿(mǎn)足磷酸化肽分析的需求。Kwom 等[71]對(duì)上述策略進(jìn)行了改進(jìn)，使用富集后的高濃度磷酸化肽取代蛋白質(zhì)組樣品作為“Phosphocarrier”樣品，該策略的原理示意圖如圖5 所示。來(lái)自“Phosphocarrier”樣品的高濃度磷酸化肽貢獻(xiàn)更強(qiáng)的MS1 信號(hào)強(qiáng)度（圖5B），研究樣品通道中的磷酸化肽無(wú)需進(jìn)行富集處理且更易被選擇用于MS2 分析（圖5C），因而每個(gè)研究通道僅需低于1 μg 的樣品即可實(shí)現(xiàn)全面的磷酸化蛋白質(zhì)組分析。

酪氨酸磷酸化僅占總O-磷酸化蛋白質(zhì)的0.05%，因此微量樣品中酪氨酸的全面磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析更困難。Chua 等[72]開(kāi)發(fā)了BOOST（Broad-spectrum optimization of selective triggering）策略，利用酪氨酸磷酸酶抑制劑（Pervanadate， PV）處理的細(xì)胞作為T(mén)MT 標(biāo)記的一個(gè)通道，選擇性地增加了含磷酸化酪氨酸肽段的信號(hào)相對(duì)豐度，使磷酸化酪氨酸的定量深度提高6.3 倍，并且從1 mg T 細(xì)胞受體激活的Jurkat T 細(xì)胞中定量分析了2300 多種特異性酪氨酸磷酸化肽。

前處理樣品轉(zhuǎn)移過(guò)程中產(chǎn)生的非特異性表面吸附導(dǎo)致的樣品損失也是微量樣品磷酸化蛋白質(zhì)定量分析面臨的重要問(wèn)題。Tsai 等[73]開(kāi)發(fā)了一種基于串聯(lián)Tip 的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法，該方法利用C18 與IMAC 結(jié)合形成串聯(lián)C18-IMAC-C18，可快速、高效地富集磷酸化肽，并與SOP（Surfactant-assistedone-pot）[74]方法和iBASIL（Improved Boosting to amplify signal with isobaric labeling）[75]方法結(jié)合形成了一個(gè)簡(jiǎn)化的工作流程（圖6），實(shí)現(xiàn)了高靈敏度、高通量的納克級(jí)磷酸化蛋白質(zhì)組定量分析，精確定量分析了100 個(gè)MCF10A 細(xì)胞中約600 條磷酸化肽和200 μm×200 μm×10 μm 的人類(lèi)脾臟組織體素（相當(dāng)于約100 個(gè)細(xì)胞）中約700 條磷酸化肽，為納克級(jí)磷酸化蛋白質(zhì)組分析開(kāi)辟了新途徑。

4 磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量學(xué)

上述富集和定量方法幫助研究者鑒定到大量的磷酸化位點(diǎn)，并在一些研究中確定了磷酸化蛋白質(zhì)的相對(duì)和絕對(duì)豐度。然而，蛋白的功能除了與特定位點(diǎn)的化學(xué)修飾有關(guān)外，還與該位點(diǎn)的修飾程度有關(guān)[76]。磷酸化位點(diǎn)占有率也稱(chēng)磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量，可通過(guò)測(cè)量給定位點(diǎn)的磷酸化形式相對(duì)于蛋白質(zhì)總量的比例實(shí)現(xiàn)（圖7）[76]。磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量是磷酸化的重要屬性，也是確定磷酸化位點(diǎn)生物學(xué)相關(guān)性的重要指標(biāo)，對(duì)磷酸化依賴(lài)性的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)過(guò)程研究具有重要意義[77]。與重大疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量研究對(duì)于深入理解疾病的發(fā)生機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的治療方法具有重要意義[78-79]。

4.1 絕對(duì)定量分析

由于蛋白質(zhì)組的復(fù)雜性，在蛋白質(zhì)組水平上確定特定位點(diǎn)的絕對(duì)磷酸化化學(xué)計(jì)量是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。早期，磷酸化化學(xué)計(jì)量均采用低通量方法，如定量蛋白質(zhì)印跡法[80]。2003 年， Gerber 等[77]首次使用AQUA（Absolute quantification）法測(cè)量人體細(xì)胞周期依賴(lài)性的分離酶上Ser-1126 位點(diǎn)的磷酸化和非磷酸化形式的絕對(duì)量，從16 μg 樣品中定量人類(lèi)分離酶蛋白Ser-1126 位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量為34%。該方法的原理是向待測(cè)樣品中加入已知量的穩(wěn)定同位素標(biāo)記磷酸化肽段和與其對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定同位素標(biāo)記非磷酸化肽段，通過(guò)比較同位素標(biāo)記肽段與目標(biāo)肽段的信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算目標(biāo)肽段的豐度。AQUA 被應(yīng)用于精準(zhǔn)量化不同樣本的磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量，也可用于新的磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量定量方法的評(píng)估。但是， AQUA 在量化磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量時(shí)會(huì)受到肽電離效率的影響，并且AQUA 定量肽合成的成本較高。

4.2 非標(biāo)記定量分析

采用同位素標(biāo)記肽段進(jìn)行定量分析成本較高， Steen 等[81]開(kāi)發(fā)了一種非標(biāo)記定量的方法，用于估計(jì)樣品系列中磷酸化化學(xué)計(jì)量，當(dāng)磷酸化肽及其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽兩種肽的信號(hào)強(qiáng)度變化具有相關(guān)性時(shí)，可通過(guò)監(jiān)測(cè)磷酸化肽及其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽的離子電流強(qiáng)度來(lái)測(cè)量磷酸化化學(xué)計(jì)量，基于此設(shè)計(jì)了相關(guān)計(jì)算方案：首先采用適當(dāng)?shù)臍w一化程序確定檢測(cè)效率，然后通過(guò)監(jiān)測(cè)磷酸化肽及其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽之間的信號(hào)強(qiáng)度比即可得到目標(biāo)磷酸化肽段的化學(xué)計(jì)量。該方法可用于定量分析多重磷酸化肽或蛋白酶切割效率受磷酸化位點(diǎn)影響的肽。該方法的局限是：定量分析的前提條件是目標(biāo)磷酸肽及其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽兩種肽的信號(hào)強(qiáng)度變化必須相關(guān)；蛋白質(zhì)的磷酸化比例必須達(dá)到一定程度（gt;10%），但不完全磷酸化。此外， Bekker-Jense 等[82]將多種實(shí)驗(yàn)條件信息集成到一個(gè)化學(xué)計(jì)量模型中，通過(guò)使用多通路復(fù)用量化磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度，然后在Perseus 插件中實(shí)現(xiàn)線性建模和化學(xué)計(jì)量計(jì)算，最終使用戶(hù)能從Label-free 數(shù)據(jù)中計(jì)算磷酸化占用率。

4.3 磷酸化肽和非磷酸化肽的相對(duì)豐度分析

通過(guò)量化磷酸化肽和非磷酸化肽的相對(duì)豐度對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量分析，通常是先量化樣品中的磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)強(qiáng)度，再結(jié)合比例關(guān)系進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算，進(jìn)而得到位點(diǎn)的磷酸化水平。Olsen 等[83]假設(shè)磷酸化肽段與其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽段比例達(dá)到1，從SILAC 輕標(biāo)和SILAC 重標(biāo)兩種狀態(tài)下計(jì)算磷酸化位點(diǎn)的絕對(duì)化學(xué)計(jì)量，具體計(jì)算公式如圖8 所示，其中， x 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重磷酸化肽比例， y 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重非磷酸化肽比例， z 表示SILAC 標(biāo)記的輕、重蛋白質(zhì)比例，通過(guò)x、y、z 的SILAC 標(biāo)記比率信息計(jì)算位點(diǎn)的磷酸化化學(xué)計(jì)量。采用該方法實(shí)現(xiàn)了磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量的大規(guī)模研究，并獲得了人類(lèi)培養(yǎng)細(xì)胞系HeLa S3 細(xì)胞周期中蛋白質(zhì)和磷酸化位點(diǎn)動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)視圖。此外， Hogrebe 等[84]開(kāi)發(fā)了一種基于三維多元回歸模型（3DMM）的方法，使用量化方法中的磷酸化肽、非磷酸化肽和相應(yīng)的蛋白質(zhì)強(qiáng)度，結(jié)合肽的數(shù)量與肽的強(qiáng)度比例關(guān)系，在不同條件下對(duì)這3 種強(qiáng)度進(jìn)行多元回歸擬合，計(jì)算磷酸化程度。

近些年，已有大量通過(guò)磷酸酶去除磷酸化再結(jié)合同位素標(biāo)記技術(shù)來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)的磷酸化位點(diǎn)的研究[85-86]。Wu 等[87]將蛋白質(zhì)裂解產(chǎn)物的兩個(gè)相同等分試樣分別進(jìn)行虛擬處理以及磷酸酶處理，然后用穩(wěn)定同位素進(jìn)行差異化學(xué)標(biāo)記?；旌虾?，將獲得的肽段序列與已知位點(diǎn)的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行對(duì)比，基于重疊的非磷酸化形式的比率計(jì)算化學(xué)計(jì)量，最終確定了對(duì)數(shù)中期的釀酒酵母的5033 個(gè)磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量。Chen 等[88]設(shè)計(jì)了一種二甲基標(biāo)記結(jié)合磷酸酶去磷酸化的方法定量分析蛋白質(zhì)中特定位點(diǎn)磷酸化水平，測(cè)得牛奶中α-S1 酪蛋白Ser130 位點(diǎn)和α-S2 酪蛋白Ser158 位點(diǎn)的磷酸化程度分別為97.2%和97.3%，這是首次在肽段水平上報(bào)道α-酪蛋白位點(diǎn)的特異性磷酸化程度。隨后，研究者采用該方法測(cè)得未經(jīng)過(guò)氧化叔丁醇溶液（Tert-butyl hydroperoxide， t-BHP）處理的Hsp27 上Ser82 的磷酸化程度為10.76%，經(jīng)t-BHP 處理的Hsp27 上Ser82 的磷酸化程度為37.46%，表明該方法在分析蛋白質(zhì)磷酸化動(dòng)態(tài)變化方面具有可行性。

上述磷酸酶處理和同位素標(biāo)記的方法具有工作流程簡(jiǎn)單、數(shù)據(jù)處理易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，但僅適用于定量蛋白樣品上有限數(shù)量位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量。在通過(guò)量化修飾肽和未修飾肽的相對(duì)豐度來(lái)進(jìn)行化學(xué)計(jì)量測(cè)定的方法中，確保觀察到的肽豐度變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義至關(guān)重要。為了使肽豐度變化更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， Lim 等[89]設(shè)計(jì)了貝葉斯模型（The Bayesian models），將化學(xué)計(jì)量建模為β 分布，可解決基于磷酸酶的磷酸化化學(xué)計(jì)量實(shí)驗(yàn)中的負(fù)化學(xué)計(jì)量的問(wèn)題。

4.4 同位素標(biāo)記非磷酸化肽段

使用磷酸化標(biāo)準(zhǔn)肽段定量磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量會(huì)面臨一些問(wèn)題，其中合成定量用的磷酸化肽段中含有其對(duì)應(yīng)的非磷酸化肽段，同時(shí)，磷酸化肽的低靈敏度也給質(zhì)譜監(jiān)測(cè)帶來(lái)挑戰(zhàn)。為規(guī)避上述問(wèn)題，可通過(guò)磷酸酶處理或表達(dá)出無(wú)磷酸化修飾的QconCAT 蛋白，再通過(guò)歸一化計(jì)算提高定量分析的準(zhǔn)確性，最后只需利用同位素標(biāo)記的非磷酸化肽段即可對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行化學(xué)計(jì)量定量分析[90]。除此之外，Dominik 等[91]開(kāi)發(fā)了一種基于磷酸酶處理和同位素標(biāo)記用于測(cè)定復(fù)雜生物樣品中的磷酸化化學(xué)計(jì)量的定量方法（Phosphatase-based phosphopeptide quantitation， PPQ）。該方法在酶切后加入同位素標(biāo)記的非磷酸化肽段，然后將樣品分為未處理和磷酸酶處理兩部分，比較兩部分樣品的峰面積比即可確定磷酸化化學(xué)計(jì)量，因此，只需比較非磷酸化肽段的相對(duì)或絕對(duì)豐度即可確定單個(gè)肽的磷酸化化學(xué)計(jì)量。

4.5 磷酸化化學(xué)計(jì)量分析在激酶研究中的應(yīng)用

激酶能夠轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)到特定的底物分子上，從而引發(fā)磷酸化修飾。磷酸化化學(xué)計(jì)量對(duì)于揭示激酶的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)具有重要意義。激酶介導(dǎo)的磷酸化化學(xué)計(jì)量在細(xì)胞調(diào)控和疾病發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。不同激酶對(duì)磷酸化位點(diǎn)的化學(xué)計(jì)量具有特異性，這種特異性可以調(diào)節(jié)底物的功能和細(xì)胞過(guò)程。此外，異常的磷酸化化學(xué)計(jì)量與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和心血管疾病等。為了探究激酶對(duì)磷酸化的影響， Karayel 等[92]針對(duì)帕金森病患者中性粒細(xì)胞中Rab10-Thr73磷酸化水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)帕金森病患者的富亮氨酸重復(fù)激酶2（Leucine-rich repeat kinase 2， LRRK2）突變會(huì)增加Rab10-Thr73 磷酸化水平。Tsai 等[93]采用兩次富集結(jié)合磷酸酶處理的方法探究了不同激酶作用位點(diǎn)的磷酸化化學(xué)計(jì)量，在使用CK2、MAPK 和EGFR 作為肺癌癥細(xì)胞中的基序靶向激酶的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量了1000 余個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括642 個(gè)CK2 靶向位點(diǎn)、940 個(gè)MAPK 靶向位點(diǎn)和366 個(gè)EGFR靶向位點(diǎn)，然后對(duì)不同激酶作用的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)CK2 有30%的磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量超過(guò)70%，而MAPK 和EGFR 只有少于15%的磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量大于70%，為激酶與磷酸化化學(xué)計(jì)量研究提供了新的研究思路。

5 總結(jié)和展望

磷酸化蛋白質(zhì)參與多種生理和病理過(guò)程，具有重要的研究意義。不同類(lèi)型的磷酸化肽段需采用不同的富集方法，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展也為磷酸化蛋白質(zhì)研究提供了可靠的技術(shù)支撐。在此基礎(chǔ)上的磷酸化位點(diǎn)化學(xué)計(jì)量學(xué)研究不僅對(duì)探究磷酸化位點(diǎn)和占有率具有生物學(xué)意義，也可用于分析磷酸化位點(diǎn)上游激酶的靶向位點(diǎn)和作用機(jī)制，這些成果可應(yīng)用于重大疾病發(fā)病機(jī)制的探索和活性激酶抑制劑的臨床研究，評(píng)估激酶抑制劑的靶向結(jié)合、劑量和療效等，在生物醫(yī)學(xué)上具有較大的應(yīng)用潛力。此外，對(duì)微量樣品進(jìn)行全面的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析仍然是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)，也是目前的研究熱點(diǎn)，研究者采用不同的解決方案提高微量樣品檢測(cè)效率。磷酸化蛋白質(zhì)的定量與化學(xué)計(jì)量分析方法在深入理解細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、生物學(xué)過(guò)程和疾病機(jī)制方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，未來(lái)的研究方向應(yīng)主要集中在提高分析方法的精確度、靈敏度和通量，開(kāi)發(fā)治療重大疾病的靶向磷酸化位點(diǎn)的藥物以及加速其在生物醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

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