摘要：目的 探究腎陽(yáng)虛證患者與平和質(zhì)人群的尿液代謝物水平差異，分析激素變化情況，為腎陽(yáng)虛證探索出有價(jià)值的生物標(biāo)志物。方法 共納入8例腎陽(yáng)虛患者與4例平和質(zhì)人群的尿液進(jìn)行UPLC代謝組學(xué)分析，通過(guò)PCA、PLS-DA分析，篩選出有顯著差異的代謝物并結(jié)合代謝通路進(jìn)行分析。結(jié)果 與對(duì)照組相比較，試驗(yàn)組尿液中11-β-羥基雄酮-3-葡萄糖醛酸、三羥基孕酮、18-羥皮質(zhì)醇、醛固酮18-葡糖苷酸、4-羥基雄烯二酮葡糖苷酸等激素代謝物顯著上升，硫酸雄酮、本膽烷醇酮、16-脫氫黃體酮、5b-孕二醇、氟氫可的松、雌酮、5a-二氫睪酮等顯著下降。結(jié)論 本研究進(jìn)一步證明了腎陽(yáng)虛證會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多種激素代謝紊亂，降低氨基酸、脂肪酸等能量代謝，并與細(xì)胞內(nèi)吞、晝夜節(jié)律夾帶等通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎陽(yáng)虛證；代謝組學(xué)；代謝通路；生物標(biāo)志物

中圖分類(lèi)號(hào)：R277.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2024）08-0068-06

腎陽(yáng)虛屬于中醫(yī)理論體系中的重要證候之一，是一種虛寒證候，其病因主要為腎陽(yáng)虛衰、腎臟溫煦、氣化功能下降等。由稟賦不足、年老體虛、耗損過(guò)度、補(bǔ)養(yǎng)不足及氣機(jī)阻滯所引起。臨床表現(xiàn)多見(jiàn)面色蒼白、形寒肢冷、腰膝酸痛、下肢軟弱無(wú)力、小便不利或小便頻數(shù)、少腹拘急。對(duì)于腎陽(yáng)虛證相關(guān)疾病的治療已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。在以往的代謝通路研究中發(fā)現(xiàn)，該證候主要可能是“下丘腦—垂體—腎上腺皮質(zhì)軸、甲狀腺軸、性腺軸和胸腺軸”等環(huán)節(jié)發(fā)生了不同程度的紊亂所造成的［1］。

對(duì)于腎陽(yáng)虛證相關(guān)疾病的病程中，人體各類(lèi)生物標(biāo)志物，特別是激素類(lèi)的研究已經(jīng)日漸深入，例如杜嫦燕等［2］利用經(jīng)方加減治療脾腎陽(yáng)虛型卵巢早衰并探究相關(guān)激素水平變化，周歆等［3］通過(guò)對(duì)大量文獻(xiàn)的二次研究發(fā)現(xiàn)“補(bǔ)腎陽(yáng)”中醫(yī)療法治療多種腎陽(yáng)虛證疾病都與激素調(diào)節(jié)密切相關(guān)，但以證候分類(lèi)進(jìn)行激素水平變化特點(diǎn)的研究尚有待探索，本研究以腎陽(yáng)虛患者與平和體質(zhì)成人的尿液為樣本，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用的代謝組學(xué)研究，靶向分離與鑒定樣本中各種激素類(lèi)物質(zhì)，篩選出具有意義的生物標(biāo)志物，從激素代謝的角度進(jìn)一步揭示腎陽(yáng)虛證的證候變化特點(diǎn)與人體激素的關(guān)系，為腎陽(yáng)虛證相關(guān)疾病的診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象的選擇

1.1.1 研究對(duì)象 試驗(yàn)組8例腎陽(yáng)虛患者及對(duì)照組4例平和質(zhì)人群，均自愿簽署知情同意書(shū)，并符合方案規(guī)定的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)方案獲昆明市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2002年國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的中的“腎陽(yáng)虛證”診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。主癥：畏寒肢冷，神疲乏力，腰膝酸軟，夜尿頻多，性欲減退。次癥：動(dòng)則氣促，下肢浮腫，發(fā)槁齒搖。具備以上主癥3項(xiàng)、次癥1項(xiàng)，即可診斷腎陽(yáng)虛證。

1.1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 患者年齡在35～65歲之間；符合中醫(yī)腎陽(yáng)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)者及平和體質(zhì)者；自愿簽署知情同意書(shū)。

1.1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 患者正處于急性感染期；精神上或法律上的殘疾患者；哺乳、妊娠或正準(zhǔn)備妊娠的婦女；過(guò)敏體質(zhì)或?qū)Χ喾N藥物有過(guò)敏史者；30天內(nèi)參加過(guò)其他藥物臨床試驗(yàn)的患者；腋下體溫>37.5℃；嚴(yán)重的心腦血管疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、造血系統(tǒng)疾病、先天性心臟病患者等。

1.2 一般資料 試驗(yàn)組和對(duì)照組的患者均來(lái)自于本院的門(mén)診患者，男女均有。平和質(zhì)組平均年齡（47.20±13.40）歲；腎陽(yáng)虛證組年齡（48.60±11.30）歲，2組試驗(yàn)對(duì)象年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性（P>0.05）。

1.3 研究方法

1.3.1 主要儀器及試劑 儀器：液相色譜：2777C UPLC system（Waters，UK）；質(zhì)譜儀：Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）。

試劑：HPLC乙腈（Thermo，USA），乙酸銨（Sigma，USA），甲酸（Sigma，USA），甲酸銨（Sigma，USA）。

1.3.2 樣本收集及處理 取-80 ℃低溫保存的尿液樣品，復(fù)溫后用從每個(gè)樣本中取100 μL混合作為QC樣本，根據(jù)樣本數(shù)目確定QC數(shù)目（樣本數(shù)目的6%為樣本制備插入的QC數(shù)目，至少為6個(gè)，取整數(shù)后將QC分裝）。取數(shù)個(gè)新的EP管放置于EP管架上，標(biāo)注標(biāo)簽，按上機(jī)順序?qū)颖九判?，并隨機(jī)插入qc樣本；將每個(gè)樣品（含QC）各取100 μL左右加入相應(yīng)新EP管中，加入甲醇300 μL，每個(gè)EP管單獨(dú)渦旋30 s混勻；靜置1 min，確保體積不均的EP管，如有需重新處理該樣品；置于-20 ℃冰箱2 h；25000 g×4 ℃離心 10 min后取350μL上清置于新的EP管中，25000 g×4 ℃再次離心10 min；將EP管從離心機(jī)中取出，按樣品編碼順序?qū)悠贩胖迷陔x心管架上；每個(gè)樣品取25 μL置于新的96孔板中，加入225 μL 50%甲醇進(jìn)行稀釋；剩余樣品交于按條件妥善保存。

1.3.3 液相色譜質(zhì)譜檢測(cè) （1）液相參數(shù)：采用ACQUITY UPLC HSS T3 column（100 mm×2.1 mm，1.8 μM，Waters，UK）進(jìn)行色譜分離，色譜柱柱溫為40 ℃，流速為0.5 mL·min-1，其中A流動(dòng)相為水和0.1%甲酸，B流動(dòng)相為乙腈和0.1%甲酸。對(duì)代謝物采用以下梯度進(jìn)行洗脫：0～1 min，99 %流動(dòng)相A；1～3 min，1-15%流動(dòng)相B；3～6 min，15%～50%流動(dòng)相B；6-9 min則為50%～95%流動(dòng)相B；9-10 min則為95%流動(dòng)相B；10.1-12 min則為99%流動(dòng)相A。每個(gè)樣本的上樣體積為10 μL。（2）質(zhì)譜參數(shù)：對(duì)從色譜柱上洗脫下來(lái)的小分子，利用高分辨串聯(lián)質(zhì)譜Xevo G2-XS QTOF（Waters，UK）分別進(jìn)行正負(fù)離子模式采集。正離子模式下，毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為2 kV和40 V。負(fù)離子模式下，毛細(xì)管電壓及錐孔電壓分別為2 kV和40 V。采用MSE模式進(jìn)行centroid數(shù)據(jù)采集，一級(jí)掃描范圍為50～1200 Da，掃描時(shí)間為0.2 s，對(duì)所有母離子按照20到40 eV的能量進(jìn)行碎裂，采集所有的碎片信息，掃描時(shí)間為0.2 s。在數(shù)據(jù)采集過(guò)程中，對(duì)LE信號(hào)每3 s進(jìn)行實(shí)時(shí)質(zhì)量校正。同時(shí)，每隔10個(gè)樣本進(jìn)行一次混合后質(zhì)控樣本的采集，用于評(píng)估在樣本采集過(guò)程中儀器狀態(tài)的穩(wěn)定性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控 QC樣本在樣本檢測(cè)前用于平衡“色譜-質(zhì)譜”系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)QC樣本的總離子流色譜圖（TIC）進(jìn)行重疊以在樣本檢測(cè)過(guò)程中用于評(píng)價(jià)質(zhì)譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，對(duì)QC樣本進(jìn)行主成分分析驗(yàn)證數(shù)據(jù)質(zhì)量以及試驗(yàn)的重復(fù)性。本研究中大部分離子的保留時(shí)間與各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度基本重疊，表示生物學(xué)重復(fù)之間差異較小，取樣精確，儀器誤差小（圖1）。

1.4.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)及數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜下機(jī)原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件Progenesis QI（version 2.2）進(jìn)行峰提取，獲得代謝物相關(guān)的質(zhì)荷比、保留時(shí)間和離子面積等信息。采用QC-RSC（quality control–based robust LOESS signal correction）方法校正，將所有QC樣品中相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）>30 %的離子舍棄（RSD>30 %的離子在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中波動(dòng)較大，不納入下游統(tǒng)計(jì)學(xué)分析），最后進(jìn)行分析。通過(guò)PCA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維分析，以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組間的差異性及組內(nèi)的重復(fù)性。在二維圖中，取前兩個(gè)主成分 PC1、PC2來(lái)表示樣本，空間分布差異越小表示兩個(gè)樣本的數(shù)據(jù)越接近。在本研究中，在做PLS-DA模型之前進(jìn)行了log2轉(zhuǎn)換及采用Pareto scaling的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行比例調(diào)整（scaling）。最后對(duì)差異代謝進(jìn)行分析篩選，得到各組中排名靠前的差異代謝物，通過(guò)火山圖（Volcano plot）直觀顯示差異代謝物的整體分布情況。

本研究中采用t檢驗(yàn)和變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C analysis）。在統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程中，進(jìn)一步對(duì)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)產(chǎn)生的p-value進(jìn)行FDR校正得到q-value。最終結(jié)果以火山圖形式呈現(xiàn)差異倍數(shù)（Fold change）和q-value兩個(gè)指標(biāo)，通常以差異倍數(shù)≥1.2或≤0.8333，q-value值小于0.05作為篩選差異代謝物的條件。

1.4.3 代謝通路功能分析 在生物體內(nèi)，不同代謝物會(huì)形成一個(gè)相互作用網(wǎng)絡(luò)，基于Pathway的分析有助于更進(jìn)一步了解其參與的通路。KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 是有關(guān) Pathway的主要公共數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò) Pathway分析能確定代謝物參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。計(jì)算差異代謝物在不同 Pathway 的分布情況，可以對(duì)差異代謝物進(jìn)行歸類(lèi)，尋找差異代謝物與通路改變的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析（PCA） 本研究中PCA分析前對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了log2轉(zhuǎn)換和比例調(diào)整（scaling），采用Pareto調(diào)整法（Pareto scaling），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一組內(nèi)各樣本在一定范圍內(nèi)相對(duì)集中，重復(fù)性較好（圖2）。PCA分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)變異影響最大的因子有45.04 %的貢獻(xiàn)率（PC1），第二大的因子有8.89 %的貢獻(xiàn)率（PC2）。

2.2 偏最小二乘法判別分析（PLS-DA） 在經(jīng)過(guò)PCA的探索分析得到判別模型，以識(shí)別關(guān)鍵的生物標(biāo)志物或樣本差異；最后通過(guò)模型評(píng)估和結(jié)果可視化，確定模型的有效性和結(jié)果的清晰度。結(jié)果顯示對(duì)照組與試驗(yàn)組之間分離情況更加完善，可以篩選出2組之間的差異代謝物（圖3）。

2.3 差異代謝物 通過(guò)比較2組的代謝譜數(shù)據(jù)差異，結(jié)果顯示（圖4），2組間有大量代謝物存在差異（P<0.05），其中部分代謝物差異顯著（P<0.01）并且差異倍數(shù)較大，試驗(yàn)組較對(duì)照組相比，代謝物上調(diào)的較多。

以RSD ≤ 30 %為條件篩選2組間代謝存在顯著差異（P<0.01）的離子共有4308種（表1），同時(shí)篩選出與激素相關(guān)的差異代謝物13種，[HJ2.6mm]腎陽(yáng)虛證患者尿液中的11-β-羥基雄酮-3-葡萄糖醛酸、三羥基孕（甾）酮、18-羥皮質(zhì)醇、2-甲氧基-雌二醇-17b-3-葡萄糖醛酸、醛固酮18-葡糖苷酸、4-羥基雄烯二酮葡糖苷酸等激素代謝物或者其中間產(chǎn)物顯著上升，而硫酸雄酮、本膽烷醇酮、16-脫氫黃體酮、5b-孕二醇、氟氫可的松、雌酮、5a-二氫睪酮等顯著下降（表2），篩選條件為1）VIP ≥ 1；2）fold change ≥1.2或者≤ 0.8333；3）q-value<0.05。

2.4 代謝通路分析結(jié)果 將篩選出的代謝物與數(shù)據(jù)庫(kù)中的代謝通路進(jìn)行比對(duì)，計(jì)算通路在數(shù)據(jù)集中的富集程度，以評(píng)估通路活性狀態(tài)。富集結(jié)果顯示，腎陽(yáng)虛組與平和組相比共有188個(gè)相關(guān)的代謝途徑參與了差異代謝物的調(diào)控，主要集中在細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)送物質(zhì)的通路以及對(duì)氨基酸、脂肪酸、藥物代謝酶等多種物質(zhì)的代謝通路（表3，Top10）。

3 討論

腎為先天之本，藏精生髓，腎所藏的先天之精來(lái)源于父母稟賦，是生命的本源，其功能決定了人體生長(zhǎng)，臟腑盛衰的變化。由于各種生理、病理原因?qū)е戮珰獠蛔?，腎陽(yáng)虛衰從而導(dǎo)致激素代謝異常，影響機(jī)體相關(guān)能量代謝通路與正常的生理功能，表現(xiàn)出畏寒喜暖、腰膝酸軟，腎陽(yáng)不足難以固攝腎精，精氣外泄則夜尿頻多、小便清長(zhǎng)，對(duì)于生殖系統(tǒng)的影響表現(xiàn)為陽(yáng)痿早泄、性欲低下，甚至不孕不育，并伴有神疲乏力、手足厥冷、精神萎靡、頭暈?zāi)垦５劝Y狀［5-6］。

通過(guò)對(duì)腎陽(yáng)虛體質(zhì)和平和體質(zhì)人群尿液的代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)2組間有大量的代謝物存在差異，富集到不同功能的通路?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，腎陽(yáng)虛證與“下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸”功能紊亂相關(guān)，通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中樞調(diào)節(jié)最后作用到促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和促腎上腺皮質(zhì)激素等腎上腺相關(guān)激素以及糖皮質(zhì)激素的釋放與代謝［7］，在本研究中同樣觀察到在腎陽(yáng)虛證患者的尿液代謝物中，氟氫可的松的含量顯著下降，18-羥皮質(zhì)醇含量升高，提示腎陽(yáng)虛證患者的腎上腺皮質(zhì)功能出現(xiàn)異常。由于腎上腺皮質(zhì)功能受損導(dǎo)致激素代謝與調(diào)節(jié)發(fā)生紊亂從而表現(xiàn)出腎陽(yáng)虛證的諸多癥狀，同時(shí)由于生理或者病理的可的松類(lèi)激素分泌過(guò)度也同樣容易導(dǎo)致腎陽(yáng)虛證，并且在能量代謝、脂肪酸、氨基酸等代謝功能上出現(xiàn)異常［8］，當(dāng)機(jī)體的嘌呤代謝、脂肪酸生物合成相關(guān)通路受到影響，身體代謝效率低下后，從而導(dǎo)致線粒體能量代謝障礙，由此出現(xiàn)乏力、畏寒、肢冷和精神萎靡等腎陽(yáng)虛證的典型癥狀［9］，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明，蒽醌類(lèi)、糖類(lèi)以及氨基酸等物質(zhì)對(duì)改善腎陽(yáng)虛證有顯著作用，其機(jī)制可能與改善能量代謝和逆轉(zhuǎn)氨基酸代謝紊亂，調(diào)控“下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸”生理病理和功能狀態(tài)相關(guān)［10］。

綜上，根據(jù)本研究中試驗(yàn)組和對(duì)照組的激素代謝變化，以及相關(guān)代謝物的不同，在腎陽(yáng)虛證的診斷和治療方面，建議可以借助代謝組學(xué)的方法，從氨基酸、脂肪酸等能量代謝通路方面入手，將機(jī)體微觀水平的變化與中醫(yī)證候的整體觀念相結(jié)合，通過(guò)激素代謝水平的異常與癥狀表現(xiàn)，對(duì)腎陽(yáng)虛證的病理變化過(guò)程進(jìn)行綜合闡釋，這樣不僅遵循中醫(yī)溫腎補(bǔ)陽(yáng)的治法治則，同時(shí)也可以從相關(guān)的代謝通路出發(fā)，并加以激素調(diào)節(jié)等方式，對(duì)腎陽(yáng)虛證進(jìn)行全面客觀的診治。

參考文獻(xiàn)：

［1］鄒海淼，辛雪，孫偉，等.腎陽(yáng)虛生化指標(biāo)的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，15（30）：5989-5993.

［2］杜嫦燕，關(guān)鳳儀，羅寶玲.加減溫經(jīng)湯對(duì)脾腎陽(yáng)虛型卵巢早衰相關(guān)激素水平及預(yù)后的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2023，41（8）：37-40.

［3］周歆，馬賢德，新昕，等.“補(bǔ)腎陽(yáng)”中醫(yī)療法對(duì)內(nèi)分泌患者血清中激素調(diào)節(jié)作用的Meta分析［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2020，47（7）：6-13.

［4］鄭筱萸.中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2002，385-388.

［5］孫明月，訾明杰，秦義，等.基于混合方法的《腎陽(yáng)虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)》制定［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2022，37（1）：284-288.

［6］王舒月，趙宗江，張新雪，等.基于因子分析的558例腎陽(yáng)虛證人群的證候量化分析研究［J］.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2023，25（7）：2304-2312.

［7］周璇，程立紅，閔友江.糖皮質(zhì)激素受體、鹽皮質(zhì)激素受體對(duì)腎陽(yáng)虛證下丘腦-垂體-腎上腺軸影響研究概況［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2019，15（7）：201-204.

［8］陶秀梅.“腎陽(yáng)虛”模型及證候的代謝組學(xué)研究［D］.上海：上海交通大學(xué)，2009.

［9］何林熹.中醫(yī)體質(zhì)分類(lèi)辨識(shí)及腎陽(yáng)虛體質(zhì)線粒體基因SNP研究［D］.成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2020.

［10］王亞非，李運(yùn)海，邢姝琴，等.巴戟天有效成分及其治療腎陽(yáng)虛證的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2016，31（12）：5165-5167.