摘要：【目的】對(duì)鐵杉屬（Tsuga）現(xiàn)存所有10種植物花粉形態(tài)特征進(jìn)行觀察比較，結(jié)合花粉化石分析鐵杉屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及花粉形態(tài)的演化過程?！痉椒ā客ㄟ^掃描電子顯微鏡（SEM）觀察鐵杉屬的花粉形態(tài)特征，并利用7個(gè)定量指標(biāo)和1個(gè)定性指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析（HCA）?！窘Y(jié)果】鐵杉屬花粉為N1P3C1型花粉，遠(yuǎn)極面具薄壁區(qū)，赤道軸長度為21.20～58.00 μm，多無氣囊，稀有氣囊；花粉粒表面多疣狀，稀微疣狀，表面有棘突或無。系統(tǒng)聚類分析顯示鐵杉屬花粉可以分類為3類：①有氣囊，無棘突類：山地鐵杉（T. mertensiana）與長苞鐵杉（Nothotsuga longibracteata）；②無氣囊，無棘突類：卡羅萊納鐵杉（T. caroliniana）、加拿大鐵杉（T. canadensis）與化石種2 （T. sp.2）；③無氣囊，有棘突類： 異葉鐵杉（T. heterophylla）、郁林鐵杉（T. ulleungensis）、米鐵杉（T. diversifolia）、麗江鐵杉（T. forrestii）、日本鐵杉（T. sieboldii）、云南鐵杉（T. dumosa）、鐵杉（T. chinensis）、化石種1（T. sp.1 ）和化石種3 （T. sp.3 ）?！窘Y(jié)論】鐵杉屬花粉是從有氣囊向無氣囊，無棘突向有棘突演化的，且花粉特征與分布地有密切關(guān)系，同一地區(qū)分布的花粉形態(tài)相似?；诨ǚ坌螒B(tài)的聚類分析結(jié)果與分子系統(tǒng)發(fā)育樹大體符合，可以通過花粉形態(tài)對(duì)鐵杉屬植物及化石進(jìn)行物種鑒定，并為其系統(tǒng)發(fā)育研究提供參考。

關(guān)鍵詞：鐵杉屬；花粉形態(tài)；掃描電鏡；聚類分析

中圖分類號(hào)：Q944.5"""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

文章編號(hào)：1000-2006（2024）04-0037-09

Phylogenetic relationship and evolutionary patterns of Tsuga pollen morphology： a cluster analysis-based study

CHEN Zhihan1，3， SHANG Xin1，2， XIE Zin2， ZHANG Xin1*

（1. College of Forestry， Northwest Aamp;F University， Yangling" 712100，China; 2. Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences， Beijing" 100093，" China; 3. Kunming Institute of Botany， Chinese Academy of Sciences，" Kunming" 650201， China" ）

Abstract： 【Objective】 To analyze the phylogenetic relationship and the evolution pattern of pollen morphology in Tsuga， pollen morphology characteristics of all 10 extant species of Tsuga were observed and compared in combination with pollen fossils.【Methods】 Pollen morphology characteristics of Tsuga were observed by scanning electron microscopy （SEM）， and hierarchical cluster analysis （HCA） was performed using seven quantitative indicators and one qualitative indicator. 【Results】 Pollen of Tsuga belongs to the N1P3C1 type， leptoma on the distal face， the equatorial length ranging from 43.74 to 95.30 μm， mostly without sacci and rare saccate， surface mostly warty and sparsely micro-warty， surface with spines or absent. According to the hierarchical cluster analysis， Tsuga can be divided into three categories： ①T. mertensiana and Nothotsuga longibracteata; ②T. caroliniana and T. canadensis; ③T. heterophylla， T. ulleungensis， T. diversifolia， T. forrestii， T. sieboldii， T. dumosa and T. chinensis. 【Conclusion】 Tsuga pollen evolved from having sacci to without sacci， from no spines to having spines. The pollen characteristics of Tsuga had a close relationship with the distribution place， which means that pollen distributed in the same region were similar. The clustering analysis results based on pollen morphology is largely consistent with the molecular phylogenetic tree， which can be used to identify extant species and fossils of Tsuga and provide reference for Tsuga phylogenetic studies.

【Objective】 To analyze the phylogenetic relationships and evolutional patterns of pollen morphology in Tsuga， we observed and compared the pollen characteristics of all 10 extant species of Tsuga along with pollen fossils. 【Method】 Pollen morphology was examined using scanning electron microscopy （SEM）， and hierarchical cluster analysis （HCA） was conducted using seven quantitative indicators and one qualitative indicator. 【Result】 Tsuga pollens typically exhibits characteristics of the N1P3C1 type， with a leptoma on the distal face. The equatorial length ranges from 21.20 to 58.00 μm， predominantly lacking sacci but occasionally with echinae saccate forms. The pollen surface is typically warty or sparsely micro-warty，"" with spines or without. According to the hierarchical cluster analysis， Tsuga could be divided into three categories： ①saccate but lacking echinae type： T. mertensiana and Nothotsuga longibracteata; ②lacking sacci and echinae type： T. caroliniana， T. canadensis and pollen fossil T. sp.2; ③lacking sacci but echinate type： T. heterophylla， T. ulleungensis， T. diversifolia， T. forrestii， T. sieboldii， T. dumosa， T. chinensis and pollen fossil T. sp.1， T. sp.3.【Conclusion】 Pollen morphology in Tsuga has evolved from saccate to non-saccate forms， and from lacking spines to possessing spines. These pollen characteristics are closely related to geographic distribution， indicating similarity among pollen from the same regions. The clustering analysis based on pollen morphology largely aligns with molecular phylogenetic trees， offering a method to distinguish extant species and fossils of Tsuga and providing valuable insights for phylogenetic studies of Tsuga.

Keywords：Tsuga; pollen morphology; scanning electron microscopy（SEM）; cluster analysis

鐵杉屬（Tsuga）隸屬于松科，為東亞—北美間斷分布類群[1]。鐵杉屬植物的主要鑒定特征為苞鱗形態(tài)、珠鱗形態(tài)、葉型和花粉形態(tài)[2-5]?，F(xiàn)存鐵杉屬植物共10種，其中麗江鐵杉（T. forrestii）、米鐵杉（T. diversifolia）、日本鐵杉（T. sieboldii）、鐵杉（T. chinensis）、云南鐵杉 （T. dumosa）和郁陵鐵杉[6]（T. ulleungensis）6種分布于東亞地區(qū)，而山地鐵杉（T. mertensiana）、加拿大鐵杉（T. canadensis）、卡羅來納鐵杉（T. caroliniana）、異葉鐵杉（T. heterophylla）4種分布于北美地區(qū)[7- 8]。長苞鐵杉（Nothotsuga longibracteata）是中國特有種，因其諸多分類特征與鐵杉屬植物相似，早期的分類學(xué)家將其歸入鐵杉屬[9-10]，近來分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)表明，長苞鐵杉應(yīng)獨(dú)立為長苞鐵杉屬（Nothotsuga）[11]。

分子系統(tǒng)學(xué)的發(fā)展為闡明該屬的系統(tǒng)發(fā)育提供了更多的思路[12]。Havill等[13]利用核糖體ITS和葉綠體DNA數(shù)據(jù)分析了鐵杉屬的系統(tǒng)發(fā)育和生物地理學(xué)。Feng等[14]利用881個(gè)核基因、60個(gè)葉綠體基因和23個(gè)線粒體基因重建鐵杉屬植物高分辨率的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。葉綠體基因組分析結(jié)果表明[15]，鐵杉可能不是一個(gè)單系物種，有必要對(duì)其展開進(jìn)一步系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。眾多學(xué)者從形態(tài)學(xué)[2，5，16-21]、分子系統(tǒng)學(xué)[11，14-15]等角度對(duì)鐵杉屬進(jìn)行了研究，探討了鐵杉屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為深入研究鐵杉屬系統(tǒng)發(fā)育框架奠定了基礎(chǔ)[9，22]。

花粉表面具有形態(tài)各異的萌發(fā)溝和表面紋飾，且有關(guān)花粉形態(tài)的基因序列具有高度保守性和穩(wěn)定性，是種上分類階元?jiǎng)澐值闹匾獏⒖糩23-24]。例如，利用花粉形態(tài)特征可將頂冰花屬（Gagea）分為兩組[25]；通過形態(tài)聚類分析，朱槿（Hibiscus rosa-sinensis）[26]、風(fēng)毛菊屬（Saussurea）[27]、睡蓮屬（Nymphaea）[28]的分類和進(jìn)化地位得以進(jìn)一步確定。

鐵杉屬花粉具有一定的分類意義，但有關(guān)鐵杉屬花粉研究較少。孫愛芝等[29]只將鐵杉屬花粉描述為具周囊類型，張金談[30]觀察了鐵杉屬鐵杉與云南鐵杉2種植物花粉，發(fā)現(xiàn)鐵杉屬花粉粒無氣囊，有皺邊，皺邊表面具有蠕蟲狀紋飾和小刺，與王伏雄等[31]對(duì)云南鐵杉的觀察結(jié)果一致。Sivak[2]用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡詳細(xì)研究了鐵杉屬12種花粉粒表面的紋飾特征，并根據(jù)花粉形態(tài)對(duì)鐵杉屬進(jìn)行分類，但其研究的多數(shù)物種被認(rèn)為是同一種或某變種，且未建立鐵杉屬演化關(guān)系。鐵杉屬花粉形態(tài)與其授粉方式密切相關(guān)，可分為Sect. Hesperopeuce和Micropeuce（=Sect. Tsuga）兩組[19]（以下簡稱H組和M組），前者只包含山地鐵杉1種，花粉有氣囊，在珠孔處萌發(fā)形成花粉管；后者包括除山地鐵杉外其他種，花粉無氣囊，在珠鱗或苞鱗上萌發(fā)形成花粉管。還有學(xué)者根據(jù)花粉形態(tài)差異認(rèn)為鐵杉屬應(yīng)分為兩屬[32]。但是，該屬花粉形態(tài)的研究還缺乏物種的全面取樣，也很少在系統(tǒng)發(fā)育框架內(nèi)探討其形態(tài)演化。因此，有必要在全面取樣基礎(chǔ)上，開展鐵杉花粉形態(tài)的研究，在該屬系統(tǒng)發(fā)育框架下探究其分類意義。

本研究通過掃描電子顯微鏡觀察現(xiàn)存鐵杉屬10種的花粉形態(tài)特征，結(jié)合3種鐵杉屬花粉化石標(biāo)本信息，通過聚類分析，從花粉形態(tài)角度為鐵杉屬的分類提供了佐證，為該屬化石標(biāo)本分類地位確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

本研究共收集到10種鐵杉屬植物及近緣種長苞鐵杉花粉。由于時(shí)間、地域限制，除鐵杉外，其余花粉通過蠟葉標(biāo)本上的雌球花獲得，具體采樣信息見表1。

鐵杉花粉取樣于秦嶺火地塘，于2022年4月于火地塘實(shí)驗(yàn)林場鐵杉混交林中采集鐵杉的小孢子葉球，待其自然散粉后收集，保存于-20 ℃冰箱用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。新鮮花粉均采集自胸徑大于30 cm的無明顯病蟲害的健康植株。

1.2 掃描電子顯微鏡觀察

將帶有花粉的雌球花樣本與花粉樣本，用導(dǎo)電雙面膠粘在金屬臺(tái)上，25 mA真空噴金80 s兩次后，使用日立S-3400N掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行觀察、拍照記錄花粉形態(tài)特征。

1.3 聚類分析方法

1.3.1 形態(tài)特征數(shù)據(jù)集的建立

每種隨機(jī)選取10粒花粉粒，利用Image J軟件測其極軸長度（P）、赤道軸長度（E）、氣囊長（L）、氣囊寬（W）、棘突長（Ls）、棘突寬（Ws）、棘突密度（Ns）。對(duì)于部分鐵杉屬花粉化石的形態(tài)數(shù)據(jù)，通過查閱相關(guān)記錄文獻(xiàn)獲得。計(jì)算各項(xiàng)指標(biāo)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。花粉形態(tài)學(xué)描述術(shù)語參考王伏雄等[23]、王開發(fā)和王憲曾[24]、埃爾特曼[34]。

1.3.2 性狀的編碼

采用等級(jí)數(shù)量編碼方法進(jìn)行編碼[35]，共選取11個(gè)性狀（表2），其中數(shù)值性狀（numerical character，簡稱“N”）8個(gè)，數(shù)值性狀不編碼，直接以原始數(shù)據(jù)形式進(jìn)行運(yùn)算；導(dǎo)出性狀（induced character，簡稱“I”）2個(gè)，以數(shù)值性狀原始數(shù)據(jù)按公式計(jì)算得到；無序多態(tài)性狀（disordered multistate character，簡稱“D”）1個(gè)，采用綜合評(píng)分法編碼，取連續(xù)排列的正整數(shù)1、2、3[28]進(jìn)行編碼。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2022軟件，對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化（STD）處理以消除不同量綱，以10個(gè)性狀為變量，種類為觀測值，以各種的所屬組（H組、M組）作為分組依據(jù)進(jìn)行主成分分析。R型聚類分析選用Ward法，以相關(guān)性系數(shù)為度量距離生成性狀指標(biāo)聚類的樹狀圖，選擇用于Q型聚類的指標(biāo)；Q型聚類分析選用Ward法，以歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)制作樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉形態(tài)特征

鐵杉屬花粉為N1P3C1型，遠(yuǎn)極面具有一薄壁區(qū)（圖1），極軸長21.20～58.00 μm，赤道軸長42.74～95.30 μm，多無氣囊，稀有氣囊；花粉粒表面多疣狀，稀微疣狀；表面有棘突或無，棘突長0.83～1.67 μm，寬0.48～0.66 μm，長寬比值為1.38～2.75，有0.13～0.40個(gè)/μm2棘突（表3）。

長苞鐵杉和山地鐵杉花粉具氣囊，其余各鐵杉均無氣囊（圖1）。近緣種長苞鐵杉與山地鐵杉?xì)饽掖笮〔町惷黠@，約為山地鐵杉的3.66倍。加拿大鐵杉赤道軸最短，極軸也最短，卡羅萊納鐵杉赤道軸最長，極軸最長。日本鐵杉、卡羅萊納鐵杉、化石種1和化石種2極軸較長，在40 μm以上。長苞鐵杉、異葉鐵杉和化石種1赤道軸較長，在70 μm左右。

長苞鐵杉花粉表面微疣狀，較光滑；鐵杉屬花粉表面均具疣，山地鐵杉表面較光滑，微疣狀；加拿大鐵杉、卡羅萊納鐵杉表面較粗糙，呈疣狀；其余7種鐵杉花粉外壁粗糙，表面有棘突，棘突長短、個(gè)數(shù)不盡相同。鐵杉、米鐵杉、云南鐵杉、日本鐵杉棘突較狹長，棘突長是棘突寬2倍以上；麗江鐵杉、郁陵鐵杉棘突稍短，棘突長接近棘突寬的2倍，其中異葉鐵杉棘突最為短粗，棘突長寬比最小，僅為1.38。異葉鐵杉花粉表面棘突個(gè)數(shù)最少，約0.13個(gè)/μm2；日本鐵杉最多，為0.40個(gè)/μm2。此外，鐵杉、云南鐵杉和化石種3棘突也在0.30個(gè)/μm2以上，郁陵鐵杉則在0.20個(gè)/μm2以下。

每種花粉展示其形態(tài)（1，比例尺50 μm）和表面紋飾（2，比例尺5 μm），A. T. chinensis; B： T. ulleugensis; C： T. sieboldii; D： T. caroliniana; E： T. dumosa; F： T. candensis; G： T. forrestii; H： T. diversifolia; I： T. heterophylla; J： T. sp. 1; K： T.sp.2： L： T. sp.3; M： T. mertensiana; N： N. longibracteata。 T. caroliniana（D）花粉粒放大倍數(shù)為1000倍，表面紋飾放大倍數(shù)為5000倍[2]。

Each pollen species showing its morphology （left，1， scale bar 25 μm） and sculpture （right，2，scale bar 5 μm）， Image of T. caroliniana pollen grain（D） magnified ×1000， sculpture magnified ×5000[2]. A： T. chinensis; B： T. ulleugensis; C： T. sieboldii; D： T. caroliniana; E： T. dumosa; F： T. candensis; G： T. forrestii; H： T. diversifolia; I： T. heterophylla; J： T. sp. 1; K： T.sp.2： L： T. sp.3; M： T. mertensiana; N： N. longibracteata.

每種花粉展示其形態(tài)（1.比例尺50 μm）和外壁紋飾（2.比例尺5 μm）。Pollen of each species showing its morphology （1. scale bar 50 μm） and sexine sculpture （2. scale bar 5 μm）. a. 鐵杉T. chinensis; b.郁陵鐵杉T. ulleugensis; c. 日本鐵杉T. sieboldii; d. 卡羅萊納鐵杉T. caroliniana; e. 云南鐵杉T. dumosa; f.加拿大鐵杉T. candensis; g. 麗江鐵杉T. forrestii; h.米鐵杉T. diversifolia; i. 異葉鐵杉T. heterophylla; j. 化石種1 T. sp. 1; k.化石種2 T. sp.2： l. 化石種3 T. sp.3; m. 山地鐵杉T. mertensiana; n. 長苞鐵杉N. longibracteata。 卡羅萊納鐵杉（d）花粉粒放大倍數(shù)為1 000，外壁紋飾放大倍數(shù)為5 000[2]。 Image of T. caroliniana pollen grain（d） magnified ×1 000， sexine sculpture magnified ×5 000[2].

2.2 主成分分析和聚類分析

2.2.1 主成分分析

主成分分析貢獻(xiàn)率結(jié)果（表4）顯示，第1主成分的貢獻(xiàn)率為67.259％，其中最顯著的變量是紋飾賦值、棘突長寬比、棘突寬；第2主成分的貢獻(xiàn)率為19.415％，其中最顯著的變量是氣囊體積、氣囊寬、氣囊長。前2個(gè)主要成分的總貢獻(xiàn)率為86.674%，大于85%且兩個(gè)主成分特征值均大于1，說明所選取的指標(biāo)能較好解釋樣本的差異性，可以用于下一步分析。

主成分分析結(jié)果（圖2）表明，M組與H組顯著分離，M組主要集中在第1象限，與棘突有關(guān)指標(biāo)距離較近；H組與長苞鐵杉則在第3象限，與氣囊指標(biāo)關(guān)系較大。加拿大鐵杉與卡羅萊納鐵杉與M組其他鐵杉相距較遠(yuǎn)，處于第4象限（圖2）。

化石種1與異葉鐵杉、郁陵鐵杉相似，化石種2則與卡羅萊納鐵杉、加拿大鐵杉更加相似，化石種3與云南鐵杉、日本鐵杉和鐵杉距離較近。此外，主成分分析結(jié)果將鐵杉屬按不同分布區(qū)分離開，東亞分布的各類群明顯聚集在一起，北美分布各種較分散，但仍與東亞各種分離。

2.2.2 R型聚類分析

R型聚類結(jié)果（圖3）表明，棘突長與棘突長寬比相關(guān)度較高，氣囊長、氣囊寬相關(guān)度較高，本試驗(yàn)將氣囊長與棘突長寬比保留，用于Q型聚類分析。其他指標(biāo)較分散，基本可以用于下一步Q型聚類分析。

2.2.3 Q型聚類分析

由Q型聚類分析結(jié)果（圖4）顯示，歐氏距離為12時(shí)，分為兩大類：①無棘突，包括長苞鐵杉、山地鐵杉、卡羅萊納鐵杉、加拿大鐵杉；②有棘突，包括鐵杉、云南鐵杉、日本鐵杉、麗江鐵杉、米鐵杉、異葉鐵杉和郁陵鐵杉?；N1與化石種3屬于第①大類，化石種2屬于第②大類。

歐氏距離為6時(shí)，分為3類：①有氣囊、無棘突，包括山地鐵杉、長苞鐵杉；②無氣囊、無棘突，包括卡羅萊納鐵杉、加拿大鐵杉、化石種2；③無氣囊、無棘突，仍包括鐵杉、云南鐵杉、日本鐵杉、麗江鐵杉、米鐵杉、異葉鐵杉和郁陵鐵杉。

歐氏距離為2時(shí)，共分為6類：①長苞鐵杉；②山地鐵杉；③加拿大鐵杉、化石種2；④卡羅萊納鐵杉；⑤鐵杉、云南鐵杉、日本鐵杉、麗江鐵杉、米鐵杉；⑥異葉鐵杉和郁陵鐵杉。

綜上，本研究認(rèn)為根據(jù)棘突與氣囊的有無，將鐵杉屬分為3類（歐氏距離為6）最為合適，可以較好地判斷和區(qū)分鐵杉屬內(nèi)各種花粉。

根據(jù)聚類分析結(jié)果（圖4），化石種1與郁陵鐵杉、異葉鐵杉相似，化石種2花粉與加拿大鐵杉最為相似，化石種3在花粉形態(tài)上與日本鐵杉、云南鐵杉和鐵杉組為姐妹群。

將Q型聚類分析結(jié)果與鐵杉屬分子系統(tǒng)發(fā)育樹[14]比較（圖5）發(fā)現(xiàn)，兩者具有一定的相似性。長苞鐵杉、山地鐵杉、加拿大鐵杉與卡羅萊納鐵杉都位于基部位置，云南鐵杉、日本鐵杉、麗江鐵杉與鐵杉關(guān)系較近。但形態(tài)學(xué)聚類分析將長苞鐵杉與山地鐵杉支系、卡羅萊納鐵杉與加拿大鐵杉支系視為姊妹群，而系統(tǒng)發(fā)育樹則認(rèn)為它們是嵌套結(jié)構(gòu)。此外，形態(tài)學(xué)分析認(rèn)為異葉鐵杉與郁陵鐵杉較為相似，分子系統(tǒng)樹支持異葉鐵杉與山地鐵杉親緣關(guān)系較近。

3 討 論

3.1 花粉形態(tài)特征的分類學(xué)及生物學(xué)意義

鐵杉屬植物花粉形態(tài)呈現(xiàn)出較為豐富的多樣性。Q型聚類分析結(jié)果表明，氣囊的有無與棘突特征是區(qū)分鐵杉屬花粉的重要依據(jù)。歐氏距離為6時(shí)，可據(jù)此將鐵杉屬花粉分為3類：①有氣囊、無棘突類，為長苞鐵杉與山地鐵杉；②無氣囊、無棘突類，為加拿大鐵杉、卡羅萊納鐵杉和化石種2；③無氣囊、有棘突類，為鐵杉、云南鐵杉、日本鐵杉、麗江鐵杉、米鐵杉、異葉鐵杉和郁陵鐵杉和化石種1、3。鄒惠渝等[36]將鐵杉屬劃分為3個(gè)組：鐵杉組（Sect. 1 Tsuga）、北美鐵杉組（Sect. 2 Canadensis）和大果鐵杉組（Sect. 3 Hesperopeuce），將卡羅萊納鐵杉、加拿大鐵杉與異葉鐵杉從鐵杉組中分離為北美鐵杉組Sect. 2 Canadensis，并將長苞鐵杉獨(dú)立成屬。李楠[1]則將長苞鐵杉納入鐵杉屬，分為長苞鐵杉組（Sect. Heopeuce）、鐵杉組（Sect. Tsuga）和大果鐵杉組（Sect. Hesperopeuce），本研究依據(jù)花粉形態(tài)所得的分類結(jié)果更為支持鄒惠渝等[36]的分組方案，但不同意其將長苞鐵杉獨(dú)立成屬的觀點(diǎn)。

花粉特征在一定程度上可以表現(xiàn)植物演化的一般規(guī)律[37]。目前，一般認(rèn)為花粉形態(tài)的演化順序是氣囊從有到無、體積由大到小、外壁紋飾由光滑到短棘突再到長棘突[38]。分子與形態(tài)系統(tǒng)發(fā)育樹中，有氣囊的長苞鐵杉和山地鐵杉位于最基部，無棘突的加拿大鐵杉和卡羅萊納鐵杉也位于發(fā)育樹底端，而各類無氣囊、有棘突的類群則位于發(fā)育樹頂端。說明鐵杉屬中有氣囊、無棘突為原始類型，無氣囊、有棘突則為進(jìn)化類型，鐵杉屬花粉的演化趨勢(shì)為有氣囊至無氣囊、無棘突至有棘突。

鐵杉屬植物花粉形態(tài)的演化過程與其授粉方式密切相關(guān)。在有氣囊花粉類群中，植株直立，依靠授粉滴捕獲花粉，花粉無需被其他部位捕獲。而在無氣囊花粉類群中，花粉不能被授粉滴捕獲，而是利用棘突附著于苞鱗背面，因此，棘突的數(shù)量和形態(tài)有利于花粉穩(wěn)定附著于苞鱗背面。相較于有氣囊花粉類群，棘突的出現(xiàn)無疑增加了鐵杉屬植物的受精成功率和生態(tài)適應(yīng)性，極大保障了鐵杉屬植物的繁殖優(yōu)勢(shì)。

3.2 花粉形態(tài)特征的親緣關(guān)系分析

花粉形態(tài)的穩(wěn)定性在一定程度上可以表現(xiàn)種屬間的親緣關(guān)系[23-24]。根據(jù)聚類分析結(jié)果顯示，山地鐵杉與長苞鐵杉互為姊妹群，卡羅萊納鐵杉則與加拿大鐵杉互為姐妹群，異葉鐵杉與郁陵鐵杉親緣關(guān)系最近，鐵杉則與云南鐵杉關(guān)系最緊密。Havill等[13]與Feng等 [14]建立的分子發(fā)育樹中，卡羅萊納鐵杉與加拿大鐵杉嵌套進(jìn)入了亞洲支系中，本研究則發(fā)現(xiàn)兩者花粉形態(tài)與北美支系關(guān)系更緊密，與地理位置相對(duì)應(yīng)。此外，本研究建立的鐵杉屬花粉形態(tài)發(fā)育樹，其東亞分布的種類雖然聚類到了1個(gè)分支，但拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與分子系統(tǒng)發(fā)育樹存在一定差異，這可能是東亞分布的鐵杉屬植物經(jīng)歷了多次雜交和演化，具有復(fù)雜的網(wǎng)狀演化模式，為親緣關(guān)系的界定帶來較大的困難[14]。

長苞鐵杉是中國特有種，自發(fā)表以來，其分類地位具有頗多爭議。鄭萬鈞先生[10]發(fā)現(xiàn)長苞鐵杉苞鱗露出種鱗之外，不同于其他鐵杉屬植物，將其列為新種并和北美分布的山地鐵杉納入大果鐵杉組中；Flous[39]發(fā)現(xiàn)長苞鐵杉葉上有散生斑點(diǎn)，薄壁細(xì)胞中有石細(xì)胞，與其他鐵杉屬植物明顯不同，應(yīng)獨(dú)立成組。胡先骕先生[40]首次提出建立長苞鐵杉屬（Nothotsuga），得到了Page[41]的支持。但又有學(xué)者通過染色體核型[42-45]、木材結(jié)構(gòu)[46-47]方面的研究，認(rèn)為應(yīng)當(dāng)將長苞鐵杉納入鐵杉屬長苞鐵杉組。近來分子系統(tǒng)學(xué)證據(jù)表明，長苞鐵杉區(qū)別于鐵杉屬，應(yīng)獨(dú)立為長苞鐵杉屬[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)，長苞鐵杉花粉與山地鐵杉花粉形態(tài)相近，只在花粉和氣囊體積上略有差異，以花粉形態(tài)為分類標(biāo)準(zhǔn)，長苞鐵杉并不能脫離鐵杉屬單獨(dú)成屬，支持將其納入鐵杉屬的觀點(diǎn)。

鐵杉屬花粉特征與其分布地有密切的關(guān)系。主成分分析與聚類分析結(jié)果中，北美分布的種類（異葉鐵杉除外）與東亞分布的各種明顯分離，說明同一地區(qū)分布的花粉存在一定的相似性。北美分布的鐵杉屬植物表面大多較光滑，而東亞分布種類表面均粗糙，附著有長短粗細(xì)不一的棘突。值得注意的是，北美分布的異葉鐵杉具有棘突，與東亞分布郁陵鐵杉親緣關(guān)系最近，而與北美分布的其他種類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。分子系統(tǒng)學(xué)研究支持異葉鐵杉是同樣分布于北美的山地鐵杉的姊妹群[13-14]，二者位于鐵杉屬的基部位置?；ǚ坌螒B(tài)聚類只強(qiáng)調(diào)了不同種類花粉形態(tài)上的相似性，無法從遺傳物質(zhì)角度判斷植物間的親緣關(guān)系，仍具有一定的局限性。此外，分布于韓國郁陵島的郁陵鐵杉在2017年才被發(fā)現(xiàn)，其花粉形態(tài)與北美分布的異葉鐵杉相似，可能與鐵杉屬的起源與擴(kuò)散有關(guān)：始新世到中新世時(shí)期，白令陸橋是北美洲與亞洲進(jìn)行物種交流的重要走廊，兩個(gè)地區(qū)的植物可能通過此通道進(jìn)行了交流[48]。

在鐵杉屬花粉形態(tài)研究基礎(chǔ)上，筆者嘗試了對(duì)化石花粉的鑒定。化石種1花粉無氣囊、外壁有棘突，聚類分析中其處于異葉鐵杉和郁陵鐵杉支系的基部，因?yàn)榛ǚ蹃碓从趭W地利中新世地層[33]，推測其可能為異葉鐵杉和郁陵鐵杉祖先類型曾經(jīng)在歐洲分布的遺跡[48]?；N2形態(tài)上與加拿大鐵杉、卡羅萊納鐵杉相近，均無氣囊、外壁紋飾疣狀，根據(jù)聚類分析結(jié)果，鑒定化石種2為加拿大鐵杉花粉。聚類分析結(jié)果將化石種3嵌套在包含鐵杉、云南鐵杉和日本鐵杉支系的基部位置，推測該化石與該分支其他種的祖先具有密切關(guān)系。

綜上所述，根據(jù)花粉形態(tài)特征對(duì)鐵杉屬進(jìn)行分類和親緣關(guān)系探究具有一定的科學(xué)性與準(zhǔn)確性；尤其是依據(jù)花粉氣囊的有無與外壁紋飾特征，可以較好地對(duì)大多數(shù)鐵杉屬花粉進(jìn)行分類，對(duì)鐵杉屬花粉的鑒定與親緣關(guān)系的探究也具有積極意義。

致謝：

西北農(nóng)林科技大學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的張國云老師、園藝學(xué)院陳蕊紅老師提供掃描電鏡，蘭州大學(xué)孫柏年教授和韓磊博士提供化石樣本，中科院植物所的孔宏智研究員和于寧寧博士、華南植物園的余恩平同學(xué)、云南大學(xué)的周新茂副教授及蔣璐遙同學(xué)、南京林業(yè)大學(xué)的袁禹婷同學(xué)、美國密蘇里植物園的張麗兵研究員和韓國國家植物園Chang Kae Sun教授協(xié)助樣品采集。

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（責(zé)任編輯 吳祝華）

收稿日期Received：2024-06-17""" 修回日期Accepted：2024-07-10

基金項(xiàng)目：國家植物標(biāo)本資源庫項(xiàng)目（E0117G1001）。

第一作者：陳芷涵（13657974778@163.com）。

*通信作者：張鑫（xin.zhang@nwafu.edu.cn），講師，博士。

引文格式：陳芷涵，尚鑫， 謝淦，等.

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