摘要：【目的】檢測鐵冬青（Ilex rotunda）雌株和雄株開花進程中揮發(fā)性成分的種類差異和動態(tài)，觀察傳粉昆蟲的種類及行為，明確鐵冬青傳粉系統(tǒng)特性，探究其揮發(fā)性成分的變化規(guī)律對傳粉昆蟲行為的潛在影響，為提高鐵冬青授粉效率及其觀賞利用價值提供參考。【方法】利用頂空固相微萃?。℉S-SPME）和氣相色譜-質譜聯(lián)用（GC-MS）技術分析鐵冬青大蕾期、初綻期、盛開期、末花期4個階段花揮發(fā)性成分的變化；采用觀測法，記錄傳粉昆蟲的種類、訪問頻次，分析昆蟲的訪花行為及訪花頻率變化規(guī)律?！窘Y果】①鐵冬青花期共檢測出30種揮發(fā)性物質，其中雌花檢測出19種，雄花檢測出21種。②揮發(fā)性成分中，β-石竹烯等主要成分含量的變化規(guī)律是先上升后降低，在盛花期達到峰值。末花期主成分的含量占比普遍降低，醇類、烷烴類的占比有所上升，伴隨出現(xiàn)羅勒烯等多種新化合物。③鐵冬青的授粉昆蟲較為單一，為中華蜜蜂（Apis cerana），雌株與雄株的訪問高峰期高度重疊，中華蜜蜂更傾向于訪問雄花，其訪花頻率的變化趨勢與β-石竹烯含量變化規(guī)律一致?！窘Y論】推測β-石竹烯可能作為一種信息物質吸引中華蜜蜂進行授粉；利用中華蜜蜂“集中式”的訪花模式，集中且合理搭配栽植鐵冬青雌雄株，配合花期一致、雄株花量大的規(guī)律，可有效提高提冬青的授粉成功率。

關鍵詞：鐵冬青；中華蜜蜂；揮發(fā)性有機化合物；傳粉昆蟲；氣相色譜-質譜聯(lián)用技術

中圖分類號：S722"""""" 文獻標志碼：A開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

文章編號：1000-2006（2024）04-0254-07

Effects of volatile organic components of Ilex rotunda on its insect pollinator， Apis cerana

KUANG Zeyu， PENG Ye*， FANG Yanming

（Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China，Key Laboratory of National Administration of Forestry and Grassland on Subtropical Forest Biodiversity Conservation， College of Life Sciences， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract： 【Objective】The relationship between odorous substances in flowers and the visiting behavior of insects has attracted increasing attention from biologists. However， previous studies on specific plants and pollinators are scare. The present study investigated the species differences and dynamic changes in the volatile organic components of male and female flowers of Ilex rotunda during flowering， and recorded the species and behaviors of pollinators. The study aimed to elucidate the characteristics of the pollinating system， explore the potential effects of volatile compounds on the behaviors of pollinating insects， and provide a reference for improving the pollination and fruiting of I. rotunda. 【Method】The changes in the volatile components during the four flowering stages，" the big bud stage， first blooming stage， full blooming stage， and final flowering stage， were determined by head space solid phase microextraction （HS-SPME） and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）. The species， visiting behavior， and visiting frequency of the pollinators were recorded by observation. 【Result】The results demonstrated that the flowering of I. rotunda began in late April and ended in early May in Nanjing， with a flowering period of nearly half a month. A total of 30 volatile substances were detected from the flowers， of which 19 and 21 were detected from female and male flowers， respectively. There was a moderate difference in the overall number of male and female plants. The results revealed that the levels of β-caryophyllene and other major components increased initially， reached a peak at the full-opening stage， and decreased thereafter. The proportion of the main components generally decreased at the final flowering stage. However， there was an increase in the proportion of alcohols and alkanes during final flowering， which was accompanied by the production of several new compounds." The sole" insect pollinator of I. rotunda is Apis cerana. There was a considerable overlap between male and female plants during the peak visiting period. The findings revealed that A. cerana preferred visiting male flowers， and that there was a positive correlation between the changes in the visiting frequency pattern and β-caryophyllene content. 【Conclusion】The results indicated that β-caryophyllene could be used as an information substance to attract A. cerana for pollinating I. rotunda. Additionally， male and female I. rotunda plants can be planted in a centralized and reasonable manner according to the “centralized” flower visiting behavior of A. cerana. The success rate of I. rotunda pollination can be effectively improved by complying with the consistent flowering period， the concentrated flowering period， and planting large numbers of male plants.

Keywords：Ilex rotunda; Apis cerana; volatile organic compounds; pollinating insect; gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）

傳粉是開花植物有性生殖過程中極為重要的環(huán)節(jié)，其中傳粉媒介是影響異花傳粉植物有性生殖成功與否的重要因素。據(jù)報道，約90%的開花植物由蟲媒授粉[1]，對于雌雄異株的蟲媒植物而言，授粉昆蟲的意義更為突出[2]。雌雄異株植物的授粉系統(tǒng)有專性授粉和廣義授粉之分[3]，授粉者的數(shù)量及其傳粉效率直接影響著植物的繁殖效率。研究表明，多種因素影響下全球傳粉媒介正在大規(guī)模減少，這將導致植物授粉強度不夠，種子產(chǎn)量與質量降低，甚至會導致物種瀕危，這無疑是蟲媒植物面臨的緊迫問題[4-5]。闡明特定植物在花期散發(fā)的揮發(fā)性有機化合物（volatile organic compounds， VOCs）的功能和變化規(guī)律，可了解這些化合物與植物對應傳粉者的相互作用[6]。許多揮發(fā)性有機化合物被預測為傳粉網(wǎng)絡結構的重要決定因素，它們是傳粉者用來定位花粉和花蜜獎勵的重要線索之一。例如，花散發(fā)的氣味可以在長距離內(nèi)吸引或排斥傳粉者，而在短距離內(nèi)可以刺激其著陸和吸食[7-9]。

花香物質與昆蟲訪花行為關聯(lián)越來越受到生物學家的關注，然而對于特定植物-傳粉者的試驗研究依然有限。鐵冬青（Ilex rotunda） 為冬青科（Aquifoliaceae）冬青屬（Ilex）常綠喬木。秋冬時節(jié)，綠葉滴翠紅果滿枝，經(jīng)冬不衰，是理想的庭園綠化觀賞樹種。作為典型的雌雄異株植物，更被列為重要蜜粉源植物[10]。冬青屬植物多為雌雄異株，其授粉系統(tǒng)以及傳粉者對冬青屬植物繁殖效率的影響等鮮見報道。本研究旨在分析鐵冬青開花時的揮發(fā)性有機化合物，探索其開花進程中揮發(fā)性成分與授粉昆蟲的互作關系，為今后鐵冬青的深度開發(fā)利用及提高經(jīng)濟觀賞價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于江蘇省南京市（118°46′5.53″E，31°52′11.10″N），屬北亞熱帶濕潤氣候，四季分明，雨量充沛，土壤肥沃。年平均降水117 d，平均降水量1 106 mm，相對濕度76%，無霜期237 d。試驗所用鐵冬青花蕾及花，采自南京林業(yè)大學校園內(nèi)多年生栽培群體，生長環(huán)境一致且健康。為了測試不同階段的揮發(fā)性成分，花蕾及花收集于4個階段：①大蕾期，花苞飽滿，頂端出現(xiàn)孔隙，即將開放；②初綻期，花被片張開，雄蕊尚未開始散粉，雌蕊柱頭可授；③盛花期，花冠完全打開，花瓣伸展；④末花期，花被片開始萎蔫，有少量落花（圖1）。為使分析結果更具代表性，選擇晴朗天氣的13：00—14：00，分別從雌雄株采集4個時期花蕾及花，每個時期取3個重復用于檢測揮發(fā)性成分。

1.2 揮發(fā)性成分的萃取與分析

揮發(fā)性成分萃取：將65 μm PDMS/DVB萃取頭與SPME手柄（美國SU-PELCO公司）進行連接，在氣相色譜的進樣口進行老化，老化溫度為250 ℃，老化時間30 min。每次取長勢、大小一致的花瓣1 g放置于10 mL萃取瓶中并密封，于恒溫水浴鍋下（40 ℃）平衡25 min；將經(jīng)過老化的SPME纖維頭插入采樣瓶中，萃取頭置于花朵上方1 cm處，頂空萃取25 min；最后將萃取頭插入GC進樣口，解析3 min，進行GC-MS（氣相色譜質譜聯(lián)用儀，美國Thermo Electro-Finnigan公司）技術分析。

色譜條件：TTR-5MS彈性石英纖維毛細管柱；載氣為高純度氦氣（He），氦氣流速為1 mL/min，分流比為10∶1，進樣口溫度250 ℃；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持2 min;以2 ℃/min升至60 ℃，以5 ℃/min升至100 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。

質譜條件： 接口溫度為250 ℃，電子轟擊源為EI，離子電離能量為70 eV，質量掃描范圍50～450 amu。

1.3 訪花昆蟲觀察

對雌雄株的主要傳粉昆蟲種類、數(shù)量及其訪花行為進行觀測。標記雌雄株各3株，每株選取3個花枝，在4月26日至5月9日整個花期內(nèi)晴天8：00—18：00進行觀察，記錄在花上訪問的昆蟲種類與數(shù)量以及訪花行為。每2 h觀察1次，每次記錄30 min，每天觀察5次。累計觀察30 h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

依據(jù)GC-MS的總離子流圖，對照圖譜庫（NIST05）的標準質譜圖，確認揮發(fā)性物質的各化學成分，并按峰面積歸一化法計算出樣品中各組分的相對含量（體積分數(shù)）。

對鐵冬青的揮發(fā)性成分進行相似度分析，引入Jaccard相似性系數(shù)（q）[11]： q=c/（a+b-c）。式中： c為雌雄株共有揮發(fā)性成分種數(shù)；a和b分別為雌株和雄株的揮發(fā)性成分種數(shù)。q為相似性系數(shù)，當0≤q≤0.25時，雌雄株間的揮發(fā)性化合物極不相似；當0.25lt;q≤0.50時，中等不相似；當0.50lt;q≤0.75時，中等相似；當0.75＜q≤1.00時，極相似。

采用SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。運用Origin 2022繪制PCA得分圖和表格，顯著性水平均為0.05。采用在線軟件TBtools （https：//github.com/CJ-Chen/TBtools） 制作揮發(fā)性成分和昆蟲訪花頻率的熱圖。

2 結果與分析

2.1 鐵冬青花不同階段揮發(fā)性成分種類分析

利用HS/SPME-GC/MS分別對鐵冬青花的4個階段進行揮發(fā)性有機化合物檢測，在整個花期雌雄花共檢測出30種揮發(fā)性物質，其中雌花檢測出19種，雄花21種（表1）。雌花4個階段檢測出19種揮發(fā)性有機化合物，包括萜烯類、烷烴類、酯類、醇類和其他5大類。其中萜烯類成分的種類最豐富，各階段都有4～5種且總含量一直遠高于其他種類化合物。其次是烷烴類（2～5種）和醇類（2～3種），其余化合物僅在特定階段出現(xiàn)，如酯類僅在末花期測出，乙醇胺僅在大蕾期測得，丙氨酰、丙氨酸在大蕾期和盛花期出現(xiàn)。縱觀整個花期，各類揮發(fā)性有機化合物的含量變化呈現(xiàn)不同趨勢。主要成分萜烯類呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，在盛花期達到最高；相反，醇類物質含量為先下降后上升，在末花期達到峰值。酯類、乙醇胺等其他物質的體積分數(shù)占比在4個階段中均不超過2%，變化不大。雄花在4個階段檢測出21種成分，主要是萜烯類、烷烴類、醇類和醛類。大蕾期檢出7種化合物，包括6種萜烯類和1種醇類，萜烯類體積分數(shù)占比在此階段達最高值，為98.19%。至花初綻，雄花釋放的成分略有增多，有5種萜烯類和6種烷烴類。醛類化合物僅在末花期檢測出。與雌花不同，雄花萜烯類含量在大蕾期就達到峰值，而不是盛開期。前3個階段，雌雄花萜烯類含量的差別很小，但到末花期，雄花萜烯類體積分數(shù)占比仍達到82.51%，而雌花僅剩70.31%；除此之外，醇類是雌花末花期含量第二高的化合物，體積分數(shù)占比19.84%，雄花則是烷烴類，體積分數(shù)占比14.07%。

對于雌雄異株植物而言，雌雄花的揮發(fā)性成分相似性高則有助于吸引相同的訪花昆蟲[12]。鐵冬青雌花雄花的揮發(fā)性有機化合物相似度分析結果顯示，從全花期角度看，雌雄花的總成分相似度為0.38，處于中等不相似水平，但變化趨勢是先增高后降低，初綻期和盛開期多處于中等相似水平。萜烯類與烷烴類是種類數(shù)量較多的兩類化合物，其相似度變化規(guī)律與總成分相似，初綻期和盛開期的相似度高于其他階段，烷烴類全花期的相似度達到了0.71，成為鐵冬青花期揮發(fā)性成分相似度最高的化合物。

2.2 鐵冬青花不同階段揮發(fā)性成分動態(tài)變化

分析得知（表1），雌花和雄花在4個階段內(nèi)，萜烯類的含量都顯著高于其他大類，而在萜烯類中，β-石竹烯的含量又始終占主導地位。雌花在大蕾期含量最高的3種化合物為β-石竹烯、α-石竹烯、氧化石竹烯，體積分數(shù)分別為81.78%、4.95%和4.31%，總含量超過90%；其次為十四甲基環(huán)七硅氧烷（2.23%）、環(huán)己硅氧烷（1.55%）和丙氨酰丙氨酰丙氨酸（1.34%），同時檢測出僅存于此階段的乙醇胺（0.87%）。初綻期氧化石竹烯的體積分數(shù)下降至0.84%，十四甲基環(huán)七硅氧烷的體積分數(shù)上升至5.45%。初綻期至末花期，主成分β-石竹烯含量體積分數(shù)先升高后降低，盛花期達到峰值89.07%，末花期最低僅60.53%。盛花期未檢測出醇類物質，而在末花期醇類總體積分數(shù)卻達到了20%左右。此外末花期新檢測出2種羅勒烯和酯類的格拉菲寧，各萜烯類化合物含量下降，醇類與烷烴類的種類和占比為整個花期最高。

雄花大蕾期含量最高的化合物分別是β-石竹烯、α-石竹烯和α-法尼烯，其體積分數(shù)分別為70.89%、16.92%和4.46%，此階段獨有的欖香烯體積分數(shù)約為1.07%。初綻期萜烯類中除了β-石竹烯含量繼續(xù)上升，其他種類占比都下降，最明顯的是α-石竹烯下降至4.54%；初綻期烷烴類種類最多有6種，其中環(huán)己硅氧烷、十四甲基環(huán)七硅氧烷、十六烷基環(huán)八硅氧烷3種體積分數(shù)超過1%。盛開期β-石竹烯體積分數(shù)達到最高值為92.68%，其他已有的成分占比皆下降。末花期化合物種類最多，各成分含量較為分散，新檢測出蒎烯、Hexyl hydroperoxide等物質，除β-石竹烯外，環(huán)己硅氧烷和十四甲基環(huán)七硅氧烷為含量最高的兩種成分，體積分數(shù)分別達到6.72%和5.12%。

2.3 PCA主成分分析

PCA分析結果（圖2）表明，雌花和雄花第1主成分（PC1）的貢獻率加上第2主成分（PC2）的貢獻率均大于90%，說明第1、第2主成分基本代表了樣品主要揮發(fā)性有機化合物的組成，達到了降維目的并依此分類。經(jīng)分析，對于雄花，與PC1相關性高的變量為β-石竹烯、α-石竹烯和α-法尼烯，可以區(qū)分出末花期；與PC2相關性高的變量為α-石竹烯、十四甲基環(huán)七硅氧烷和環(huán)己硅氧烷，可以區(qū)分出大蕾期。而初綻與盛花期在PC1和PC2上的差距較小。對于雌花而言，與PC1相關性高的變量為β-石竹烯、反-α反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇和壬三烯，可顯著區(qū)分大蕾期末花期與初綻盛花期；與PC2相關性高的變量為十四甲基環(huán)七硅氧烷、反-α反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇和α-石竹烯，可以進一步區(qū)分大蕾期和末花期。綜上所述，通過β-石竹烯、α-石竹烯等萜烯類和十四甲基環(huán)七硅氧烷、反-α反-α，α-5-三甲基-5-乙烯基四氫化-2-呋喃甲醇等烷烴類的含量差別可以有效推斷花期進程，這也從側面證明了這些揮發(fā)性成分在開花進程中有各自的變化趨勢。

2.4 鐵冬青傳粉昆蟲觀測

依據(jù)對鐵冬青整個花期（4月24日—5月8日）的觀測以及鑒定結果可知，鐵冬青的傳粉昆蟲種類較為單一，主要是中華蜜蜂（Apis cerana）。隨著開花進程的推進，中華蜜蜂的訪問頻率在初綻期（4月24日—4月27日）開始有上升的趨勢（圖3），一直到盛花期（4月28日—5月3日）達到峰值，隨后進入末花期（5月4日—5月8日）轉為下降。中華蜜蜂的訪花變化與主要的揮發(fā)性化合物β-石竹烯先增后減的趨勢一致，雌株與雄株呈現(xiàn)出相似的規(guī)律，但雄株的中華蜜蜂訪問量始終大于雌株，并且整個花期內(nèi)雌雄株被訪問的高峰期高度重疊，這也從側面體現(xiàn)了鐵冬青雌雄株花期同步，這對成功授粉十分有利。

熱圖分析（圖4）顯示，除去4月25日和4月28日兩個雨天，在上午時間段，中華蜜蜂的訪問量持續(xù)上升，10：00—12：00是全天訪問頻率最高的區(qū)間，14：00—16：00出現(xiàn)第2個高峰，符合中華蜜蜂“雙峰格局”的訪花規(guī)律[13]。值得注意的是，12：00—14：00時間段，即使天氣晴朗溫度高，其訪問量卻不如前后觀測段，可能是蜜蜂訪花行為還受到溫度與濕度的影響，不適宜的溫濕度會降低中蜂的訪問頻率[14]。在觀測中還注意到，中華蜜蜂訪花時身體會充分接觸雄蕊，體表攜帶大量花粉。中華蜜蜂攜粉部位主要位于喙部、足與腹板[14]。偏愛“集中式”訪花的中華蜜蜂在1個花枝上連續(xù)訪數(shù)朵花，通常在訪完整個花枝所有花朵后才轉移至其他花枝，且會出現(xiàn)重復訪同一朵花的現(xiàn)象[15]。同有關研究，中華蜜蜂偏向于上午訪花采粉，下午訪花采蜜[16]。這既解釋了中華蜜蜂對花量更大、開放更集中的雄株的訪問量遠大于雌花，也佐證了鐵冬青是優(yōu)良的蜜源植物，以花粉和花蜜作為訪花的報酬。

3 討 論

隨著花開放和衰敗，植物的揮發(fā)性有機化合物釋放都會發(fā)生相應改變[17-19]。本研究中，鐵冬青花的主要揮發(fā)性成分為萜烯類，包括β-石竹烯、α-石竹烯、α-法尼烯和氧化石竹烯等，變化趨勢均為先增加后減少，盛花期達到峰值。盡管雌雄花的揮發(fā)性成分總體呈中等不相似水平，但β-石竹烯始終是含量占比（體積分數(shù)）最高的化合物，在PCA分析中也是相關度最高的物質。Kantsa等[20]提出芳香植物萜類化合物的高排放量與蜜蜂的高訪問量有關。倍半萜（sesquiterpene）是天然植物群落中揮發(fā)性有機化合物（VOC）的主要組分，β-石竹烯是倍半萜，在昆蟲-VOC網(wǎng)絡中起關鍵作用。Schiestl[21]的分析顯示，作為昆蟲信息素的半萜與作為花揮發(fā)物的半萜存在90%的重疊。吳國火等[22]證實低濃度β-石竹烯和α-法尼烯對中華蜜蜂具有顯著引誘效應。鐵冬青開花過程中β-石竹烯的變化規(guī)律與中華蜜蜂的訪花規(guī)律高度吻合，因此，推測β-石竹烯可能作為一種信息物質，吸引中華蜜蜂為鐵冬青進行授粉。

對于雌雄異株植物而言，雄花與雌花的訪花昆蟲應保持相對的一致性。朱曉珍等[11]研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果（Siraitia grosvenorii）的雌花和雄花在訪花昆蟲的多樣性上存在顯著差異，并且雌株上未發(fā)現(xiàn)有效傳粉昆蟲。他們認為這是羅漢果自然授粉不良的主要原因。同時，對于雌雄異株植物，訪花昆蟲常對雄性個體表現(xiàn)出明顯的偏好[23]。而筆者的研究結果表明，鐵冬青雌雄花的花期一致，開花過程中釋放的揮發(fā)性物質較為一致，訪花的昆蟲一致。已知揮發(fā)性物質對傳粉昆蟲具有特定的導向作用，盡管鐵冬青在揮發(fā)性成分的種類上呈現(xiàn)中等不相似水平，但在相對含量中，萜烯類特別是β-石竹烯等主要成分高度相似，這有利于傳粉昆蟲同時對鐵冬青雌雄花進行同步的有效訪問。對于植物而言，更多的花被傳粉昆蟲訪問，意味著更多的授粉機會與繁殖保障[24]。鐵冬青具有雄株花量大、雌雄株花期一致的特點，結合其主要授粉昆蟲中華蜜蜂的訪花習慣，在栽培時應集中且合理地進行雌株與雄株的搭配，以更大程度發(fā)揮對訪花昆蟲的誘導作用，提高雌株有效授粉，增大果量，提高其觀賞性。但是授粉昆蟲種類單一，對于植物而言是具有潛在危害的。由于農(nóng)藥的過度使用，棲息地的減少，以及意大利蜂等的競爭，中華蜜蜂的數(shù)量增長速度跟不上植物傳粉需求[25]，長此以往，可能會制約鐵冬青的有性生殖成功率，甚至使其瀕臨滅絕。因此，后續(xù)研究應圍繞驗證β-石竹烯對中華蜜蜂的引誘效果，分析如何吸引更多種類和數(shù)量的授粉昆蟲來展開。

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（責任編輯 王國棟）

收稿日期Received：2022-11-08""" 修回日期Accepted：2023-04-20

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目（PAPD）。

第一作者：匡澤宇（15961014821@163.com）。

*通信作者：彭冶（pengye@njfu.edu.cn），副教授。

引文格式：匡澤宇，彭冶，方炎明. 鐵冬青花揮發(fā)性化合物對中華蜜蜂訪花的影響[J]. 南京林業(yè)大學學報（自然科學版），2024，48（4）：254-260.

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DOI：10.12302/j.issn.1000-2006.202211014.