摘 要： 牛體外胚胎生產(chǎn)是一種廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)和生物研究的現(xiàn)代繁殖技術(shù)，在促進(jìn)肉牛和奶牛品種改良以及高效繁育中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。隨著分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)已取得了長足進(jìn)步。然而，當(dāng)前牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)仍存在胚胎生產(chǎn)效率低和胚胎發(fā)育潛能差等瓶頸問題，在很大程度上限制了該技術(shù)的規(guī)?；茝V應(yīng)用。本文系統(tǒng)綜述了牛體外胚胎生產(chǎn)中經(jīng)典添加物和最新添加物的研究進(jìn)展，旨在為優(yōu)化構(gòu)建不同添加物組合的技術(shù)體系提供參考，以期更加高效地獲得牛體外優(yōu)質(zhì)胚胎。

關(guān)鍵詞： 牛；胚胎；培養(yǎng)液；受精；添加物

中圖分類號：S823.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3309-12

收稿日期：2024-01-24

基金項(xiàng)目：湖北省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022BBA007）；湖北省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)（2023BBB056）；武漢輕工大學(xué)引進(jìn)（培養(yǎng)）人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目（2023R2010）

作者簡介：戴舒穎（2001-），女，安徽滁州人，碩士，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：dsy_0109@163.com

通信作者：余 博，主要從事家畜胚胎發(fā)育研究，E-mail：wonderfish@whpu.edu.cn；陳洪波，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：chenhongbo@whpu.edu.cn

Research Progress on Culture Medium Additives in Bovine In Vitro Embryo Production

DAI" Shuying1， LIU" Qing1， LI" Aiguo2， YU" Bo1*， CHEN" Hongbo1*

（1.Laboratory of Genetic Breeding， Reproduction and Precision Livestock Farming， School of Animal

Science and Nutritional Engineering， Wuhan Polytechnic University， Wuhan 430023，" China;

2.Shiyan

Centers for Disease Control and Prevention， Shiyan 442099，" China）

Abstract：" Bovine embryo in vitro production （IVP） is a modern reproductive biotechnology， which is widely used in livestock production and biological research and plays an essential role in promoting breed improvement and reproductive efficiency for both beef and dairy cattle. As development of molecular biology， biochemistry and cell biology， a great progress has been made in bovine IVP. However， the current bovine IVP is still facing bottleneck problems， such as low efficiency of in intro embryo production and poor embryonic development potential， seriously hindering the further large-scale promotion and application of this technology. In this paper， the research progress of classical and latest additives in bovine IVP was systematically reviewed， intending to provide references for optimizing and constructing the technical system of different additive combinations， and aiming to more efficiently obtain high-quality bovine in vitro embryos.

Key words： bovine; embryo; culture solution; fertilization; additive

*Corresponding authors：" YU Bo， E-mail： wonderfish@whpu.edu.cn; CHEN Hongbo， E-mail： chenhongbo@whpu.edu.cn

牛體外胚胎生產(chǎn)（in vitro production，IVP）是指從不同年齡和生理狀態(tài)的供體卵巢上獲取未成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)成熟、受精并進(jìn)一步培養(yǎng)發(fā)育，最終獲得可進(jìn)行移植或冷凍保存的胚胎。卵母細(xì)胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）、體外受精（in vitro fertilization，IVF）和體外培養(yǎng)（in vitro culture，IVC）是IVP的三個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)［1-3］。IVM作為IVP的第一步，對卵母細(xì)胞的質(zhì)量將會(huì)產(chǎn)生重要影響并直接決定IVP的效率［4］；IVF是將成熟后的卵母細(xì)胞和獲能后的精子在體外可控的環(huán)境中完成受精的技術(shù)；IVC則是將受精卵繼續(xù)培養(yǎng)至所需胚胎階段，它作為IVP的最后一步將直接關(guān)系到后續(xù)胚胎發(fā)育的質(zhì)量［3］。

培養(yǎng)液是體外胚胎生長發(fā)育的外環(huán)境，直接為體外胚胎提供營養(yǎng)、能量等支持。近年來，研究人員通過向體外基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加不同物質(zhì)以期能夠更加真實(shí)地模擬體內(nèi)胚胎發(fā)育環(huán)境，從而獲得更為優(yōu)質(zhì)的囊胚（圖1）。卵母細(xì)胞的成熟品質(zhì)和受精卵的質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)囊胚率［5］。研究表明，某些添加物如激素、肝素等對卵母細(xì)胞成熟和精子體外獲能必不可少［6］。此外，體外受精條件的優(yōu)化，包括精子和卵子的質(zhì)量控制、體外受精環(huán)境因素控制以及受精卵形成的時(shí)間窗口選擇等，能夠顯著提高受精率和受精卵品質(zhì)［7］。再者，一些添加物對體外胚胎發(fā)育至關(guān)重要。例如，抗氧化應(yīng)激類添加物褪黑素、維生素C等可以明顯提高發(fā)育胚胎的卵裂率和囊胚率［8-11］；添加胰島素樣生長因子、表皮生長因子等則會(huì)顯著加快胚胎發(fā)育的速度并提高其發(fā)育質(zhì)量。

目前，牛IVP技術(shù)的瓶頸問題在于體外胚胎的生產(chǎn)效率和發(fā)育潛能較低。據(jù)統(tǒng)計(jì)，牛體外囊胚率只有30%左右，這在很大程度上限制了牛體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的應(yīng)用和推廣［12］。解決這一問題的關(guān)鍵在于持續(xù)優(yōu)化體外培養(yǎng)液配方，尤其是需要針對減數(shù)分裂期、卵裂期、合子基因激活期等某些關(guān)鍵發(fā)育階段進(jìn)行配方改良，以滿足不同發(fā)育階段胚胎的營養(yǎng)需求，進(jìn)而顯著提高胚胎存活率和發(fā)育質(zhì)量［13］。鑒于體外環(huán)境仿真模擬體內(nèi)環(huán)境對牛IVP的至關(guān)重要性，本文重點(diǎn)綜述了胚胎體外生產(chǎn)過程中不同添加物的成分、作用及其應(yīng)用價(jià)值，以期為優(yōu)化構(gòu)建不同添加物組合的技術(shù)體系并為高效獲取體外優(yōu)質(zhì)胚胎提供參考。

1 不同添加物對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

體外培養(yǎng)系統(tǒng)對于獲得高質(zhì)量的胚胎具有關(guān)鍵作用，因此，IVM作為體外胚胎培養(yǎng)的第一步顯得尤為重要［14］。IVM是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核需要經(jīng)過一系列的分子表達(dá)和結(jié)構(gòu)變化才能最終實(shí)現(xiàn)生殖細(xì)胞完全成熟［15］。目前，對于體內(nèi)卵母細(xì)胞所處的具體微環(huán)境以及卵泡液中的物質(zhì)組成尚不完全清楚［16］，牛卵母細(xì)胞體外成熟主要是以培養(yǎng)基199（tissue culture medium 199，TCM199）為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，通過添加血清、激素、卵泡液和生長因子等物質(zhì)盡可能地模擬卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟的環(huán)境（表1）。

1.1 血清

血清中含有豐富的氨基酸、維生素、激素和生長因子，對卵母細(xì)胞的成熟非常有益，在TCM199中補(bǔ)充血清是提高卵母細(xì)胞成熟率的有效方法之一。實(shí)際操作中常添加的血清包括胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、小牛血清（calf serum，CS）和發(fā)情母牛血清（estrus cow serum，ECS）等。在TCM199中補(bǔ)充10%的FBS后可促進(jìn)成熟卵母細(xì)胞獲得更優(yōu)的形態(tài)特征［17］。然而，血清來源和批次的不同可能會(huì)對培養(yǎng)效果產(chǎn)生影響，添加血清也可能導(dǎo)致污染問題。因此，近幾年無血清培養(yǎng)體系引起越來越多研究者們的關(guān)注［18］，使用其他物質(zhì)如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）和聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）等代替血清并取得了良好效果。此外，在探究不同濃度牛血清及BSA對水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用化學(xué)成分明確的無血清培養(yǎng)液可以實(shí)現(xiàn)與添加血清培養(yǎng)液同樣的效果［19］。值得一提的是，盡管BSA具有替代血清的效果，但I(xiàn)VM環(huán)節(jié)使用BSA的具體益處及其作用機(jī)制尚未明晰。

1.2 激素

激素是卵母細(xì)胞成熟必不可少的成分，常用來添加的激素主要包括促卵泡素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）以及重組人卵泡刺激素（human follicle stimulating hormone，hFSH）等。培養(yǎng)液中添加激素的種類、配方及用量尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。Mihoko等［20］發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)系統(tǒng)中添加FSH可促進(jìn)COCs發(fā)育及后續(xù)卵母細(xì)胞的生長。丁麗艷等［21］研究表明，添加FSH對卵母細(xì)胞成熟有促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，添加0.075 IU·mL-1促性腺激素（重組卵泡刺激素和尿促性素）改善促進(jìn)了卵母細(xì)胞細(xì)胞核成熟，進(jìn)而促進(jìn)改善了牛卵母細(xì)胞的體外受精效果［22］。絨毛膜促性腺激素在促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟方面具有與FSH類似的效果，且絨毛膜促性腺激素對卵母細(xì)胞的核成熟至關(guān)重要［23］。10 ng·mL-1的17β-雌二醇和10 ng·mL-1雄烯二酮組合使用也可以促進(jìn)50%以上的卵母細(xì)胞完全生長并充分具有減數(shù)分裂的能力［24］。激素的添加可有效促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟，但各種激素促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步解析。

1.3 生長因子

已有大量研究證明，在IVM培養(yǎng)液中添加生長因子有助于卵母細(xì)胞成熟以及早期胚胎發(fā)育。主要用于添加的生長因子包括：表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）、白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor，LIF）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等。EGF已被證明可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖和卵母細(xì)胞成熟，并通過與表皮生長因子受體結(jié)合誘導(dǎo)排卵過程［25］。IVM培養(yǎng)液中補(bǔ)充EGF可提高卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂能力，并促進(jìn)胚胎更好地發(fā)育到胚泡階段［26］。IGF-1是顆粒細(xì)胞有絲分裂原，它能促進(jìn)牛卵母細(xì)胞核成熟，IVM階段添加50 ng·mL-1 EGF和100 ng·mL-1 IGF-1可促進(jìn)體外受精后卵母細(xì)胞的核成熟和胚泡發(fā)育；IVM階段添加50 ng·mL-1 EGF、100 ng·mL-1 IGF-1和25 μg·mL-1連接蛋白37（Cx37）組合可增加線粒體功能和谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平，顯著改善牛胚胎發(fā)育質(zhì)量［27］。

1.4 其他添加物

在卵母細(xì)胞體外成熟過程中，研究人員也在嘗試在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)從而提高卵母細(xì)胞體外成熟率（表1）。例如，體外成熟培養(yǎng)基中添加微量礦物質(zhì)混合物可促進(jìn)卵母細(xì)胞體外成熟進(jìn)而改善后續(xù)的胚胎發(fā)育質(zhì)量［28］。近些年，研究還發(fā)現(xiàn)許多其他化合物如香草酸、檸檬苦素、抗氧化劑nobiletin等可以通過抑制氧化應(yīng)激提升卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量［29-31］。

2 不同添加物對體外受精的影響

哺乳動(dòng)物的精子在曲精小管中生成，并在母畜的生殖道中經(jīng)歷一系列反應(yīng)過程獲能。隨后精子會(huì)經(jīng)歷一系列變化，包括腺苷酸環(huán)化酶被激活、磷脂酶被激活、蛋白磷酸化加劇、精子膜流動(dòng)性增強(qiáng)以及膜電位的改變［40-41］。IVF是一項(xiàng)復(fù)雜的過程，它的成功與否離不開卵母細(xì)胞的成熟、精子的分選、精子的獲能以及適宜的培養(yǎng)條件［42］。培養(yǎng)液在IVF過程中起著至關(guān)重要的作用，對IVF的成功以及后續(xù)胚胎的發(fā)育和品質(zhì)有著直接影響。研究人員通過調(diào)整培養(yǎng)液的營養(yǎng)物質(zhì)，如氨基酸、糖類、脂類和添加物的比例和配方，致力于優(yōu)化培養(yǎng)基的組成，以提高后續(xù)胚胎的存活率和發(fā)育能力。

2.1 肝素

肝素（heparin）在牛體外受精研究中扮演著重要的角色，近年來對其在該領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛的研究。作為一種多糖類藥物，肝素具有抗凝血和抗炎作用，同時(shí)在體外受精過程中展現(xiàn)出多種潛在的益處［43］。為了在無生殖液的條件下誘導(dǎo)精子的獲能，研究人員使用了一些化合物，如鈣離子載體或黃體酮。肝素作為一種常見的誘導(dǎo)劑，能有效地誘導(dǎo)精子獲能［44］。研究發(fā)現(xiàn)，肝素作為牛精液的獲能劑，可加速受精過程，影響后續(xù)的胚胎發(fā)育［45］。此外，在體外受精培養(yǎng)基中添加肝素，對于精子獲能、原核形成和體外早期胚胎發(fā)育起著重要作用。

2.2 PHE（penicillamine，hypotaurine，epinephrine）

青霉胺（penicillamine）是一種含有巰基的氨基酸衍生物，被廣泛應(yīng)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和銅代謝障礙等不同疾病［46］。除了臨床應(yīng)用外，青霉胺在生殖生物研究領(lǐng)域也扮演著重要的作用，其中包括牛的體外受精。多個(gè)試驗(yàn)結(jié)果表明，適宜濃度的青霉胺可以提高受精率，但過高的濃度可能會(huì)阻礙受精［47］。次?；撬幔╤ypotaurine）是一種硫氨基酸衍生物，在多種生物過程中發(fā)揮著細(xì)胞保護(hù)和抗氧化應(yīng)激的重要作用［48］。次牛磺酸已被證明可以提高受精率，可能是由于其促進(jìn)了精子的活力和卵子的受精能力。Seify等［49］發(fā)現(xiàn)，次?；撬嶙鳛橐环N抗氧化劑，可以在一定程度上減少冷凍保存對精子形態(tài)和頂體完整的影響。腎上腺素（epinephrine）是一種兒茶酚胺，通過刺激可溶性腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致精細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度增加［50］，在加速鞭毛跳動(dòng)、促進(jìn)精子運(yùn)動(dòng)方面具有重要作用［51］。PHE混合物常與肝素一同添加至IVF培養(yǎng)液中，研究發(fā)現(xiàn)，與不添加PHE的對照組相比，PHE的添加能夠顯著提高卵裂率［52］。此外，在體外受精培養(yǎng)基中添加PHE可以改善公牛精子相關(guān)參數(shù)。Kang等［53］研究發(fā)現(xiàn)，在IVF培養(yǎng)液中添加PHE混合物（表2）可以保持牛精子的活力和壽命，并保證體外胚泡的穩(wěn)定生產(chǎn)；同時(shí)，PHE可能對受精率、胚胎發(fā)育和生殖細(xì)胞質(zhì)量產(chǎn)生多方面的影響。然而，目前其確切的作用機(jī)制尚不清楚，尚有待深入研究，以期豐富家畜受精過程基礎(chǔ)理論。

2.3 其他

近年來研究者也在不斷嘗試不同的IVF培養(yǎng)液添加物（表2），進(jìn)而提高卵裂率及后續(xù)的胚胎發(fā)育品質(zhì)。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在無血清條件下，IVF過程中添加4 μL的外源性黃體酮可以改善卵丘剝落的卵母細(xì)胞的發(fā)育能力［54］。Peixoto De Souza等［55］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中增加50 ng·mL-1 維生素D可以顯著提高體外受精率。最新研究還發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑可以改善解凍后公牛精子的品質(zhì)和受精能力［56］。

3 不同添加物對胚胎體外培養(yǎng)的影響

胚胎體外培養(yǎng)是決定體外胚胎發(fā)育成功的最后一步，其中存在許多影響因素。為了提升囊胚率和胚胎質(zhì)量，需要在培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分，如氨基酸、糖類、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)。此外，添加生長因子（如IGF和EGF）也可對胚胎發(fā)育產(chǎn)生積極影響。通過在培養(yǎng)基中添加上述物質(zhì)，可以更好地模擬體內(nèi)胚胎生長環(huán)境，從而獲得更多優(yōu)質(zhì)的囊胚。

3.1 胰島素樣生長因子（IGF）

IGF能夠促進(jìn)牛胚胎細(xì)胞的增殖和生長，提高胚胎的發(fā)育速度和質(zhì)量。IGF-1由輸卵管和子宮在早期產(chǎn)生，植入前的牛胚胎中含有IGF-1因子以及IGF-1受體的轉(zhuǎn)錄物。近十年，IGF-1對牛體外胚胎培養(yǎng)的影響得到了廣泛地研究。Wang等［64］發(fā)現(xiàn)，敲除IGF-1受體會(huì)抑制胚泡發(fā)育，表明IGF-1對提高牛胚胎體外培養(yǎng)具有重要作用。Nogueira等［65］發(fā)現(xiàn)，在牛胚胎體外生產(chǎn)過程中補(bǔ)充IGF-1、LIF和FGF2可以改善植入前胚胎的質(zhì)量。還有相關(guān)研究表明，IGF-1在牛體外胚胎培養(yǎng)中起到抗凋亡和存活因子的作用，并且可以減輕牛胚泡中的活性氧損傷［66］。

3.2 表皮生長因子（EGF）

EGF是一種由53個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的耐熱單鏈低分子多肽，通過與EGF受體特異性識別結(jié)合后發(fā)揮作用。在牛的輸卵管、子宮、卵母細(xì)胞和早期胎盤中均檢測到EGF的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Mesalam等［67］發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加EGF可以改善胚胎質(zhì)量，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)DNA甲基化和局點(diǎn)黏附通路的表達(dá)模式來調(diào)控胚胎質(zhì)量。然而，多項(xiàng)研究表明，補(bǔ)充EGF后并不能增加達(dá)到囊胚階段的總細(xì)胞數(shù)［68］。

3.3 抗氧化應(yīng)激添加物

氧化應(yīng)激是引起胚胎發(fā)育異常的重要因素之一，胚胎內(nèi)的活性氧（reactive oxygen species，ROS）來源于胚胎發(fā)育的各種代謝過程，生理含量的ROS可作為胚胎發(fā)育過程中的信號轉(zhuǎn)化分子，但過量的ROS會(huì)引起胚胎內(nèi)線粒體損傷、DNA損傷、脂質(zhì)過氧化甚至細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯［69-70］。因此在體外培養(yǎng)時(shí)，經(jīng)常通過添加外源性抗氧化劑清除ROS，減少其危害，以提高胚胎發(fā)育率［70］。最常用的抗氧化劑如GSH，研究表明添加3mmol的外源性GSH可以顯著提升囊胚發(fā)育率［71］。此外，孫敬宇［72］發(fā)現(xiàn)，20 μmol·L-1檸檬苦素能提高GSH水平，降低ROS水平，提高早期胚胎的發(fā)育能力和囊胚質(zhì)量。

3.4 其他

褪黑素（melatonin，MT）是一種抗衰老藥物，近年研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充MT可以增加IVP牛囊胚的形成［73-74］。當(dāng)胚胎在高氧條件下培養(yǎng)時(shí)，MT增加了囊胚的形成，但在低氧條件下，補(bǔ)充MT則減少了囊胚的發(fā)育。MT的補(bǔ)充對IVP過程中胚胎的具體影響機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。溶血磷脂酸作為卵母細(xì)胞成熟、受精和胚胎培養(yǎng)基的潛在補(bǔ)充劑在早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮一定作用。Yu等［75］發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充溶血磷脂酸加速了IVP囊胚形成。近年來研究人員不斷探索培養(yǎng)基添加物對體外胚胎培養(yǎng)的影響（表3），以期提高囊胚的數(shù)量和質(zhì)量。

4 IVM-IVF-IVC最佳添加物體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建探討

與普通的細(xì)胞培養(yǎng)類似，體外胚胎培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中往往需添加糖類、氨基酸、BSA等用于維持正常的養(yǎng)分供給，同時(shí)還需注意培養(yǎng)液pH、滲透壓以及培養(yǎng)環(huán)境［80］。但胚胎在不同的發(fā)育階段往往需要添加一些特殊的物質(zhì)，達(dá)到最終提升囊胚率、加速胚胎生長、優(yōu)化囊胚質(zhì)量的目的。

卵母細(xì)胞的成熟受激素調(diào)控，尤其是促性腺激素對卵母細(xì)胞成熟的啟動(dòng)具有重要作用。因此在IVM期間激素的添加必不可少，如FSH、LH、E2等。近年的研究發(fā)現(xiàn)，添加生長因子和抗氧化應(yīng)激物質(zhì)能極大地提高卵母細(xì)胞成熟率和質(zhì)量，如EGF、IGF-1、維生素A、檸檬苦素等［35］。通過在培養(yǎng)液中添加激素、生長因子、抗氧化應(yīng)激物質(zhì)，卵母細(xì)胞的成熟率可達(dá)85.00%及以上。

精子獲能是IVF的關(guān)鍵，heparin作為促進(jìn)精子獲能的物質(zhì)常被添加，添加量為10 μg·mL-1時(shí)，卵裂率可達(dá)82.40%。青霉胺、次?；撬岷湍I上腺素也常被添加用于提高受精率。ARG作為一種潛在的促能劑，研究發(fā)現(xiàn)添加10mmol ARG卵裂率為83.90%［58］。近年來，抗氧化應(yīng)激物質(zhì)也被添加在受精培養(yǎng)基中，以期提升受精卵的質(zhì)量。

IVC是牛體外胚胎生產(chǎn)中耗時(shí)最長的培養(yǎng)過程，受精卵在此過程經(jīng)歷卵裂、合子基因組激活、第一次譜系分化等一系列復(fù)雜過程。培養(yǎng)液是胚胎生長發(fā)育的直接場所，其添加成分尤為重要。除基礎(chǔ)成分外，常用添加物促生長因子不僅可以加速囊胚的形成，更能提升囊胚的質(zhì)量。與卵母細(xì)胞的體外成熟類似，氧化應(yīng)激也是胚胎發(fā)育的重要影響因素，值得一提的是，胚胎通常在低氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在IVC培養(yǎng)液中添加抗氧化物質(zhì)，如2 μmol VA可使囊胚率達(dá)38.75%。目前，與小鼠相比，牛體外胚胎培養(yǎng)仍存在囊胚率較低，胚胎發(fā)育遲緩，移植體外胚胎妊娠率低等問題。因此，未來還需通過探尋不同添加物來優(yōu)化培養(yǎng)液，以期提升囊胚率，加速囊胚形成，改善胚胎質(zhì)量。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，在IVC培養(yǎng)液中添加10 μmol的溶血磷脂酸（LPA）可加速囊胚的形成，最早可在第5天出現(xiàn)未擴(kuò)張囊胚（未發(fā)表數(shù)據(jù)）。

根據(jù)最新的研究成果綜合分析，我們需要綜合考慮添加物對卵母細(xì)胞成熟、卵母細(xì)胞受精和胚胎發(fā)育的影響。然而，值得注意的是，文獻(xiàn)中所使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)液各有不同，添加物的具體作用還需進(jìn)一步的對比試驗(yàn)論證。

5 小結(jié)與展望

牛體外胚胎培養(yǎng)受到多種因素的影響。作為卵母細(xì)胞體外成熟、精子獲能、體外受精和胚胎發(fā)育的直接場所，培養(yǎng)液的選擇和添加物的優(yōu)化對于牛體外胚胎培養(yǎng)至關(guān)重要。為了獲得更多高質(zhì)量囊胚，研究人員精心調(diào)整培養(yǎng)基配方。從IVM開始，通過添加激素、血清、生長因子等物質(zhì)，可以獲得更多成熟的卵母細(xì)胞，為后續(xù)IVF奠定基礎(chǔ)。在IVF過程中，添加肝素促進(jìn)精子獲能，添加PHE提高體外受精率。最后核心環(huán)節(jié)IVC通過添加生長因子、抗氧化應(yīng)激物、LPA等，最大程度地提升囊胚率、加速囊胚形成、優(yōu)化囊胚質(zhì)量。

我國是牛肉產(chǎn)品和牛乳制品最具潛力的消費(fèi)市場，牛產(chǎn)品供給能力不足導(dǎo)致我國需要大量進(jìn)口填補(bǔ)其空缺。IVP結(jié)合胚胎移植可加快我國良種牛培育和擴(kuò)繁速度，顯著提升能繁母牛繁殖力，是增加我國當(dāng)前牛產(chǎn)業(yè)產(chǎn)能的重要途徑。然而，相對于歐美發(fā)達(dá)國家，IVP技術(shù)在我國牛產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用僅處于起步階段，具有廣闊的發(fā)展前景。結(jié)合前沿的高通量深度測序和代謝組學(xué)技術(shù)，探索并完善添加物應(yīng)用于體外胚胎培養(yǎng)的方案，將有效提高體外高質(zhì)量胚胎生產(chǎn)、能繁母牛的生產(chǎn)效能，這對于進(jìn)一步優(yōu)化完善我國優(yōu)良種畜繁育技術(shù)體系，提升我國牛產(chǎn)品的綜合產(chǎn)能具有重要意義。

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（編輯 郭云雁）