摘 要： 犬乳腺腫瘤是犬常發(fā)腫瘤之一，且有50%左右為惡性，其轉(zhuǎn)移傾向明顯，易引起動(dòng)物死亡。Rho-GTPase蛋白家族中的PREX1蛋白，過(guò)度激活會(huì)導(dǎo)致Rac-GEF功能紊亂，影響細(xì)胞周期，改變細(xì)胞生理功能，PREX1的改變可能對(duì)細(xì)胞癌變有促進(jìn)作用。為探討PREX1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞生理功能的影響，本研究使用shRNA沉默PREX1表達(dá)，利用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)沉默后細(xì)胞PREX1蛋白表達(dá)量的變化，通過(guò)CCK-8試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)探究其對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp增殖能力的影響，通過(guò)劃痕試驗(yàn)和Transwell試驗(yàn)探索沉默其對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞系CHMp侵襲性的影響。研究結(jié)果表明，PREX1的低表達(dá)，可以抑制CHMp的增殖及侵襲能力。

關(guān)鍵詞： 犬乳腺腫瘤；CHMp細(xì)胞；增殖；遷移；侵襲

中圖分類號(hào)：S858.292；S857.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3706-08

收稿日期：2023-08-03

基金項(xiàng)目：廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（202201010033）

作者簡(jiǎn)介：徐禧瑩（2001-），女，廣東廣州人，本科生，主要從事寵物腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制研究，E-mail：miz17665002335@126.com

通信作者：賈 坤，主要從事犬乳腺腫瘤相關(guān)研究，E-mail： jiakun@scau.edu.cn

Effects of Silencing PREX1 Expression on Proliferation and Invasiveness of CHMp

XU" Xiying， WANG" Yiheng， OU" Qianting， HONG" Linyuan， LIU" Xujing， LU" Xianying， JIA" Kun*

（College of Veterinary Medicine ，South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract：" Canine mammary gland tumors are a prevalent neoplasm in dogs， with around 50% of cases exhibiting malignancy. They have a conspicuous inclination to spread to other parts of the body and have the potential to readily result in the demise of animals. When the PREX1 protein in the Rho-GTPase family is overstimulated， it can make Rac-GEF less effective， which can mess up the cell cycle and change how cells work. Alterations in PREX1 can potentially facilitate the development of cancerous cells. This study aimed to investigate the influence of PREX1 on the physiological functions of canine mammary tumor cells. In this study， shRNA was used to silence the expression of PREX1. A Western blot test was then used to see how the expression of PREX1 protein changed in the cells after the suppression. The CCK-8 test and colony formation test were used to see how the substance affected the ability of the CHMp canine mammary carcinoma cell line to divide. Additionally， the scratch test and Transwell test were utilized to examine the influence of silencing the substance on the invasiveness of the cell line. Research indicates that reduced expression of PREX1 can impede the proliferation and invasion capacity of CHMp cell lines.

Key words： canine mammary tumor; CHMp; proliferation; migration; invasion

*Corresponding author：" JIA Kun， E-mail：jiakun@scau.edu.cn

腫瘤是動(dòng)物機(jī)體在致癌因素影響下，局部組織、細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，形成異常增生或分化的細(xì)胞群。犬乳腺腫瘤是犬最常見的腫瘤之一，其發(fā)病率約占犬腫瘤疾病發(fā)病率的一半，其中約有47.5%的病例為惡性［1］ ，并且有明顯轉(zhuǎn)移傾向，嚴(yán)重影響犬的生命健康。

盡管近年來(lái)對(duì)犬乳腺腫瘤的防治方案在不斷改進(jìn)完善，但治愈率并沒有得到明顯提高［2］ 。究其原因主要是由于病患在臨床就診時(shí)病程多已是中晚期［3］ ，治療效果甚微。因此及時(shí)診斷，并控制疾病發(fā)展對(duì)該病治療有著重要意義。

腫瘤細(xì)胞首先需要形成偽足并延伸，接著建立新的黏附位點(diǎn)，再收縮細(xì)胞體和退化細(xì)胞尾部以完成運(yùn)動(dòng)過(guò)程。PREX1主要激發(fā)的是Rac亞家族［4-5］ ，在細(xì)胞形態(tài)變化的過(guò)程中，Rac可激活下游效應(yīng)子WAVE，誘導(dǎo)質(zhì)膜突起形成片狀偽足和基質(zhì)降解。在腫瘤細(xì)胞隨后的黏附過(guò)程中，活化的Rac1可通過(guò)激活PAKl磷酸化下游的黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）發(fā)揮作用［6-7］ 。曾有研究報(bào)道PREX1的mRNA在犬乳腺腫瘤中高表達(dá)［8］ ，但未進(jìn)一步驗(yàn)證PREX1在蛋白水平上的表達(dá)情況和對(duì)犬乳腺腫瘤生理影響。

shRNA（short hairpin RNA）是一種由兩個(gè)短反向重復(fù)序列組成的序列，其結(jié)構(gòu)中有一發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在目前的疾病治療中有一定作用［9］ 。shRNA由polⅢ啟動(dòng)子控制［10］ ，再連接5～6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。shRNA通過(guò)與PREX1 的mRNA的特異性結(jié)合，可以使PREX1的蛋白表達(dá)量降低，減弱PREX1在信號(hào)通路中的作用，進(jìn)而衰弱下游信號(hào)，使細(xì)胞發(fā)生發(fā)展受到阻滯。

CHMp細(xì)胞是犬乳腺腫瘤細(xì)胞的一支，分離自12歲雌性患惡性乳腺腫瘤犬的原發(fā)病灶，其TNM分期類型為T4N1（+）M1［11］ 。有研究曾對(duì)四種不同來(lái)源的犬乳腺腫瘤細(xì)胞進(jìn)行性狀分析，得出CHMp細(xì)胞不論在細(xì)胞活力還是增殖能力方面均較強(qiáng)，適用于犬乳腺腫瘤相關(guān)因子和轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究［12］ 。腫瘤細(xì)胞系在體外可以無(wú)限次數(shù)的快速增殖，不受分裂次數(shù)等限制，即獲得了永生性［13］ 。同時(shí)，在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡下可見有微絨毛、有偽足等結(jié)構(gòu)；細(xì)胞的外形變成圓形；核仁和核膜輪廓比較顯著，大小逐漸變得一致；有大量核糖體顆粒，細(xì)胞間隙連接很少等［14］ 。腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)很多，細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核比例增大，多有分化現(xiàn)象。在培養(yǎng)上，體外培養(yǎng)和體內(nèi)培養(yǎng)環(huán)境有明顯的差異。體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，由血管提供所需的營(yíng)養(yǎng)，而且依賴機(jī)體自動(dòng)調(diào)節(jié)滲透壓和酸堿度；而體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞，主要靠緩沖系統(tǒng)來(lái)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的酸堿度［15］ 。細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)往往會(huì)影響培養(yǎng)液的酸堿度，對(duì)細(xì)胞系的繁育有一定影響。

在本試驗(yàn)中，我們作者使用shRNA降低了體外培養(yǎng)的CHMp細(xì)胞中PREX1表達(dá)量，探究CHMp細(xì)胞在體外增殖、遷移和侵襲能力的變化，為犬乳腺腫瘤的深入研究提供數(shù)據(jù)支持，以期揭示該疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，為犬乳腺腫瘤的診斷方法、治療靶點(diǎn)和犬乳腺腫瘤生物標(biāo)志物等方面的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系

犬乳腺腫瘤細(xì)胞（CHMp）由本實(shí)驗(yàn)室保存；含已連接shRNA質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)自上海唯地廣州睿博生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑

Hiscript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Cham Q Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、高糖培養(yǎng)基（Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM）和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）購(gòu)自以色列Biological Industries公司；胰蛋白酶（trypsin-EDTA）、雙抗（penicillin-streptomycin）、Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；LipofectamineTM 8000TM reagent轉(zhuǎn)染試劑、快速封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、抗GAPDH鼠源單克隆抗體購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、Endo Free Maxi Plasmid Kit無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；CCK solution、吉姆薩染液、高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；雙色預(yù)染蛋白Marker，PAGE凝膠快速制備試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；抗PREX1兔源單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司；羊抗兔熒光二抗購(gòu)自武漢愛博泰克生物科技有限公司；羊抗鼠熒光二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

參照NCBI上已發(fā)表有關(guān)犬PREX1的mRNA序列，設(shè)計(jì)合成qPCR特異性引物。其引物序列為F（5′-AAAGGCCTCACAGAGGAGAAC-3′）， R（5′-TACTCCAAGG-CAGCCAAGAAA-3′）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

CHMp細(xì)胞使用添加10%BSA血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃含5%CO2的溫箱中，每16～24h傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 shRNA質(zhì)粒提取

使用氨芐抗性肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)睿博公司提供的含已連接shRNA質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞DH5α后，根據(jù)EndoFree Maxi Plasmid Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒提取操作。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和效率檢測(cè)

使用Lipofectamine 8000TM試劑將由睿博公司合成的shRNA轉(zhuǎn)染入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CHMp細(xì)胞中（分為轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp、陰性對(duì)照組shRNA-NC-CHMp和空白對(duì)照組CHMp），使用RT-qPCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 Western blot法檢測(cè)shRNA沉默后各組犬乳腺腫瘤細(xì)胞PREX1蛋白表達(dá)量

取穩(wěn)定傳代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞，使用預(yù)混的裂解液（預(yù)混比例：100 μL RIPA∶1 μL PMSF）分別裂解后提取蛋白。使用BCA法檢測(cè)提取的蛋白濃度。使用雅酶10.0%的PAGE凝膠快速制備試劑盒配置凝膠，待制膠完成后進(jìn)行電泳（程序：80 V/30 min; 120 V/60 min）。裁取35～40 ku（內(nèi)參，36 ku）以及150～250 ku（目的蛋白，186 ku）的凝膠片段，在冰上轉(zhuǎn)至PVDF膜（程序：GAPDH：400 mA/20 min；PREX1：400 mA/90 min）。轉(zhuǎn)膜終了，使用快速封閉液對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉，分別使用適量的一抗（稀釋的碧云天鼠源單克隆抗體：GAPDH：1∶5 000；稀釋的Affinity兔源單克隆抗體：PREX1：1∶500）浸潤(rùn)含內(nèi)參和含目的蛋白的PVDF膜，于4 ℃環(huán)境孵育過(guò)夜?；厥湛贵w液，使用PBST對(duì)PVDF膜清洗后，分別使用Abcam品牌和ABclonal的羊抗鼠熒光二抗和羊抗兔熒光二抗（稀釋倍數(shù)均為1∶5 000）對(duì)以上PVDF膜在常溫下避光、搖晃孵育1 h。使用PBST清洗，在LI-COR紅外雙色成像系統(tǒng)掃膜儀中掃膜成像，并用Image J軟件分析結(jié)果。

1.2.6 CCK-8法檢測(cè)shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的情況

取穩(wěn)定傳代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞重懸后稀釋為1×103個(gè)·100 μL-1，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組，同時(shí)以不加細(xì)胞的培養(yǎng)基為空白對(duì)照。從接種后24 h開始，往細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入10 μL的CCK Solution，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，后用酶標(biāo)儀檢測(cè)每個(gè)加樣孔的OD450 nm值。每隔24 h，按上述步驟操作，直至72 h。

1.2.7 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的情況

取穩(wěn)定傳代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞重懸后稀釋為2×103個(gè)·孔-1，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。將細(xì)胞培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)1周。棄盡舊培養(yǎng)液來(lái)使細(xì)胞的克隆培養(yǎng)達(dá)到終止，清洗后加適量的多聚甲醛（4%），靜置1 h，進(jìn)行細(xì)胞固定。固定終了，棄固定液，加入適量10%吉姆薩染液作細(xì)胞染色20 min。吸取染色液，并至自然干燥，拍照，并用ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.2.8 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞遷移的情況

取穩(wěn)定傳代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞重懸后稀釋為1×106個(gè)·孔-1，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，設(shè)置3個(gè)重復(fù)組。細(xì)胞密度達(dá)85%時(shí)，棄掉培養(yǎng)液，并對(duì)貼壁細(xì)胞進(jìn)行劃痕，洗滌劃下的細(xì)胞，并更換無(wú)血清培養(yǎng)基后鏡下拍照。細(xì)胞培養(yǎng)板于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別在12和24 h再次拍照。用ImageJ軟件分析結(jié)果。

1.2.9 Transwell試驗(yàn)檢測(cè)shRNA-PREX1轉(zhuǎn)染犬乳腺腫瘤細(xì)胞侵襲的情況

取穩(wěn)定傳代且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHMp、shRNA-PREX1-CHMp和shRNA-NC-CHMp細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液密度稀釋為5×105個(gè)·mL-1備用。向Transwell小室中加入用DMEM培養(yǎng)液稀釋的Matrigel基質(zhì)膠，待其凝固后吸出殘余液體，并向小室中加入200 μL細(xì)胞懸液，再將小室置于含500 μL完全培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)基，洗滌，乙醇固定，再使用10%吉姆薩染液作細(xì)胞染色15 min。染色終了，吸取染色液，擦去上層未侵襲成功的細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察并拍照。用Image J軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 RT-qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞PREX1 mRNA的表達(dá)量

shRNA對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的轉(zhuǎn)染效率

從感受態(tài)細(xì)胞DH5α提取已連接shRNA的質(zhì)粒，用于后續(xù)的轉(zhuǎn)染工作。轉(zhuǎn)染后，使用RT-qPCR方法進(jìn)行mRNA表達(dá)量的檢測(cè)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，有效沉默后PREX1 mRNA的表達(dá)量明顯降低（Plt;0.05），表明在shRNA-PREX1-CHMp細(xì)胞中成功沉默了PREX1 mRNA的表達(dá)，但shRNA-NC-CHMp細(xì)胞中PREX1 mRNA的表達(dá)沒有受到明顯影響。即shRNA-PREX1-CHMp細(xì)胞組中PREX1 mRNA表達(dá)量較低，其他組可正常表達(dá)（圖1）。

2.2 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞PREX1蛋白的表達(dá)量

2.2 shRNA沉默PREX1表達(dá)后蛋白表達(dá)量檢測(cè)

用Western blot方法檢測(cè)CHMp、shRNA-NC-CHMP、shRNA-PREX1-CHMp3組細(xì)胞PREX1蛋白的表達(dá)量。結(jié)果表明（圖2、3），陰性對(duì)照組shRNA-NC-CHMp細(xì)胞與空白對(duì)照CHMp細(xì)胞之間在PREX1蛋白表達(dá)量上無(wú)明顯差異（Pgt;0.05），而轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp細(xì)胞與對(duì)照組之間在PREX1蛋白表達(dá)量上有顯著差異性（Plt;0.01），與qRT-PCR的結(jié)果一致，說(shuō)明CHMp細(xì)胞轉(zhuǎn)染shRNA-PREX1質(zhì)粒后PREX1蛋白表達(dá)量減少。

2.3 shRNA沉默PREX1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp增殖效率能力的影響

對(duì)穩(wěn)定傳代和生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，使用CCK-8試驗(yàn)和克隆形成試驗(yàn)兩種方法對(duì)增殖能力進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)CCK-8試驗(yàn)，結(jié)果表明，shRNA-NC-CHMp細(xì)胞與空白對(duì)照CHMp細(xì)胞的OD值無(wú)明顯差異（Pgt;0.05），而轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp與其他兩組細(xì)胞的OD值差異極顯著（Plt;0.01，圖4）。根據(jù)克隆形成試驗(yàn)，結(jié)果表明，有效轉(zhuǎn)染后，CHMp細(xì)胞克隆形成率明顯降低（Plt;0.001，圖5、6）。這表明對(duì)PREX1有效沉默后，可導(dǎo)致CHMp細(xì)胞增殖能力減弱。

2.4 shRNA沉默PREX1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp遷移效率能力的影響

對(duì)分布于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中等量的細(xì)胞，進(jìn)行相同的劃痕操作，拍照后使用ImageJ軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。遷移路徑效率以劃痕后區(qū)域面積變化作為指標(biāo)，根據(jù)結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照組shRNA-NC-CHMp細(xì)胞與空白對(duì)照CHMp細(xì)胞的橫向遷移面積，結(jié)果不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Pgt;0.05），而對(duì)照組和shRNA-PREX1-CHMp細(xì)胞對(duì)比，后者的橫向遷移面積相比于前者極顯著減少（Plt;0.001，圖7、8）。這表明對(duì)PREX1有效沉默后，可導(dǎo)致CHMp細(xì)胞遷移能力明顯減弱。

2.5 shRNA沉默PREX1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp侵襲能力的影響

不同組別、相同數(shù)量的穿透Matrigel基質(zhì)膠，以侵襲的細(xì)胞數(shù)量作為細(xì)胞侵襲能力的衡量標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組shRNA-NC-CHMp細(xì)胞與空白對(duì)照CHMp細(xì)胞之間在遷移能力侵襲數(shù)量上無(wú)明顯差異（Pgt;0.05），而有效轉(zhuǎn)染組shRNA-PREX1-CHMp細(xì)胞與其他兩組之間在侵襲數(shù)量上有極顯著差異性（Plt;0.001），與空白對(duì)照組差距尤甚（圖9、10）。這表明對(duì)PREX1有效沉默后，可導(dǎo)致CHMp細(xì)胞侵襲能力明顯降低。

3 討 論

本研究較好地驗(yàn)證了PREX1對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)特性的調(diào)控作用。從細(xì)胞水平上探究了PREX1的表達(dá)對(duì)犬乳腺腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。研究假設(shè)，沉默PREX1后，CHMp細(xì)胞的生物學(xué)活性有所減弱，故通過(guò)CCK-8試驗(yàn)、克隆形成試驗(yàn)、劃痕試驗(yàn)、Transwell試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)沉默PREX1可以有效抑制犬乳腺腫瘤細(xì)胞CHMp的增殖、遷移和侵襲。

研究過(guò)程中使用的方法具有參考意義。CCK-8試驗(yàn)利用細(xì)胞內(nèi)脫氫酶氧化還原，使試劑顏色發(fā)生 變化（生成甲臜），其生成量和CHMp活細(xì)胞數(shù)量成正比。通過(guò)無(wú)放射性的比色檢測(cè)方法，可以得到細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。具有增殖活力的細(xì)胞能夠貼壁并形成克隆，故通過(guò)克隆形成試驗(yàn)得到的克隆形成率用于描述CHMp增殖能力較為精確。通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)板上人為制造空白區(qū)域，區(qū)域邊緣的細(xì)胞會(huì)向區(qū)域內(nèi)遷移。顯微鏡定期拍照，可用于判斷劃痕區(qū)域的愈合情況，從而反映細(xì)胞的遷移能力。Transwell小室中，CHMp細(xì)胞需要分泌水解酶，并變形運(yùn)動(dòng)，才可穿過(guò)基質(zhì)膠，進(jìn)入下室。通過(guò)計(jì)算侵入下室的細(xì)胞比例數(shù)量，可較好反映細(xì)胞的侵襲能力。

更進(jìn)一步地對(duì)PREX1的機(jī)理進(jìn)行探討。

PREX1作為Rho-GTPase蛋白家族中的一員，其過(guò)度激活主要帶來(lái)Rac-GEF的紊亂，刺激中性粒細(xì)胞趨化和活性氧的形成［16］ 。在雌激素受體陽(yáng)性的腫瘤中，PREX1的mRNA表達(dá)量有所上升，而在正常的乳腺組織中，很少發(fā)現(xiàn)其表達(dá)［4］ 。

Rac在細(xì)胞表面延伸，形成偽足的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在此其中，如板狀偽足的形成系典例［17］ ，通過(guò)效應(yīng)器Lpd完成遷移和侵襲的前期準(zhǔn)備。Lpd在細(xì)胞遷移過(guò)程中向細(xì)胞骨架傳遞信號(hào)，通過(guò)肌動(dòng)蛋白、效應(yīng)器VASP、WAVE相關(guān)復(fù)合物相互作用促進(jìn)肌動(dòng)蛋白聚合［6］ 。其中，VASP伸長(zhǎng)肌動(dòng)蛋白絲，WAVE相關(guān)復(fù)合物與Arp2/3之間發(fā)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而使肌動(dòng)蛋白更多地生成［18］ 。此時(shí)，癌細(xì)胞已經(jīng)獲得了遷移的基礎(chǔ)能力，在Rac過(guò)度表達(dá)的情況下，就可表現(xiàn)為顯性的體內(nèi)轉(zhuǎn)移，突破基底膜后，腫瘤從良性向惡性轉(zhuǎn)變，從而縮短患病動(dòng)物生存時(shí)間［19］ 。蛋白質(zhì)SUMO化可改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而使功能發(fā)生變化。Lorente等［20］ 學(xué)者指出，使用銀杏酸抑制蛋白質(zhì)SUMO化，一方面可通過(guò)自噬細(xì)胞使癌細(xì)胞死亡，另一方面可通過(guò)Rac1途徑抑制腫瘤的侵襲活動(dòng)。由此認(rèn)為，根據(jù)Rac在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲上的表現(xiàn)，若可從根本上消除由Rac過(guò)度表達(dá)的因素，腫瘤生長(zhǎng)就會(huì)受到阻礙，故PREX1成為本研究的重要選擇。

本研究存在一些局限性。首先，我們所用細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)的CHMp細(xì)胞，通過(guò)體外試驗(yàn)得到的結(jié)論，不一定在神經(jīng)、體液、免疫多重調(diào)節(jié)下的機(jī)體內(nèi)有效，且本研究缺乏正常犬乳腺細(xì)胞作為對(duì)照，shRNA-PREX1的組合能否依舊在體內(nèi)正常且安全的運(yùn)作有待商榷；其次，試驗(yàn)未進(jìn)行大量患病動(dòng)物樣本的回顧性研究，試驗(yàn)中CHMp細(xì)胞所提供的結(jié)論價(jià)值需要更多的證據(jù)支撐，而用于臨床后，前瞻性研究也很有必要。

PREX1的作用為在針對(duì)犬乳腺腫瘤的新型療法開發(fā)上提供了不同的視角。通過(guò)選擇性抑制PREX1的cAMP依賴性激活，設(shè)計(jì)針對(duì)性的阻斷化合物［21］ 。除此以外，將PREX1結(jié)構(gòu)鎖定在緊密構(gòu)象的狀態(tài)以抑制表達(dá)也有可行性，可嘗試設(shè)計(jì)變構(gòu)調(diào)節(jié)劑以實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的構(gòu)象。

4 結(jié) 論

本研究證實(shí)了通過(guò)沉默PREX1表達(dá)，CHMp細(xì)胞的增殖能力、遷移能力和侵襲能力減弱。這為后續(xù)對(duì)PREX1更深入的研究、探索其影響犬乳腺腫瘤相關(guān)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

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（編輯 白永平）