摘 要： 艾美耳屬球蟲是畜牧生產(chǎn)中最常見的寄生蟲，引起雞、兔、羊、牛等養(yǎng)殖動(dòng)物嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病，影響動(dòng)物健康和養(yǎng)殖效益。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，研究者們先后建立了艾美耳球蟲的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定篩選和基因編輯等遺傳操作平臺，實(shí)現(xiàn)了艾美耳球蟲的基因過表達(dá)、基因敲除和基因編輯等操作，極大推進(jìn)了艾美耳球蟲基礎(chǔ)生物學(xué)和作為新型真核載體疫苗的研究進(jìn)展，但仍面臨一些挑戰(zhàn)。本文圍繞艾美耳球蟲遺傳操作平臺建立的關(guān)鍵技術(shù)、創(chuàng)新性設(shè)計(jì)、存在的技術(shù)瓶頸以及應(yīng)用前景進(jìn)行系統(tǒng)梳理和總結(jié)，為其他畜禽寄生蟲遺傳操作平臺的構(gòu)建提供參考，也為球蟲病新型防控制劑的研制提供新的思路。

關(guān)鍵詞： 艾美耳球蟲；遺傳操作；基因編輯；技術(shù)瓶頸；疫苗載體

中圖分類號： S852.723

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3362-12

收稿日期：2024-03-20

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（32273035;31902295）; 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新專項(xiàng)（Y2023QC10）

作者簡介：梁瑞英（1989-），女，山東菏澤人，助研助理研究員，主要從事動(dòng)物疫苗及分子免疫學(xué)研究，E-mail：liangruiying@caas.cn；索靜霞（1989-），女，河北張家口人，助理獸醫(yī)師，主要從事寄生蟲遺傳學(xué)與免疫學(xué)研究，E-mail：suojingxia415@126.com。梁瑞英和索靜霞為同等貢獻(xiàn)作者

通信作者：湯新明，主要從事動(dòng)物疫病病原學(xué)、免疫學(xué)、診斷和分子流行病學(xué)研究，E-mail：tangxinming@caas.cn

Genetic Manipulation of Eimeria： Platform Development， Application， and Perspective

LIANG" Ruiying1， SUO" Jingxia2， LIANG" Lin1， LIU" Xianyong2， DING" Jiabo1， SUO" Xun2， TANG

Xinming1*

（1.Key Laboratory of Animal Biosafety Risk Prevention and Control （North） amp; Key Laboratory of

Veterinary Biological Products and Chemical Drugs of MARA， Institute of Animal Sciences， Chinese

Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China;

2.National Key Laboratory of Veterinary

Public Health Security， National Animal Protozoa Laboratory， College of Veterinary Medicine， China

Agricultural University， Beijing 100193，" China）

Abstract： The genus of Eimeria parasite is the most common parasite in poultry and livestock， causing severe digestive system diseases in animals such as chickens， rabbits， sheep， and cattle， which affect animal health and the economic benefits of animal farming. With the rapid development of molecular biology technologies， researchers have established genetic manipulation platform for Eimeria， including transient transfection， stable selection， and gene editing. These techniques have realized gene overexpression， gene knockout， and gene editing in Eimeria， greatly advancing the understanding of Eimeria′s basic biology and its potential as a novel eukaryotic vector vaccine. However， challenges still remain in this field. This article systematically reviews and summarizes the key technologies， innovative designs， technical bottlenecks， and application prospects of Eimeria′s genetic manipulation platform， providing references for the establishment of genetic manipulation platform for other livestock parasites and offering new insights for the development of new control measures against coccidiosis.

Key words： Eimeria spp; genetic manipulation; gene editing; technical bottleneck; vaccine vector

*Corresponding author：" TANG Xinming，E-mail：tangxinming@caas.cn

頂復(fù)門原蟲的種類繁多，包括引起人和動(dòng)物嚴(yán)重疾病的病原，如瘧原蟲、弓形蟲、隱孢子蟲和艾美耳球蟲等，其中艾美耳球蟲感染引起的球蟲病是畜牧生產(chǎn)中最為常見、危害最為嚴(yán)重的寄生蟲病之一，尤以對規(guī)?；B(yǎng)殖業(yè)的危害最甚 ［1-2］。全球每年僅雞球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失超過120億美元；據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國每年抗球蟲藥物的花費(fèi)超過30億元人民幣 ［2-3］?？梢?，球蟲病的防控成效是制約養(yǎng)殖效益的關(guān)鍵因素之一。

防控雞球蟲病主要有兩種方法，一是藥物，二是疫苗 ［4］。前者的主要弊端在于抗藥性和藥物殘留，加之新藥研發(fā)周期長、成本高，藥物防控球蟲病面臨越來越大的挑戰(zhàn)?；诨盥涯覟橐呙缃M分開發(fā)的球蟲病疫苗用于雞球蟲病的防控已有近70年的歷史，能夠?yàn)殡u群提供良好的免疫保護(hù)力，但活卵囊疫苗仍然存在影響飼料報(bào)酬和疫苗免疫后管理不當(dāng)引發(fā)球蟲病的風(fēng)險(xiǎn) ［5，6］?？茖W(xué)合理的用藥方案以及安全性高、免疫原性優(yōu)的新型球蟲病疫苗是解決現(xiàn)有球蟲病防控手段的突破口。

艾美耳球蟲基因組約60 Mb，編碼8 000個(gè)左右的基因 ［7］。遺憾的是，受艾美耳球蟲體外培養(yǎng)困難、遺傳操作效率低等因素的限制，絕大部分基因的功能未知，制約了艾美耳球蟲藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和新型球蟲病疫苗的研究。國內(nèi)外學(xué)者經(jīng)過20余年的不斷探索和優(yōu)化，建立了艾美耳球蟲的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定篩選及基因編輯等球蟲基因功能研究的基礎(chǔ)技術(shù)平臺［8-9］。本文將圍繞艾美耳球蟲遺傳操作平臺的建立與優(yōu)化以及在球蟲基礎(chǔ)生物學(xué)和作為疫苗載體研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述（圖1），旨在梳理技術(shù)平臺建立中的技術(shù)瓶頸與解決方案，為其他真核生物或病原遺傳操作平臺的構(gòu)建提供借鑒。

1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染平臺的建立

1.1 轉(zhuǎn)染載體的設(shè)計(jì)

轉(zhuǎn)染是受體細(xì)胞在一定條件下主動(dòng)或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA或RNA片段而獲得新的表型的過程，其中質(zhì)粒是最常見、最穩(wěn)定的攜帶外源核酸物質(zhì)的載體。外源基因在真核受體細(xì)胞表達(dá)的最基本元件包括啟動(dòng)子及完整的開放閱讀框。啟動(dòng)子決定了基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)和水平以及蛋白的時(shí)空表達(dá)，是轉(zhuǎn)染載體設(shè)計(jì)和基因表達(dá)首要考慮的調(diào)控元件。艾美耳屬球蟲種類繁多，已報(bào)道的蟲種超過1 900余種，啟動(dòng)子調(diào)控外源基因表達(dá)的功能在艾美耳屬球蟲中具有保守性，如柔嫩艾美耳球蟲組蛋白4（EtHis4）、膜表面蛋白13（EtSAG13）、微線體蛋白2（EtMIC2）的啟動(dòng)子可以調(diào)控異源基因在堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲中的表達(dá) ［10-14］，同樣也可以在尼氏艾美耳球蟲、鐮型艾美耳球蟲、大型艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲等感染鼠、兔等哺乳動(dòng)物中的球蟲中調(diào)控異源基因的表達(dá) ［15-18］，但不同的是，部分啟動(dòng)子調(diào)控基因表達(dá)的規(guī)律在不同宿主間的球蟲存在差異，如EtSAG13啟動(dòng)子調(diào)控的報(bào)告基因在柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲等雞球蟲的未孢子化卵囊階段不表達(dá) ［11，19］，而在大型艾美耳球蟲、鐮型艾美耳球蟲等哺乳動(dòng)物球蟲的整個(gè)生活史階段均表達(dá) ［15，18］。啟動(dòng)子的功能在頂復(fù)門原蟲中同樣具有保守性，如弓形蟲微管蛋白（TgTublin）和膜表面蛋白1（TgSAG1）的啟動(dòng)子均可以調(diào)控報(bào)告基因在柔嫩艾美耳球蟲的表達(dá)；反之，EtHis4的啟動(dòng)子也可以調(diào)控報(bào)告基因在弓形蟲中的表達(dá) ［20］。啟動(dòng)子功能的保守性為針對不同種艾美耳球蟲進(jìn)行遺傳操作時(shí)提供了更多選擇，促進(jìn)了其他艾美耳球蟲遺傳操作平臺的搭建。

外源基因在艾美耳球蟲中的表達(dá)及在不同生活史的階段特異性表達(dá)受啟動(dòng)子的調(diào)控，表達(dá)形式即在重組球蟲不同亞細(xì)胞部位的空間分布則與異源蛋白的特性有關(guān)，同時(shí)也受調(diào)控序列的影響。如EtSAG13啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）在孢子化卵囊階段集中表達(dá)于子孢子的折光體部位，這可能與EYFP本身的特性有關(guān)，也可能蛋白的高表達(dá)和折光體的生物學(xué)功能相關(guān) ［11，21］。EYFP與EtHis4的核定位序列融合后則表達(dá)于子孢子的細(xì)胞核部位，而與EtMIC2蛋白或其信號肽融合后則表達(dá)于子孢子的微線體部位 ［22-23］，與弓形蟲致密顆粒蛋白8（TgGRA8）的信號肽融合后則呈分泌至帶蟲空泡處 ［11，23-24］。將熒光蛋白與膜蛋白的錨定序列（GPI）融合后熒光信號則集中表達(dá)于子孢子的細(xì)胞膜部位 ［25-26］。因此，利用遺傳操作技術(shù)對不同細(xì)胞分布的基因進(jìn)行功能研究時(shí)調(diào)控序列的選擇尤為重要。

基因的3′UTR（untranslated regions）對異源基因在重組球蟲表達(dá)的作用仍不清楚，可能與穩(wěn)定mRNA有關(guān)?；诏懺x的研究模型發(fā)現(xiàn)，缺少3′UTR的情況下，基因的表達(dá)量降低90%以上 ［27］。艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染載體的設(shè)計(jì)中關(guān)于3′UTR的考慮較少，常用的柔嫩艾美耳球蟲肌動(dòng)蛋白（EtActin）基因的3′UTR針對不同的啟動(dòng)子和基因均能發(fā)揮作用 ［12］。

1.2 報(bào)告基因的選擇

報(bào)告基因是受體細(xì)胞轉(zhuǎn)染后表達(dá)并產(chǎn)生易于檢測、且受體細(xì)胞原本不會產(chǎn)生的性狀的基因，一般具有如下特點(diǎn)：1）基因序列已知；2）表達(dá)產(chǎn)物在受體細(xì)胞中本不存在，即無背景；3）表達(dá)產(chǎn)物可以測定。把報(bào)告基因的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)控序列融合，或與其他目的基因融合，在調(diào)控序列的控制下進(jìn)行表達(dá)，通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)產(chǎn)物來“報(bào)告”目的基因的表達(dá)情況。

根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物特性和檢測方法的不同，報(bào)告基因可分為3種類型：一是可以直接進(jìn)行檢測，如熒光蛋白報(bào)告基因，在特定的激發(fā)波長下顯示明亮的熒光信號，已在艾美耳球蟲成功應(yīng)用的熒光蛋白基因有綠色熒光蛋白（GFP）、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白（EYFP）、堿性黃色熒光蛋白（mCitrine）、紅色熒光蛋白（RFP和mCherry） ［10，28］。二是受體細(xì)胞獲得特殊表型的報(bào)告基因，如藥物抗性基因。轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞在特定藥物的壓力下存活與增殖，經(jīng)過連續(xù)培養(yǎng)將轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選和富集，如表達(dá)弓形蟲二氫葉酸還原酶突變體（TgDHFR-m2m3）基因的艾美耳球蟲可以利用乙胺嘧啶藥物進(jìn)行篩選 ［29-30］。抗球蟲藥物抗藥性基因突變位點(diǎn)的解析，如常山酮、地克珠利、癸氧喹酯等藥物抗性基因，為艾美耳球蟲遺傳操作報(bào)告基因提供了更多的選擇 ［31-35］。三是基因表達(dá)產(chǎn)物與其他組分發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生能夠被檢測的信號 ［36］，如β-半乳糖苷酶，重組艾美耳球蟲表達(dá)的β-半乳糖苷酶能夠催化β-半乳糖的水解，與5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-ga1）反應(yīng)生成黃色的產(chǎn)物鄰硝基酚，可以進(jìn)行定性或定量檢測，這是證明艾美耳球蟲能夠進(jìn)行遺傳操作的最早報(bào)道的報(bào)告基因 ［37］。艾美耳球蟲難以進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)瓶頸制約了β-半乳糖苷酶作為報(bào)告基因的應(yīng)用，更多的則側(cè)重于熒光蛋白和藥物抗性基因作為報(bào)告基因，有時(shí)也將二者聯(lián)合使用，提升重組球蟲的篩選效率 ［14，30，38］。

1.3 受體細(xì)胞的選擇

艾美耳球蟲生活史復(fù)雜，不同生活史階段存在多種形態(tài)的細(xì)胞類型，如子孢子、裂殖子（不同蟲種裂殖生殖的代次不同，每代裂殖生殖均可產(chǎn)生不同數(shù)量的裂殖子）、雌雄配子、合子、未孢子化卵囊和孢子化卵囊（內(nèi)含4個(gè)孢子囊，每個(gè)孢子囊含2個(gè)子孢子）。目前已報(bào)道的作為受體細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染的類型有子孢子、第2代裂殖子、未孢子化卵囊和孢子囊（表1）。其中子孢子作為轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞最為常見，如柔嫩艾美耳球蟲、堆型艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲等雞球蟲 ［10，14，19，29，32，37，39-40］，大型艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲、中型艾美耳球蟲和斯氏艾美耳球蟲等兔球蟲 ［15-16］，鐮型艾美耳球蟲等鼠球蟲 ［18，41］。裂殖子作為受體細(xì)胞僅在毒害艾美耳球蟲中有報(bào)道 ［13，42］，為其他球蟲轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞的選擇提供了參考 ［13］?；诼涯易鳛槭荏w細(xì)胞的轉(zhuǎn)染一直是球蟲遺傳操作技術(shù)領(lǐng)域的瓶頸問題，已證實(shí)利用基因槍可以將外源質(zhì)粒輸送至巨型艾美耳球蟲的未孢子化卵囊的原生質(zhì)，但報(bào)告基因無法表達(dá) ［43］，這可能與基因槍轉(zhuǎn)染對球蟲卵囊的損傷較大抑制孢子生殖有關(guān)，也可能與啟動(dòng)子的選擇等有關(guān)。盡管如此，基于卵囊作為受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染體系的建立是值得努力的科研方向 ［44］。基于孢子囊作為受體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染已在鼠球蟲上成功實(shí)施，為其他蟲種遺傳操作受體細(xì)胞的選擇提供了新的借鑒 ［45］。

1.4 轉(zhuǎn)染體系的優(yōu)化

轉(zhuǎn)染過程涉及的遺傳物質(zhì)載體、受體細(xì)胞、緩沖液等體積和配比以及轉(zhuǎn)染方式均是影響艾美耳球蟲遺傳操作效率的重要因素。目前，艾美耳球蟲常用的轉(zhuǎn)染方法為物理轉(zhuǎn)染法，即電擊法和基因槍法。電擊法轉(zhuǎn)染艾美耳球蟲子孢子時(shí)，質(zhì)粒、PCR片段均可作為攜帶遺傳物質(zhì)的載體，用量一般在25 μg左右，對應(yīng)轉(zhuǎn)染的子孢子數(shù)量為5×106個(gè)，按轉(zhuǎn)染DNA片段大小為5 000 bp計(jì)算，每個(gè)子孢子對應(yīng)106拷貝的DNA片段；轉(zhuǎn)染緩沖液為Cytomix，體積為800 μL ［46］；電擊條件設(shè)置1.5 kV、25 μF、方波參數(shù)（以伯樂電轉(zhuǎn)儀為例），上述轉(zhuǎn)染體系下的轉(zhuǎn)染效率僅有十萬分之一 ［47-48］。但是，轉(zhuǎn)染體系中加入限制性內(nèi)切酶的情況下，轉(zhuǎn)染效率可以提升200倍左右 ［49］，限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染同樣也可以顯著提升弓形蟲、瘧原蟲的轉(zhuǎn)染效率，但作用機(jī)制仍不清楚，推測可能是由于限制性內(nèi)切酶在受體細(xì)胞基因組產(chǎn)生切口，利于外源DNA片段的整合。Lonza專利Nucleofector的核轉(zhuǎn)染技術(shù)，通過電穿孔儀器的整合、緩沖液和電轉(zhuǎn)程序的優(yōu)化，可以將外源核酸物質(zhì)轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)并跨過核膜直接進(jìn)入細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)染效率顯著提升，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)下，艾美耳球蟲的適宜轉(zhuǎn)染程序?yàn)閁-033 ［50］。Nucleofector的系統(tǒng)和設(shè)備在持續(xù)更新，基于該系統(tǒng)的艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染效率有望取得突破。

2 穩(wěn)定篩選平臺的建立

2.1 重組球蟲的獲得

根據(jù)外源基因在受體細(xì)胞中表達(dá)時(shí)間的長短可將轉(zhuǎn)染可分為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染2種。艾美耳球蟲子孢子可入侵雞腎原代細(xì)胞、牛腎細(xì)胞系（MDBK）、非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）等細(xì)胞并短暫發(fā)育，轉(zhuǎn)染后的子孢子接種上述細(xì)胞易于進(jìn)行報(bào)告基因的觀察，是進(jìn)行啟動(dòng)子、報(bào)告基因篩選與轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化常用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng) ［24，51］。但艾美耳球蟲體外培養(yǎng)難以完成生活史，獲得大量遺傳操作的重組球蟲進(jìn)行后續(xù)研究的前提是獲得卵囊階段的球蟲用于動(dòng)物體內(nèi)的連續(xù)傳代，這需要外源基因穩(wěn)定整合至球蟲基因組中，也稱作穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。根據(jù)受體細(xì)胞類型、寄生部位等不同采用不同的接種方式獲得重組球蟲卵囊，如柔嫩艾美耳球蟲、和緩艾美耳球蟲等寄生于盲腸部位，轉(zhuǎn)染后的子孢子通過泄殖腔接種即可獲得成功；毒害艾美耳球蟲裂殖生殖存在部分移行現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染的裂殖子也可以經(jīng)過泄殖腔接種獲得重組毒害艾美耳球蟲的卵囊（表1）。需要注意的是，柔嫩艾美耳球蟲與毒害艾美耳球蟲由于毒力較強(qiáng)，接種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格控制接種劑量，否則導(dǎo)致接種雞的死亡，無法獲得重組球蟲卵囊。堆型艾美耳球蟲寄生于雞的十二指腸，無法通過泄殖腔接種，轉(zhuǎn)染的子孢子經(jīng)翅下靜脈接種也可獲得重組球蟲卵囊，但翅下靜脈接種尤其是雛雞的翅下靜脈接種需要一定的技術(shù)嫻熟度方可保證接種成功；大型艾美耳球蟲、腸艾美耳球蟲等兔球蟲則采用手術(shù)的方式接轉(zhuǎn)染的子孢子接種至十二指腸部位亦可獲得重組球蟲卵囊（表1）。也有學(xué)者采用先給動(dòng)物灌服少量的堿性溶液中和胃酸后將子孢子經(jīng)口接種，此種操作方式的穩(wěn)定性低于泄殖腔、靜脈和手術(shù)等接種途徑 ［50］。但如果實(shí)現(xiàn)基于卵囊的轉(zhuǎn)染，直接經(jīng)口接種獲得重組球蟲卵囊，將是球蟲遺傳操作領(lǐng)域里程碑式的技術(shù)突破。

2.2 篩選效率的優(yōu)化

艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率一般在萬分之一到千分之一之間，獲得的第一代的重組球蟲卵囊無法滿足試驗(yàn)需求，需要在動(dòng)物體內(nèi)經(jīng)過連續(xù)傳代篩選提升重組球蟲的比例，篩選效率至關(guān)重要 ［49］?；讦?半乳糖苷酶報(bào)告基因的柔嫩艾美耳球蟲轉(zhuǎn)染早在1998年進(jìn)行了報(bào)道 ［37］，由于缺少基于該報(bào)告基因的篩選體系，艾美耳球蟲的遺傳操作進(jìn)程停滯了近10年的時(shí)間 ［10］。隨著熒光蛋白報(bào)告基因在艾美耳球蟲遺傳操作的應(yīng)用以及基于熒光蛋白的流式細(xì)胞分選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了重組球蟲的有效篩選，經(jīng)過5～7代的連續(xù)篩選即可獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光蛋白的重組球蟲 ［22，29］。通過藥物篩選和流式分選的雙重壓力選擇顯著提升了重組球蟲的篩選效率，可壓縮篩選時(shí)間一半以上 ［14，32］。隨著常用抗球蟲藥物抗藥基因突變位點(diǎn)的解析，為重組球蟲的篩選提供了更多的組合和優(yōu)化方案。另一方面，前期的研究結(jié)果顯示，重組球蟲孢子化卵囊的4個(gè)孢子囊中報(bào)告基因陽性的孢子囊數(shù)量有1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)和4個(gè)，也就是并非所有的報(bào)告基因陽性的卵囊釋放的孢子囊呈100%陽性，這降低了基于卵囊的流式分選獲得重組球蟲的效率 ［50］。近期的研究表明，基于孢子囊的流式分選策略在提升重組球蟲的篩選效率方面顯著優(yōu)于基于卵囊的流式分選策略。

3 重組球蟲的系統(tǒng)鑒定

經(jīng)遺傳操作的重組球蟲的穩(wěn)定性是進(jìn)行生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)特性研究的基礎(chǔ)，這需要對異源基因在重組球蟲的穩(wěn)定表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。國內(nèi)外研究學(xué)者在基因組、轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平層面建立了系列的異源基因表達(dá)的鑒定體系。如利用染色體步移技術(shù)（Genome Walking）、DNA印跡（Southern blot）技術(shù)鑒定異源基因片段在重組球蟲基因組的插入位點(diǎn)和插入拷貝數(shù) ［11，52-53］。隨著高通量測序技術(shù)的應(yīng)用，也可以利用二代測序技術(shù)分析異源基因的插入位點(diǎn) ［54］。如果是利用CRISPR/Cas9等基因編輯技術(shù)進(jìn)行的基因組定點(diǎn)整合，利用PCR擴(kuò)增和測序也能夠準(zhǔn)確的分析基因組插入位點(diǎn) ［55-56］。在轉(zhuǎn)錄層面進(jìn)行外源基因表達(dá)的測定是一項(xiàng)有挑戰(zhàn)性的工作，因?yàn)樵谶M(jìn)行遺傳操作時(shí)，一般僅選擇表達(dá)外源基因的基因編碼區(qū)，不包含內(nèi)含子，需要提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)盡可能的去除DNA的影響。與轉(zhuǎn)錄水平的鑒定相比，蛋白表達(dá)水平的鑒定在重組球蟲更易操作和實(shí)現(xiàn)。利用熒光蛋白作為報(bào)告基因與外源基因融合表達(dá)，通過檢測熒光信號的表達(dá)可以指示外源基因的表達(dá) ［57］。另一方面，常用的蛋白標(biāo)簽如Flag、HA、Ty及其對應(yīng)的商品化抗體均可應(yīng)用于重組球蟲異源基因表達(dá)的鑒定 ［12，55］；在抗體特異性不佳的情況下，利用質(zhì)譜分析技術(shù)也能有效對重組球蟲表達(dá)的異源蛋白進(jìn)行檢測 ［12］。

4 基于遺傳操作技術(shù)研究艾美耳球蟲的生物學(xué)特性

遺傳操作技術(shù)是研究病原生物學(xué)的基礎(chǔ)，在艾美耳球蟲遺傳操作平臺建立的過程中，利用熒光報(bào)告基因的蟲株對艾美耳球蟲的生活史進(jìn)行觀察顯示出突出的優(yōu)勢。表達(dá)熒光蛋白的重組球蟲在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下進(jìn)行裂殖生殖，是研究不同代次裂殖子轉(zhuǎn)化的模型 ［51］。利用表達(dá)熒光蛋白報(bào)告基因的重組球蟲進(jìn)行腸道膜片觀察，能夠清晰的觀察不同發(fā)育階段蟲體的形態(tài) ［22，55］；在觀察有性生殖階段的蟲體形態(tài)時(shí)，更是清晰地檢測到雄配子的鞭毛形態(tài)，這是組織切片和普通腸道抹片難以檢測到的結(jié)果 ［39，58］。觀察艾美耳球蟲體外孢子生殖過程中原生質(zhì)的變化以及孢子囊壁的形成，表達(dá)熒光蛋白的重組球蟲同樣具有顯著優(yōu)勢 ［15，45］。

艾美耳球蟲基因編輯技術(shù)的建立為從分子水平研究球蟲重要生物學(xué)特性的機(jī)理提供了可能 ［55-56，59］。通過對艾美耳球蟲發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的敲除和擴(kuò)增篩選，驗(yàn)證出33個(gè)AP2家族的轉(zhuǎn)錄因子中有10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子是在艾美耳球蟲發(fā)育過程中的必須基因，為后續(xù)研究AP2轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ) ［55］。同樣，也有報(bào)道對單個(gè)AP2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因編輯，研究其在艾美耳球蟲發(fā)育中的作用 ［60］。

球蟲抗藥性是世界性難題，挖掘抗藥性基因突變位點(diǎn)對指導(dǎo)抗球蟲藥物的科學(xué)使用和新藥研發(fā)具有重要意義。遺傳操作技術(shù)是驗(yàn)證藥物抗性基因突變位點(diǎn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。遺傳學(xué)和多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用為分析抗球蟲藥物的潛在突變位點(diǎn)提供了有力工具 ［34，61-62］，只有同時(shí)滿足：（1）利用遺傳操作技術(shù)將抗性突變位點(diǎn)基因?qū)胫撩舾邢x株而獲得藥物抗性；（2）利用基因編輯技術(shù)將抗性突變位點(diǎn)回復(fù)，抗性蟲株恢復(fù)藥物的敏感性，此類突變位點(diǎn)才是藥物抗性的突變位點(diǎn)?；谏鲜鲈?，常山酮等藥物的抗性突變位點(diǎn)已被解析，為其他抗球蟲藥物抗性位點(diǎn)的驗(yàn)證提供了依據(jù)和范例 ［31-32］。

5 基于遺傳操作技術(shù)開發(fā)新型疫苗載體

艾美耳球蟲遺傳操作平臺很大程度上是在開發(fā)艾美耳球蟲作為疫苗載體的科學(xué)設(shè)想與需求下建立與優(yōu)化的。比如，為了驗(yàn)證艾美耳球蟲作為疫苗載體可同時(shí)表達(dá)多種異源抗原基因，即具有基因組容量大的優(yōu)勢，研究者分別采用了不同的策略實(shí)現(xiàn)了單株重組球蟲穩(wěn)定表達(dá)多種異源基因：（1）分別構(gòu)建表達(dá)多種基因的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，進(jìn)行多轉(zhuǎn)染載體的共同轉(zhuǎn)染 ［29］；（2）構(gòu)建表達(dá)多種基因表達(dá)框的串聯(lián)質(zhì)粒，進(jìn)行單轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染 ［22］；（3）構(gòu)建P2A連接的多基因單表達(dá)框質(zhì)粒，進(jìn)行單轉(zhuǎn)染載體的轉(zhuǎn)染 ［11，63］；（4）分別構(gòu)建表達(dá)多種基因、具有不同篩選標(biāo)記的重組球蟲，利用遺傳雜交獲得表達(dá)多外源基因的遺傳重組球蟲 ［40］。另外，為了研究不同性質(zhì)病原抗原在重組球蟲的表達(dá)分布對免疫應(yīng)答強(qiáng)度和類型的影響，篩選了多種調(diào)控序列實(shí)現(xiàn)異源基因在重組球蟲不同亞細(xì)胞部位的表達(dá)（見“1.1”轉(zhuǎn)染載體的設(shè)計(jì)）。基于熒光蛋白作為模式抗原的研究模型發(fā)現(xiàn)，分泌型的抗原激發(fā)宿主產(chǎn)生更強(qiáng)的抗體應(yīng)答和特異性的淋巴細(xì)胞增殖，為重組球蟲疫苗載體的設(shè)計(jì)與優(yōu)化提供了參考 ［64］。

目前已報(bào)道了多株表達(dá)異源抗原基因的重組球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生的免疫保護(hù)力：（1）表達(dá)寄生蟲的保護(hù)性抗原：表達(dá)巨型艾美耳球蟲保護(hù)性抗原（組）的重組柔嫩艾美耳球蟲免疫雞群后，宿主具有抵抗2種艾美耳球蟲感染的免疫保護(hù)力，且免疫程序優(yōu)化后，免疫保護(hù)力水平顯著提升，為構(gòu)建具備交叉免疫保護(hù)力的新型球蟲病疫苗蟲株奠定了基礎(chǔ) ［21，65-67］；表達(dá)弓形蟲膜表面抗原1（TgSAG1）的重組球蟲免疫雞和小鼠后均能提供針對弓形蟲RH株的部分免疫保護(hù)力 ［68］。（2）表達(dá)細(xì)菌的保護(hù)性抗原：表達(dá)空腸彎曲桿菌CjaA抗原的重組柔嫩艾美耳球蟲為免疫雞群提供86%的針對空腸彎曲桿菌感染的保護(hù)力 ［69］。（3）表達(dá)病毒的保護(hù)性抗原：表達(dá)傳染性法氏囊病病毒VP2（IBDV VP2）和傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白I（gI）的重組柔嫩艾美耳球蟲激發(fā)宿主產(chǎn)生異源抗原特異性的抗體應(yīng)答 ［28］；利用商品化的IDEXX抗體檢測試劑盒，能夠檢測到IBDV VP2與堆型艾美耳球蟲微線體蛋白2融合表達(dá)的重組球蟲激發(fā)宿主的特異性抗體應(yīng)答，且攻毒感染后的法氏囊病變顯著減輕 ［12］，促進(jìn)了基于免疫學(xué)、分子生物學(xué)及遺傳學(xué)等多種先進(jìn)理論和技術(shù)的整合進(jìn)行重組球蟲疫苗載體的設(shè)計(jì)與優(yōu)化。

6 艾美耳球蟲遺傳操作面臨的技術(shù)瓶頸

艾美耳球蟲的遺傳操作平臺經(jīng)過國內(nèi)外學(xué)者近30年的持續(xù)努力克服了多項(xiàng)技術(shù)瓶頸，取得了一定的進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，限制了艾美耳球蟲基礎(chǔ)生物學(xué)和應(yīng)用的研究。例如：1）缺少高效的體外培養(yǎng)體系，增加了遺傳操作的困難和實(shí)驗(yàn)成本，更限制了遺傳操作技術(shù)在豬、牛、羊等大動(dòng)物球蟲研究領(lǐng)域的應(yīng)用。國外學(xué)者建立了基于豬腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)豬等孢球蟲子孢子到成熟裂殖子的體外培養(yǎng)體系，在此基礎(chǔ)上，收集豬腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)裂殖子，利用Advanced DMEM/F-12（Gibco）培養(yǎng)基可以實(shí)現(xiàn)無宿主細(xì)胞的等孢球蟲有性生殖階段發(fā)育，檢測到卵囊的形成［70］。等孢球蟲的體外培養(yǎng)體系對艾美耳球蟲的體外培養(yǎng)研究具有借鑒意義。2）艾美耳球蟲的轉(zhuǎn)染效率與弓形蟲等相比仍然偏低，對其進(jìn)行系統(tǒng)性優(yōu)化，包括轉(zhuǎn)染體系及配比、緩沖液、受體細(xì)胞的選擇等仍是需要加強(qiáng)的研究領(lǐng)域。3）重組球蟲的克隆群體篩選效率低。目前認(rèn)為基于單孢子囊的子代群體是克隆群體，由于動(dòng)物的免疫反應(yīng)加之單孢子囊接種過程的不確定性，增加了獲得單克隆群體的難度 ［11，29，53］。4）篩選基因相對缺乏。一是已有部分藥物適用于體外培養(yǎng)體系，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)的成本昂貴；二是盡管針對常用抗球蟲藥物的抗性突變位點(diǎn)逐漸被解析，但驗(yàn)證工作仍需要時(shí)間 ［31，61，71］。上述技術(shù)瓶頸，限制了部分高效的遺傳操作技術(shù)在艾美耳球蟲相關(guān)研究中的應(yīng)用，亟需取得突破。

7 展 望

基于活卵囊組分開發(fā)的球蟲病疫苗在臨床應(yīng)用中仍然存在一定的副作用，利用遺傳操作技術(shù)對現(xiàn)有球蟲病疫苗蟲株進(jìn)行改造將是新型球蟲病疫苗研發(fā)的重要方向。一是構(gòu)建表達(dá)異源蟲種保護(hù)性抗原的重組球蟲，開發(fā)具備交叉免疫保護(hù)力的疫苗蟲株，消減球蟲病活疫苗中的組分，尤其是致病性強(qiáng)的蟲種的含量，提升疫苗的安全性 ［21，65-66］，艾美耳球蟲保護(hù)性抗原的發(fā)掘和鑒定以及抗原在重組球蟲的表達(dá)形式是需要突破的瓶頸。二是構(gòu)建表達(dá)分子佐劑的重組球蟲，提升部分蟲種的免疫原性，降低免疫劑量，提升疫苗的安全性 ［14，58，63］，這需要對分子佐劑的表達(dá)時(shí)空特性進(jìn)行精準(zhǔn)設(shè)計(jì)。三是挖掘孢子生殖發(fā)育調(diào)控的核心基因，構(gòu)建孢子生殖發(fā)育缺陷的疫苗蟲株，疫苗免疫后排出的子代卵囊孢子生殖顯著降低，雞群攝入高劑量的疫苗子代孢子化卵囊的風(fēng)險(xiǎn)減少，降低疫苗免疫的副作用 ［60］。

頂復(fù)門原蟲成員眾多，生活史復(fù)雜，而艾美耳球蟲在單一宿主完成整個(gè)生活史，是研究發(fā)育調(diào)控尤其是有性生殖發(fā)育調(diào)控機(jī)制的理想模型。通過構(gòu)建有性生殖階段特異性表達(dá)熒光蛋白的蟲株，結(jié)合流式分選和組學(xué)分選技術(shù)，篩選一批有性生殖階段的調(diào)控基因，揭示其生物學(xué)功能和機(jī)制，將對弓形蟲等其他頂復(fù)門原蟲有性生殖調(diào)控機(jī)制的研究提供參考。另一方面，經(jīng)過對早期排出卵囊的連續(xù)壓力篩選，能夠獲得潛隱期顯著縮短的艾美耳球蟲早熟系，且具有遺傳穩(wěn)定性，是弱毒活疫苗開發(fā)最主要的技術(shù)原理 ［72-73］。早熟性狀的穩(wěn)定性、遺傳材料容易獲得、繁殖周期短等艾美耳球蟲的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性具有作為低等生物發(fā)育調(diào)控等遺傳學(xué)研究的新型模式生物的前景。

隨著遺傳操作尤其是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯平臺的建立和不斷優(yōu)化，艾美耳球蟲的生物學(xué)、免疫學(xué)特性研究將實(shí)現(xiàn)新的飛躍。不僅為球蟲病防控的新型制劑研制奠定了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，也將推進(jìn)艾美耳球蟲作為研究有性生殖、早熟發(fā)育等重要生物學(xué)和遺傳學(xué)機(jī)制的新型模式生物研究。

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（編輯 白永平）