摘 要： "旨在通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)評(píng)估不同單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（single cell whole genome amplification， scWGA）體系對(duì)牛微量血液基因組DNA的擴(kuò)增效果，建立微量DNA全基因組擴(kuò)增體系。本研究分別采用MDA（multiple displacement amplification）和MALBAC（multiple annealing and looping-based amplification cycles）兩種scWGA體系對(duì)華西牛1 ng血液基因組DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，隨后基于兩種體系的擴(kuò)增產(chǎn)物以及原始未稀釋血液DNA構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，利用DNBSEQ-T7RS測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全基因組測(cè)序（whole genome sequencing，WGS），通過(guò)比較擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小、濃度、總質(zhì)量評(píng)估擴(kuò)增效率，通過(guò)分析GC含量、測(cè)序覆蓋度、基因分型一致率、基因型檢出率等評(píng)估兩種體系的擴(kuò)增效果。結(jié)果顯示，MDA體系的擴(kuò)增產(chǎn)物片段大于MALBAC體系（8 kb vs.0.2～2 kb），產(chǎn)物濃度和總質(zhì)量顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05）。基于測(cè)序數(shù)據(jù)，1×和5×測(cè)序深度下，MDA體系的基因組覆蓋度顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05），此外，MDA體系的分型一致率、檢出率顯著高于MALBAC體系，而等位基因缺失率、假陽(yáng)性率顯著低于MALBAC體系（Plt;0.05）。綜上，本研究揭示了MDA和MALBAC兩種擴(kuò)增體系基于華西牛1 ng血液基因組DNA擴(kuò)增的體系特點(diǎn)，為改進(jìn)現(xiàn)有華西牛胚胎基因組選擇中的關(guān)鍵擴(kuò)增技術(shù)提供理論依據(jù)，促進(jìn)華西牛遺傳育種進(jìn)展。

關(guān)鍵詞： 全基因組選擇擴(kuò)增；MDA；MALBAC；微量DNA擴(kuò)增體系

中圖分類號(hào)： S823.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3436-10

收稿日期：2023-12-11

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間重點(diǎn)專項(xiàng)（2022YFE0100200）；國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)際合作項(xiàng)目（32161143032）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部和財(cái)政部資助：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-36）；國(guó)家家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源庫(kù)、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS06）

作者簡(jiǎn)介：牛一凡（1999-），男，河北邯鄲人，碩士生，主要從事動(dòng)物繁殖研究，E-mail： nyf.niuyifan@qq.com

通信作者：馬友記，主要從事綿、山羊繁育與疾病防治的研究，E-mail：yjma@gsau.edu.cn；趙學(xué)明，主要從事家畜胚胎生物技術(shù)的研究，E-mail：zhaoxueming@caas.cn

Evaluation of the Effect of Different Single Cell Whole Genome Amplification Systems

on the Amplification of Bovine Trace Blood DNA

NIU" Yifan1，2， LI" Chongyang2， YANG" Baigao2， ZHANG" Peipei2， ZHANG" Hang2， FENG" Xiaoyi2，

CAO" Jianhua2， YU" Zhou2， MA" Youji1*， ZHAO" Xueming2*

（1.College of Animal Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，

China;

2.Institute of Animal Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，

China）

Abstract：" The purpose of this paper was to evaluate the amplification effect of different single cell whole genome amplification （scWGA） systems on bovine trace blood genomic DNA by next-generation sequencing， and to establish a trace DNA whole genome amplification system. In this study， the whole genome of 1 ng blood genomic DNA of Huaxi cattle was amplified by MDA （multiple displacement amplification） and MALBAC （multiple annealing and looping-based amplification cycles） scWGA systems， and then the sequencing library was constructed based on the amplification products of the two systems and the original undiluted blood DNA. The whole genome sequencing （WGS） was usedperformed using the DNBSEQ-T7RS sequencing platform. The amplification efficiency was evaluated by comparing the fragment′s size， concentration and total mass of the amplified products. The amplification effects of the two systems were evaluated by analyzing GC content， average depth， consistent rate of typing and call rate. The results showed that the fragment of the amplified product in MDA system was larger than that in MALBAC system （8 kb vs.0.2-2 kb）， the concentration and total mass of the product were significantly higher than those in MALBAC system （Plt;0.05）. Based on the sequencing data， the genome coverage of MDA system was significantly higher than that of MALBAC system at 1×and 5×sequencing depth（Plt;0.05）. In addition， the consistency of typing rate and call rate of MDA system were significantly higher than MALBAC system， while the allele drop rate and 1 positive rate of MALBAC system were significantly lower than MALBAC system（Plt;0.05）. In summary， this study revealed that the characteristics of two amplification systems of MDA and MALBAC were based on the characteristics of DNA amplification of Huaxi cattle 1 ng blood genome， which provided a theoretical basis for improving the key amplification techniques in Huaxi cattle embryo genome selection and promoting the progress of Huaxi cattle genetics and breeding.

Key words： whole genome sequencingamplification; MDA; MALBAC; trace DNA amplification system

*Corresponding authors： 英文通信作者M(jìn)A Youji，E-mail：yjma@gsau.edu.cn; ZHAO Xueming， E-mail：zhao-xueming@caas.cn

全基因組擴(kuò)增（whole genome amplification，WGA）技術(shù)在獲取家畜基因組DNA信息中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。該技術(shù)最早出現(xiàn)于1992年，伴隨著該技術(shù)的發(fā)展，可以做到無(wú)偏差地?cái)U(kuò)增微量DNA或單個(gè)細(xì)胞的全基因組。該技術(shù)可用于測(cè)定家畜基因組序列，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性（single-nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)［1］和計(jì)算估計(jì)育種值［2］。目前，在家畜上常用的WGA技術(shù)體系包括多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification， MDA）、多次退環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（multiple annealing and looping-based amplification cycles， MALBAC）［3-4］。

MDA擴(kuò)增體系由傳統(tǒng)WGA技術(shù)改進(jìn)而形成［5］，是目前最受歡迎的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［2，6-8］。MDA的擴(kuò)增步驟包括：首先在30℃條件，隨機(jī)6堿基引物與模板DNA在多個(gè)位點(diǎn)退火結(jié)合，再在phi29 DNA聚合酶的作用下，發(fā)生鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，被置換產(chǎn)生的單鏈產(chǎn)物又成為新的復(fù)制模板，形成超分支結(jié)構(gòu)，如此循環(huán)，最后產(chǎn)生片段大小＞10 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物［9-10］。這種體系的優(yōu)點(diǎn)是錯(cuò)誤率和擴(kuò)增偏差低［11-14］、擴(kuò)增效率和保真度高［4，15-17］、擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)［12］，但是由于該體系屬于恒溫?cái)U(kuò)增，所以會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增［4，15，18-19］和嵌合體［20-21］的形成。

MALBAC的擴(kuò)增體系結(jié)合了PCR和MDA兩種技術(shù)體系，具有更高的均勻性［22］、特異性和可重復(fù)性［4，13］。MALBAC體系的擴(kuò)增步驟先是隨機(jī)引物在0℃下與模板結(jié)合；再通過(guò)具有鏈置換活性的DNA聚合酶在65℃下生成半擴(kuò)增子；然后半擴(kuò)增子在94℃退火產(chǎn)生全擴(kuò)增子；全擴(kuò)增子自環(huán)化可以避免在第一時(shí)期PCR中進(jìn)行反應(yīng)，而在第二時(shí)期PCR中作為靶標(biāo)［13，23］。最后，MALBAC體系的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為0.2～2 kb［24］。這種體系的優(yōu)點(diǎn)是基因組覆蓋度優(yōu)于MDA，操作較為簡(jiǎn)單［25］，擴(kuò)增均勻性好［26-27］，等位基因缺失（allele dropout，ADO）率較低［28］；但是該體系所使用的Bst和Taq聚合酶不能高保真［29］，在DNA模板量少時(shí)，假陽(yáng)性率偏高［11，30-31］。

華西牛是我國(guó)最新培育的肉牛品種，具有生長(zhǎng)速度快、屠宰率和凈肉率高、繁殖性能好、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)［32-33］。目前，華西牛群體規(guī)模亟需擴(kuò)大，胚胎基因組選擇技術(shù)可實(shí)現(xiàn)華西牛在胚胎階段的優(yōu)生優(yōu)育選擇，大幅度加快育種選擇進(jìn)展和優(yōu)質(zhì)群體擴(kuò)繁。因此，本試驗(yàn)采用兩種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增體系對(duì)華西牛母牛微量血液基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，然后同原始血液DNA一起進(jìn)行二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS），來(lái)比較不同的單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增體系對(duì)于微量牛血液DNA的擴(kuò)增效率，為改進(jìn)現(xiàn)有牛微量血液基因組DNA擴(kuò)增體系提供理論依據(jù)，為開(kāi)發(fā)華西牛胚胎全基因組擴(kuò)增體系提供參照。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所需牛血液均來(lái)自北京安伯胚胎生物技術(shù)有限公司石家莊肉牛良種場(chǎng)，2023年1月份采集的同一飼養(yǎng)管理?xiàng)l件下的3頭母牛，母牛品種均為華西牛。用5 mL注射器（換為9號(hào)針頭）從牛號(hào)為A、B和C的3頭母牛尾根處采集適量靜脈血，注射進(jìn)抗凝血采樣管，冰袋運(yùn)輸，-20℃冰箱保存。單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增體系選擇多重置換擴(kuò)增（MDA）體系和多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（MALBAC）體系。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 母牛血液基因組DNA的提取、質(zhì)檢

牛血液室溫下解凍后，移液槍吸取1 mL按照常規(guī)SDS法提取血液DNA，提取出的100 μL牛血液DNA于-20℃保存，冰袋運(yùn)輸。采用NanoDrop 2000核酸蛋白測(cè)定儀進(jìn)行DNA濃度和純度的測(cè)定，采用BIO-RAD電泳儀和 DYPC-31BN電泳槽放入 0.8%瓊脂糖凝膠，電泳液采用1×TAE（天津康普森），在點(diǎn)樣孔中加入100 ng DNA樣品和3 μL Loading Buffer，Marker點(diǎn)樣孔中加入3 μL Trans 2000 plus II（TaKaRa，上海），電壓選擇170 V，電泳25 min，在Newbio Gi-1凝膠成像設(shè)備中拍攝膠圖。剩余樣品放入-20℃ 冰箱，Loading Buffer與Marker放入4℃冰箱保存。

1.2.2 牛微量血液基因組DNA擴(kuò)增

測(cè)定濃度后的牛血液DNA采用TE緩沖液進(jìn)行稀釋（取1 μL稀釋至1 ng·μL-1），取稀釋后的牛血液DNA 1 μL（即1 ng），再分別根據(jù)兩種體系制造商的要求進(jìn)行1 ng血液基因組DNA的全基因組擴(kuò)增。MDA體系操作步驟：在離心管中用無(wú)核酸酶水將血液基因組DNA補(bǔ)充到2.5 μL，加入2.5 μL反應(yīng)緩沖液D1后室溫孵育3 min，再加入5 μL停止液，最后加入由8 μL無(wú)核酸酶水、30 μL緩沖液和2 μL DNA聚合酶組成的40 μL反應(yīng)混合液，在30℃孵育3 h后，將酶在65℃下滅活5 min。MALBAC體系操作步驟：將5.5 μL裂解混合液加入盛有1 μL血液基因組DNA的PCR管中，反應(yīng)條件為50℃ 50 min 和80℃ 100 min孵育。再加入30 μL預(yù)擴(kuò)增混合液，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，然后運(yùn)行8次預(yù)擴(kuò)增循環(huán)（每次循環(huán)：20 ℃ 40 s，30 ℃ 40 s，50 ℃ 30 s，60℃ 30 s，70 ℃ 4 min，95 ℃ 20 s，58 ℃ 10 s），然后加入30 μL擴(kuò)增混合液，反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min，并運(yùn)行14次PCR擴(kuò)增循環(huán)（每次循環(huán)： 94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min）。MALBAC體系步驟中描述需要設(shè)置陰性對(duì)照（DNA換為無(wú)核酸酶水即為陰性對(duì)照）。

1.2.3 牛微量血液基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)檢

采用兩種擴(kuò)增體系分別擴(kuò)增1 ng母牛血液DNA，同時(shí)采用原始血液DNA樣本進(jìn)行測(cè)序作為原始對(duì)照（NC組）。牛血液微量基因組DNA擴(kuò)增出的文庫(kù)DNA質(zhì)檢同血液基因組DNA的質(zhì)檢，但紫外分光光度計(jì)采用Qubit。

1.2.4 牛微量血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物與原始血液DNA的文庫(kù)構(gòu)建、質(zhì)檢與上機(jī)測(cè)序

血液DNA 質(zhì)控合格后進(jìn)行打斷、末端修復(fù)、加“poly-A”尾、加測(cè)序接頭、 PCR 富集等步驟構(gòu)建 DNA 文庫(kù)。將雙鏈的靶區(qū)域文庫(kù)進(jìn)行變性、環(huán)化和消化，得到單鏈環(huán)狀 DNA。單鏈環(huán)狀 DNA 通過(guò)滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（rolling circle amplification）得到擴(kuò)增產(chǎn)物即 DNA 納米球（DNA nano ball）。文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用 Qubit 進(jìn)行定量質(zhì)控，文庫(kù)質(zhì)量合格后利用DNBSEQ-T7RS測(cè)序儀對(duì)12個(gè)樣本的DNA片段進(jìn)行雙末端測(cè)序，按照PE 150測(cè)序策略執(zhí)行，獲得的原始reads以FASTQ格式保存。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的處理與分析" 通過(guò)BWA軟件將Clean reads比對(duì)到參考基因組（Bos taurus ARS-UCD1.3 GCA_002263795.3）上，統(tǒng)計(jì)各樣品的比對(duì)率、測(cè)序深度、基因組覆蓋度等信息。檢出率是指該樣本所有位點(diǎn)基因型檢出（非缺失）SNP位點(diǎn)數(shù)與重測(cè)序所有樣本SNP位點(diǎn)數(shù)比值。分型一致率是指以原始對(duì)照血液重測(cè)序樣本檢出位點(diǎn)基因型為參考，擴(kuò)增樣本的基因型（非缺失）與對(duì)照樣本基因型（非缺失）一致的比率。等位基因缺失率是指參考的對(duì)照組重測(cè)序樣本基因型為AC，擴(kuò)增后位點(diǎn)變?yōu)榧兒螦A，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增后等位基因發(fā)生缺失的位點(diǎn)比例。假陽(yáng)性率計(jì)算是指參考的對(duì)照組重測(cè)序樣本基因型為AA，擴(kuò)增后位點(diǎn)變?yōu)锳C，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增后等位基因發(fā)生改變（假陽(yáng)性）的位點(diǎn)比例。本次重測(cè)序獲得的總SNP位點(diǎn)為11 791 129（檢出位點(diǎn)數(shù)、對(duì)照組缺失位點(diǎn)、擴(kuò)增組缺失位點(diǎn)、對(duì)照組和擴(kuò)增組同時(shí)缺失位點(diǎn)的總和）。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS 25.0 進(jìn)行單因素ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著，利用GraphPad Prism 8進(jìn)行差異顯著性柱狀圖的繪制。

2 結(jié) 果

2.1 3頭母牛血液DNA的質(zhì)檢結(jié)果

為了順利進(jìn)行血液基因組DNA的擴(kuò)增，本研究首先對(duì)母牛血液DNA進(jìn)行質(zhì)檢。質(zhì)檢結(jié)果如表1所示，3頭母牛血液DNA質(zhì)檢后的濃度和總量達(dá)到了進(jìn)行后續(xù)擴(kuò)增試驗(yàn)的要求。

3頭牛血液基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖" 見(jiàn)圖1，3頭牛血液基因組DNA的片段長(zhǎng)度主要集中在8 000 bp以上，且條帶較為集中，說(shuō)明這3頭牛的血液DNA不存在污染情況。

2.2 牛1 ng血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)檢結(jié)果

為探究不同體系對(duì)于微量牛血液DNA的擴(kuò)增效果，本研究對(duì)不同體系的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了濃度測(cè)定與擴(kuò)增倍數(shù)統(tǒng)計(jì)。如表2所示，MALBAC體系的擴(kuò)增產(chǎn)物最終體積為65 μL，MDA體系為50 μL，且所有擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度、純度、完整性和總量都滿足試驗(yàn)要求。結(jié)果表明，MDA體系擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度、總質(zhì)量和擴(kuò)增倍數(shù)都極顯著的優(yōu)于MALBAC體系（Plt;0.01）。

如圖2所示，MDA體系擴(kuò)增牛血液文庫(kù)DNA的主帶集中在大于8 kb的部分，MALBAC體系集中在0.2～2 kb之間，可見(jiàn)，MDA體系的擴(kuò)增產(chǎn)物片段較長(zhǎng)。

2.3 牛1 ng 血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序數(shù)據(jù)量結(jié)果

本研究對(duì)1 ng 牛血液DNA經(jīng)過(guò)試劑盒擴(kuò)增后測(cè)序數(shù)據(jù)量、Q20值、Q30值和GC含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總。如表3所示，本次共計(jì)測(cè)出752.13G的原始數(shù)據(jù)，過(guò)濾后的堿基總量為751.05G，測(cè)得原始reads數(shù)目為2 507 086 432，過(guò)濾后的reads數(shù)目為2 505 286 542，有效堿基比率總體均值為99.93%，Q20值的總體均值為97.14%，Q30值的總體均值為91.87%，總體的GC含量均值為42.52%。足證說(shuō)明本次的數(shù)據(jù)產(chǎn)出足夠，Q20值與Q30值合格。

2.4 牛1 ng 血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

為探究不同擴(kuò)增體系對(duì)于1 ng 牛血液DNA的比對(duì)效果與體系重現(xiàn)性，本研究對(duì)經(jīng)不同體系擴(kuò)增的微量牛血液DNA進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)匯總。如表4和圖3所示，本次比對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示NC組（（99.87±0.021）%）、MDA（（99.88±0.012）%）和MALBAC體系（（99.86±0.006）%）的比對(duì)率無(wú)顯著性差異。從正確比對(duì)率來(lái)看，NC組（（98.41±0.040）%）顯著高于MDA體系（（94.92±1.161）%）和MALBAC體系（（93.97±0.217）%，Plt;0.05）。從重復(fù)率結(jié)果來(lái)看，NC組 （（2.25±0.917）%）顯著高于MDA體系（（1.48±0.124）%，Plt;0.05），但與MALBAC體系 （（1.99±0.447）%）沒(méi)有顯著差異，且MDA體系與MALBAC體系也無(wú)顯著性差異。

2.5 牛1 ng 血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序質(zhì)控統(tǒng)計(jì)結(jié)果

為了探究?jī)煞NWGA體系擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的質(zhì)量效果，本研究統(tǒng)計(jì)了平均測(cè)序深度下兩種體系擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的分型一致率、等位基因缺失率、假陽(yáng)性率與檢出率。如表5和圖4所示，牛血液DNA的測(cè)序質(zhì)控統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，MDA體系的分型一致率（（97.96±0.987）%）極顯著高于MALBAC體系（（87.50±1.236）%，Plt;0.01）；MALBAC體系的

等位基因缺失率（（6.29±1.239）%）顯著高于MDA體系（（0.85±0.072）%，Plt;0.05）；MALBAC體系的假陽(yáng)性率（（4.09±0.397）%）極顯著高于MDA體系（（0.87±0.116）%，Plt;0.01）；而MDA體系的檢出率（（98.87±0.192）%）顯著高于MALBAC體系（（86.55±3.120）%，Plt;0.05），說(shuō)明MDA體系的測(cè)序擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序質(zhì)量效果優(yōu)于MDAMALBAC體系（表5）。

2.6 牛1 ng 血液DNA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序深度及覆蓋度統(tǒng)計(jì)結(jié)果

為研究?jī)煞NWGA體系擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序覆蓋度效果，本研究統(tǒng)計(jì)了兩種體系擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序的平均測(cè)序深度與測(cè)序覆蓋度。如圖5所示，本次的平均測(cè)序深度結(jié)果顯示，NC組 （（23.13±1.305）×）顯著低于MDA體系（（36.04±4.519）×，Plt;0.05），但兩者都與MALBAC體系（（29.13±8.904）×）無(wú)顯著性差異。從1×測(cè)序覆蓋度來(lái)看，NC組（（98.82±0.050）%）極顯著高于MALBAC體系（（91.79±2.086）%，Plt;0.01），但與MDA體系（（98.42±0.148）%）無(wú)顯著性差異，同時(shí)，MDA體系的1×測(cè)序覆蓋度顯著高于MALBAC體系（Plt;0.05）。從5×測(cè)序覆蓋度來(lái)看，NC組（（97.83±0.100）%）和MDA體系（（96.80±0.290）%）都極顯著高于MALBAC體系（（71.49±6.631）%，Plt;0.01），說(shuō)明MDA體系的測(cè)序覆蓋度優(yōu)于MALBAC體系，尤其是在測(cè)序高測(cè)序深度時(shí)的測(cè)序覆蓋度。

3 討 論

隨著二代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使其測(cè)序成本大幅下降［34］，二代測(cè)序技術(shù)有望運(yùn)用在牛的胚胎基因組選擇上。另一方面，科學(xué)家們重視對(duì)擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行不斷地改進(jìn)，使我們可以得到高保真、擴(kuò)增偏倚小、等位基因丟失少的擴(kuò)增產(chǎn)物，例如數(shù)字液滴多重置換擴(kuò)增（dd MDA）［35］、凝膠多重置換擴(kuò)增（gel MDA）［36］等。本研究采用已有的兩種不同擴(kuò)增體系對(duì)微量牛血液DNA進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，比較不同WGA體系的擴(kuò)增效果，再通過(guò)二代測(cè)序的結(jié)果來(lái)評(píng)定兩種擴(kuò)增體系的測(cè)序效果。

首先，從擴(kuò)增效果上來(lái)看，MDA體系在擴(kuò)增產(chǎn)物濃度、總質(zhì)量和擴(kuò)增倍數(shù)方面極顯著優(yōu)于MALBAC體系，這與Liu等［37］的研究結(jié)果相似，他使用MALBAC體系的擴(kuò)增產(chǎn)物平均濃度在44.66 ng·μL-1（一個(gè)卵裂球），MDA體系的擴(kuò)增產(chǎn)物平均濃度為340.9 ng·μL-1（一個(gè)卵裂球），比本次研究高出1倍多。造成這種情況可能的原因是對(duì)方所擴(kuò)增樣本的類型是人的卵裂球，雖然起始DNA量大概在6 pg左右，但是所擴(kuò)增的時(shí)間也較長(zhǎng)。本次的瓊脂糖凝膠電泳圖結(jié)果同樣顯示出MDA體系的擴(kuò)增產(chǎn)物（大于8 kb）大于MALBAC體系（0.2～2 kb），本研究結(jié)果與Lyu等［38］的研究結(jié)果：MDA 產(chǎn)生的片段大小為10～100 kb相同，本研究中MALBAC 體系產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物（0.2～2 kb）同樣與Huang等［14］、Zhang［39］等、Zhou［4］等和Lyu等［38］的研究結(jié)果MALBAC體系產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為0.3～2 kb相似。本研究表明，MDA體系對(duì)1 ng牛血液DNA的擴(kuò)增效果優(yōu)于MALBAC體系。

其次，相關(guān)研究表明，MALBAC體系偏向于擴(kuò)增高GC含量區(qū)域［40］，但是此次MALBAC體系擴(kuò)增出的GC含量更接近于NC組的大量血液DNA的直接測(cè)序結(jié)果，說(shuō)明MALBAC體系可以較為準(zhǔn)確地?cái)U(kuò)增牛微量血液基因組DNA。再?gòu)谋葘?duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果方面來(lái)看，MDA體系和MALBAC體系的比對(duì)率、正確比對(duì)率和重復(fù)率并無(wú)顯著性差異，但MALBAC體系的重復(fù)率較高，表明MALBAC體系的重現(xiàn)性較好，這與Zhou等［4］和Chen等［13］的研究結(jié)果相似。與此同時(shí)，MDA體系的平均測(cè)序深度和1×測(cè)序覆蓋度與MALBAC體系無(wú)顯著差異，但在5×測(cè)序覆蓋度方面，MDA體系極顯著優(yōu)于MALBAC體系，表明隨著測(cè)序深度的增加，MALBAC體系的測(cè)序覆蓋度不如MDA體系，且MDA體系的測(cè)序覆蓋度較為穩(wěn)定。此外，MDA體系與MALBAC體系在分型一致率、等位基因缺失率、假陽(yáng)性率與檢出率等指標(biāo)上的差異顯示出MDA體系的測(cè)序效果顯著優(yōu)于MALBAC體系。綜上，MDA體系在微量血液DNA的擴(kuò)增效果和測(cè)序效果方面優(yōu)于MALBAC體系。

最后，本研究的試驗(yàn)結(jié)果正如同Biezuner等［41］研究7種單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增體系的靶向測(cè)序結(jié)果表明，市售的試劑盒都存在某一或幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)，沒(méi)有一種體系會(huì)在所有測(cè)序指標(biāo)中都表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，還是需要根據(jù)試驗(yàn)的需要進(jìn)行專門的WGA體系選擇［29］。當(dāng)前已有擴(kuò)增體系還存在微量DNA的全基因組擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性、等位基因缺失、喪失雜合性等局限性［42］。未來(lái)，還需要不斷改進(jìn)WGA體系所用DNA聚合酶和反應(yīng)步驟來(lái)優(yōu)化擴(kuò)增體系，或者對(duì)WGA體系的反應(yīng)體積進(jìn)行縮小，來(lái)提高擴(kuò)增和測(cè)序效果［4］。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)對(duì)3頭華西牛微量血液DNA分別采用兩種不同的全基因組擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增后測(cè)序，成功探明了不同體系對(duì)微量牛血液DNA擴(kuò)增的優(yōu)勢(shì)與不足，并發(fā)現(xiàn)MDA體系相對(duì)擴(kuò)增效果與測(cè)序效果好于MALBAC體系。本研究結(jié)果從測(cè)序結(jié)果的基礎(chǔ)上分析了已有擴(kuò)增體系對(duì)微量牛血液DNA的擴(kuò)增效果，為下一步進(jìn)行牛胚胎基因組選擇提供了理論依據(jù)。同時(shí)，我們的本研究結(jié)果表明，MDA體系是目前對(duì)微量華西牛血液DNA的綜合擴(kuò)增效果最好的一款已有體系，但是仍存在不能高保真擴(kuò)增GC區(qū)域和需要較深測(cè)序深度這兩方面的劣勢(shì)，還是需要根據(jù)自身試驗(yàn)需求來(lái)進(jìn)行市售單細(xì)胞擴(kuò)增體系的選擇。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ LAGE J M，LEAMON J H，PEJOVIC T，et al.Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH［J］.Genome Res，2003，13（2）：294-307.

［2］ WANG X Y，LIU Y P，LIU H N，et al.Recent advances and application of whole genome amplification in molecular diagnosis and medicine［J］.MedComm，2022，3（1）：e116.

［3］ 姚雅馨，喇永富，狄 冉，等.不同單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增方法的比較及MALBAC在輔助生殖中的應(yīng)用［J］.遺傳，2018，40（8）：620-631.

YAO Y X，LA Y F，DI R，et al.Comparison of different single cell whole genome amplification methods and MALBAC applications in assisted reproduction［J］.Hereditas （Beijing），2018，40（8）：620-631.（in Chinese）

［4］ ZHOU X X，XU Y，ZHU L B，et al.Comparison of multiple displacement amplification （MDA） and multiple annealing and looping-based amplification cycles （MALBAC） in limited DNA sequencing based on tube and droplet［J］.Micromachines （Basel），2020，11（7）：645.

［5］ DEAN F B，HOSONO S，F(xiàn)ANG L H，et al.Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（8）：5261-5266.

［6］ ORDóEZ C D，REDREJO-RODRíGUEZ M.DNA polymerases for whole genome amplification：considerations and future directions［J］.Int J Mol Sci，2023，24（11）：9331.

［7］ KHAN T，BECKER T M，PO J W，et al.Single-circulating tumor cell whole genome amplification to unravel cancer heterogeneity and actionable biomarkers［J］.Int J Mol Sci，2022，23（15）：8386.

［8］ LU N，QIAO Y，AN P F，et al.Exploration of whole genome amplification generated chimeric sequences in long-read sequencing data［J］.Brief Bioinform，2023，24（5）：bbad275.

［9］ PATRO S C，NIYONGABO A，MALDARELLI F，et al.New approaches to multi-parametric HIV-1 genetics using multiple displacement amplification：determining the what，how，and where of the HIV-1 reservoir［J］.Viruses，2021，13（12）：2475.

［10］ OSPINO M C，ENGEL K，RUIZ-NAVAS S，et al.Evaluation of multiple displacement amplification for metagenomic analysis of low biomass samples［J］.ISME Commun，2024，4（1）：ycae024.

［11］ LIU Y，LIANG S M，WANG B，et al.Advances in single-cell sequencing technology and its application in poultry science［J］.Genes （Basel），2022，13（12）：2211.

［12］ SHOJAEI SAADI H A，VIGNEAULT C，SARGOLZAEI M，et al.Impact of whole-genome amplification on the reliability of pre-transfer cattle embryo breeding value estimates［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：889.

［13］ CHEN M F，SONG P F，ZOU D，et al.Correction：comparison of multiple displacement amplification （MDA） and multiple annealing and looping-based amplification cycles （MALBAC） in single-cell sequencing［J］.PLoS One，2015，10（4）：e0124990.

［14］ HUANG L，MA F，CHAPMAN A，et al.Single-cell whole-genome amplification and sequencing：methodology and applications［J］.Annu Rev Genom Hum Genet，2015，16：79-102.

［15］ FU Y，SHEN X T，WU H T，et al.Preimplantation genetic testing for monogenic disease of spinal muscular atrophy by multiple displacement amplification：11 unaffected livebirths［J］.Int J Med Sci，2019，16（9）：1313-1319.

［16］ YAO K，GONZáLEZ-ESCALONA N，HOFFMANN M.Multiple displacement amplification as a solution for low copy number plasmid sequencing［J］.Front Microbiol，2021，12：617487.

［17］ RUAN Q Y，RUAN W D，LIN X Y，et al.Digital-WGS：automated，highly efficient whole-genome sequencing of single cells by digital microfluidics［J］.Sci Adv，2020，6（50）：eabd6454.

［18］ LAURI A，LAZZARI G，GALLI C，et al.Assessment of MDA efficiency for genotyping using cloned embryo biopsies［J］. Genomics，2013，101（1）：24-29.

［19］ SOBOL M S，KASTER A K.Back to basics：a simplified improvement to multiple displacement amplification for microbial single-cell genomics［J］.Int J Mol Sci，2023，24（5）：4270.

［20］ LU N，QIAO Y，LU Z H，et al.Chimera：the spoiler in multiple displacement amplification［J］.Comput Struct Biotechnol J，2023，21： 1688-1696.

［21］ ARAKAWA K.Ultralow-input genome library preparation for nanopore sequencing with droplet MDA［M］∥ARAKAWA K.Nanopore Sequencing：Methods and Protocols.New York：Humana，2023：91-100.

［22］ LUO C，F(xiàn)ERNIE A R，YAN J B.Single-cell genomics and epigenomics：technologies and applications in plants［J］.Trends Plant Sci，2020，25（10）：1030-1040.

［23］ VOLOZONOKA L，MISKOVA A，GAILITE L.Whole genome amplification in preimplantation genetic testing in the era of massively parallel sequencing［J］.Int J Mol Sci，2022，23（9）：4819.

［24］ LI N，WANG L，WANG H，et al.The performance of whole genome amplification methods and next-generation sequencing for pre-implantation genetic diagnosis of chromosomal abnormalities［J］.J Genet Genomics，2015，42（4）：151-159.

［25］ 徐曉麗，吳凌娟，鄢仁祥.單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)與應(yīng)用［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2019，46（4）：342-352.

XU X L，WU L J，YAN R X.Single cell whole genome amplification technology and application［J］.Progress in Biochemistry and Biophysics，2019，46（4）：342-352.（in Chinese）

［26］ TRIPATHI J，ZHU L，NAYAK S，et al.Stochastic expression of invasion genes in Plasmodium falciparum schizonts［J］.Nat Commun， 2022，13（1）：3004.

［27］ LU S J，ZONG C H，F(xiàn)AN W，et al.Probing meiotic recombination and aneuploidy of single sperm cells by whole-genome sequencing［J］.Science，2012，338（6114）：1627-1630.

［28］ LIU N Q，WEN X J，OU Z H，et al.Case report：preimplantation genetic testing for X-linked alport syndrome caused by variation in the COL4A5 gene［J］.Front Pediatr，2023，11：1177019.

［29］ DE BOURCY C F A，DE VLAMINCK I，KANBAR J N，et al.A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods［J］.PLoS One，2014，9（8）：e105585.

［30］ LASKEN R S.Single-cell sequencing in its prime［J］.Nat Biotechnol，2013，31（3）：211-212.

［31］ ZONG C H，LU S J，CHAPMAN A R，et al.Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell［J］.Science，2012，338（6114）：1622-1626.

［32］ MA J，GAO X，LI J Y，et al.Assessing the genetic background and selection signatures of Huaxi cattle using high-density SNP array［J］.Animals （Basel），2021，11（12）：3469.

［33］ 張 瑩，吳兆海，卜登攀.育肥期華西牛蛋白質(zhì)與能量需要量研究［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2022，34（12）：7886-7894.

ZHANG Y，WU Z H，BU D P.A study on protein and energy requirements of Huaxi cattle during fattening period［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2022，34（12）：7886-7894.（in Chinese）

［34］ LIU L，LI Y H，LI S L，et al.Comparison of next-generation sequencing systems［J］.Biomed Res Int，2012，2012：251364.

［35］ SIDORE A M，LAN F，LIM S W，et al.Enhanced sequencing coverage with digital droplet multiple displacement amplification［J］. Nucleic Acids Res，2016，44（7）：e66.

［36］ ZHOU Y，JIA E T，QIAO Y，et al.Low bias multiple displacement amplification with confinement effect based on agarose gel［J］.Anal Bioanal Chem，2021，413（17）：4397-4405.

［37］ LIU W Q，ZHANG H M，HU D，et al.The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels［J］.J Clin Lab Anal，2018，32（2）：e22267.

［38］ LYU L P，ASGHAR U，F(xiàn)U J Y，et al.Comparative analysis of single-cell genome sequencing techniques toward the characterization of germline and somatic genomes in ciliated protists［J］.Eur J Protistol，2023，88：125969.

［39］ ZHANG X Y，LIANG B，XU X Y，et al.The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection［J］.Biosci Rep，2017，37（4）：BSR20170252.

［40］ SRISUTHAM S，SUWANNASIN K，MATHEMA V B，et al.Utility of Plasmodium falciparum DNA from rapid diagnostic test kits for molecular analysis and whole genome amplification［J］.Malar J，2020，19（1）：193.

［41］ BIEZUNER T，RAZ O，AMIR S，et al.Comparison of seven single cell whole genome amplification commercial kits using targeted sequencing［J］.Sci Rep，2021，11（1）：17171.

［42］ CASPER R F.PGT-A：houston，we have a problem［J］.J Assist Reprod Genet，2023，40（10）：2325-2332.

（編輯 郭云雁）