摘 要： 旨在探討促紅細(xì)胞生成素（EPO）對牦牛腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（RIFs）中凋亡因子的影響。本研究首先分別采集3頭4歲齡的健康牦牛和黃牛的腎臟組織，采用免疫組織化學(xué)方法和Western blot檢測牦牛和黃牛腎臟中EPO的準(zhǔn)確分布及其表達(dá)量。同時對牦牛RIFs進(jìn)行原代培養(yǎng)鑒定，并對其進(jìn)行不同藥物處理來調(diào)控RIFs中EPO表達(dá)水平，檢測EPO對凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2，PCNA在mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。免疫組化學(xué)檢測結(jié)果顯示，EPO在牦牛和黃牛腎臟中集合管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和小管周間質(zhì)成纖維樣細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，EPO在牦牛腎臟中的表達(dá)量顯著高于黃牛（Plt;0.001）。隨后對生成EPO的RIFs進(jìn)行原代培養(yǎng)并調(diào)控EPO的表達(dá)，結(jié)果表明：激活組顯著升高RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)（Plt;0.001）。EPO抑制組顯著降低RIFs中Bcl-2、PCNA的表達(dá)，上調(diào)Bax的表達(dá)（Plt;0.001）。綜上表明，EPO在牦牛和黃牛腎臟中集合管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和小管周間質(zhì)成纖維樣細(xì)胞中均呈陽性表達(dá)，牦牛腎臟中的EPO高表達(dá)能夠促進(jìn)RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)，并降低Bax的表達(dá)，說明EPO可以在牦牛腎臟中起到抗凋亡的作用。

關(guān)鍵詞： 牦牛；促紅細(xì)胞生成素（EPO）；腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（RIFs）；凋亡

中圖分類號：S823.85

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3460-12

收稿日期：2024-01-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金（32372974）

作者簡介：盧增華（1997-），男，甘肅民勤人，碩士生，主要從事動物組織學(xué)與胚胎學(xué)研究，E-mail：1763689878@qq.com

通信作者：崔 燕，主要從事動物比較組織學(xué)研究，E-mail：cuiyan369@sina.com

Effect of Erythropoietin on the Expression of Apoptotic Factor in Yak Renal Interstitial

Fibroblasts

LU" Zenghua1， CUI" Yan1，2*， YU" Sijiu1，2， BAI" Xuefeng1， LU" Hongqin1， HE" Junfeng1， LU" Kai1，

ZHAI" Guoliang1， QI" Zhengman1

（1.College of Veterinary Medicine， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070，" China;

2.

Gansu Province Livestock Embryo Engineering Research Center， Lanzhou 730070， China）

Abstract：" The purpose of this study was to investigate the effect of erythropoietin （EPO） on apoptosis factors in yak renal interstitial fibroblasts （RIFs）. Firstly， the kidney tissues of three3 healthy yaks and cattle aged 4 years were collected respectively， immunohistochemistry and Western blot were used to detect the exact distribution of EPO and its expression in the kidneys of yaks and calves. Meanwhile， the yak RIFs were identified by primary culture， and different drug treatments were applied to regulate the EPO expression level in the RIFs， and the effects of EPO on the apoptosis-related genes Bax， Bcl-2， and PCNA at mRNA and protein expression levels were detected. Immunohistochemical results showed that EPO was positively expressed in collecting duct epithelial cells， renal tubular epithelial cells， and peritubular mesenchymal fibroblast-like cells in the kidneys of both yaks and calves. qRT-PCR and Western blot results showed that the expression of EPO in the kidneys of yaks was significantly higher than that in the calves （Plt;0.001）. Subsequently， the EPO-generating RIFs were cultured in primary culture and the expression of EPO was regulated， and the results showed that the activation group significantly elevated the expression of Bcl-2 and PCNA and decreased the expression of Bax in the RIFs （Plt;0.001）.The EPO-inhibition group significantly decreased the expression of Bcl-2，PCNA and up-regulated the expression of Bax in the RIFs （Plt;0.001）. In conclusion， it was showed that EPO was positively expressed in collecting duct epithelial cells， renal tubular epithelial cells and peritubular mesenchymal fibroblast-like cells in the kidney of yak and calf， and the high expression of EPO in the kidney of yak was able to promote the expression of Bcl-2 and PCNA and decrease the expression of Bax in the RIFs， which indicated that EPO could play an anti-apoptotic role in the kidney of yak.

Key words： yak; erythropoietin （EPO）; renal interstitial fibroblasts （RIFs）; apoptosis

*Corresponding author：CUI Yan， E-mail： cuiyan369@sina.com

EPO是一種糖蛋白激素，具有促進(jìn)紅細(xì)胞生成的作用，是紅細(xì)胞生成過程及維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因子［1］。哺乳動物從胚胎發(fā)育到出生，EPO的分泌組織和器官不斷發(fā)生著變化，在胚胎中期時，EPO由神經(jīng)組織分泌，在胚胎后期，EPO以旁分泌的方式由肝細(xì)胞開始分泌，刺激紅細(xì)胞的生成，出生后基本轉(zhuǎn)為腎臟［2］。具有EPO生成能力的細(xì)胞是腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞（renal interstitial fibroblast-like cells，RIFs）［3］。EPO在由腎臟分泌后進(jìn)入血液，通過體循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)骨髓，進(jìn)而調(diào)控紅細(xì)胞的生成。EPO除了能夠刺激紅細(xì)胞的生成，也具有抗凋亡，抗氧化的作用。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，EPO不僅能通過抗凋亡作用保護(hù)組織免受缺血和再灌注損傷，還能拮抗促炎因子的活性，改善、促進(jìn)損傷后的愈合和再生［4-6］。在另一項研究中也發(fā)現(xiàn)，EPO對由脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有較強(qiáng)的抑制作用［7］。有研究表明，長期的低氧環(huán)境可以引起腎功能嚴(yán)重受損，從而導(dǎo)致慢性腎炎、慢性間質(zhì)性腎炎、腎病綜合征、無癥狀性蛋白尿等慢性疾病，而這都與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系［8-11］。然而，牦牛長期生活在高海拔低氧環(huán)境并未引起腎臟相關(guān)疾病，這是否與EPO對凋亡因子的調(diào)控有關(guān)，尚未有研究報道。

Bax和Bcl-2這兩對基因是細(xì)胞凋亡的一對相互調(diào)控的基因，Bcl-2蛋白主要通過凋亡途徑的阻斷抑制細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)，從而使細(xì)胞存活時間增長。而Bax可拮抗Bcl-2的影響，是促凋亡基因中的一種。其中細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子Bcl-2及其相關(guān)蛋白是通過抑制Caspases蛋白酶的活性而抑制凋亡［12］。Bcl-2與Bax蛋白存在形成異源或同源二聚體的能力，發(fā)揮細(xì)胞凋亡作用是由Bcl-2/Bax蛋白的比例決定的［13］。增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）屬于細(xì)胞增殖相關(guān)的抗原，是真核生物DNA合成所必須的核蛋白，為DNA聚合酶的推動因子，與細(xì)胞的生長增殖密切相關(guān)［14］。

EPO參與了多種信號通路，發(fā)揮抗凋亡的作用。本研究試驗以牦牛和黃牛腎臟為研究對象，采用RT-qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）證明了EPO在牦牛腎臟中的表達(dá)量顯著高于黃牛腎臟，并通過調(diào)控EPO的表達(dá)，明確了其對凋亡及增殖相關(guān)因子Bax、Bcl-2和PCNA的表達(dá)調(diào)控，進(jìn)一步證明了EPO不僅可以調(diào)控凋亡分子機(jī)制，還可以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。揭示了牦牛在長期低氧環(huán)境下沒有發(fā)生凋亡引起的相關(guān)疾病的原因，也為凋亡類疾病的治療提供了重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

在甘肅省甘南藏族自治州分別選取3頭4歲齡的健康牦牛和黃牛，進(jìn)行屠宰，采集其腎臟組織樣品，放置于多聚甲醛和冰盒中帶回實(shí)驗室。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM/Highg lucose購自Gibco公司；胰蛋白酶購自Sigma公司；胎牛血清購于Hyclone公司；CCK8試劑盒、兔抗CK18購自Bisso；EPO、Bax、Bcl-2和PCNA多克隆抗體和二抗均購自Affinity公司。鼠抗β-actin抗體購自于全式金；DMOG和IOX3均購自于MCE公司。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

牦牛和黃牛腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后，切成1 cm3的組織塊，制成4 μm厚度石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片經(jīng)二甲苯和梯度酒精脫蠟水化，修復(fù)抗原，冷卻至室溫后，滴加內(nèi)源性過氧化物阻斷劑，于37 ℃孵育15 min；隨后滴加血清封閉液，室溫孵育15 min；滴加一抗（EPO：1∶800，陰性對照用PBS代替），4 ℃孵育過夜；次日滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃孵育15 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液于37 ℃溫箱孵育15 min；使用增強(qiáng)型二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，自來水中終止顯色，依次進(jìn)行蘇木精染色、分化、返藍(lán)、脫水、透明、封片和鏡檢。

1.4 牦牛RIFs的分離培養(yǎng)和活性檢測

將牦牛完整腎臟浸泡于含有青鏈霉素混合液的生理鹽水中，由屠宰場運(yùn)輸至實(shí)驗室。剖開腎臟被膜后，分離出腎臟皮質(zhì)并剪成約1 mm3小塊。每瓶12塊組織均勻鋪于細(xì)胞瓶底部，將細(xì)胞瓶背面朝上并在每瓶中加入2 mL的DMEM/HIGHGLUCOSE培養(yǎng)基。在37 ℃培養(yǎng)箱中靜置12 h，待組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)細(xì)胞瓶使組織塊浸入培養(yǎng)液后繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞從組織塊分裂出待貼壁融合率達(dá)到約90%后，用PBS洗去組織塊后按照1∶3比例傳代或凍存。

選取第三代RIFs進(jìn)行細(xì)胞活性測定，以每孔5×103個的數(shù)量各接種于96孔板內(nèi)，使用CCK-8檢測試劑對其進(jìn)行染色，每隔24 h使用酶標(biāo)儀進(jìn)行OD值測定，共計測量7 d，每組設(shè)置3個重復(fù)。

1.5 細(xì)胞免疫熒光鑒定

用4％多聚甲醛對貼壁細(xì)胞固定30 min，0.5％的TritonX-100通透30 min，使用免疫熒光封閉液（BSA）室溫封閉3 h。分別滴加anti-CK18（1∶400），anti-Vimentin（1∶400）和anti-CD31（1∶400）后4 ℃孵育過夜。清洗后加山羊抗兔的熒光二抗（1∶250），37 ℃孵育1 h。滴加DAPI染液，室溫染色3 min。取出蓋玻片，封片，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.6 藥物處理RIFs

用二甲基亞砜（dimethylsulfoxide， DMSO）溶解二甲基草酰甘氨酸IOX3和LW6；參考相關(guān)文獻(xiàn)及藥物說明書的IC50值，將藥物IOX3設(shè)置為25 μmol·mL-1、50 μmol·mL-1、75 μmol·mL-1和100 μmol·mL-1四個濃度梯度；LW6為5 μmol·mL-1、10 μmol·mL-1和20 μmol·mL-1三個濃度梯度。在對照組中，使用PBS替代藥物，其他操作與試驗組同步。

1.6.1 流式細(xì)胞

收集RIFs并用70%乙醇在4 ℃下固定過夜。將細(xì)胞懸浮在緩沖液中，濃度調(diào)整為3×105個·mL-1。細(xì)胞懸液和FITC標(biāo)記AnnexinV混合，室溫孵育10 min后離心，PBS洗滌細(xì)胞，使用緩沖液重懸細(xì)胞，PI染色細(xì)胞5 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.6.2 EdU染色

將配置好的EdU溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育2 h，之后對細(xì)胞進(jìn)行固定，通透液通透10 min，PBS洗滌。進(jìn)行Apollo染色，PBS洗滌之后，細(xì)胞核染色使用Hoechst染料。倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 實(shí)時熒光定量PCR

將樣品置于冰盒上，使用細(xì)胞裂解液Trizol提取總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將其反轉(zhuǎn)成cDNA后進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR（引物序列見表1）。反應(yīng)體系為20 μＬ：10 μL SYBR Green Mix，8 μL ddH2O，1 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，72 ℃ 5 min，40個循環(huán)。每個基因設(shè)置3個重復(fù)孔。用2-ΔΔCT法計算基因的mRNA相對表達(dá)量。

1.8 Western blot檢測

將樣品置于冰袋上進(jìn)行蛋白裂解（1mL RIPA＋10 μL RMSF），所提取的蛋白與4×蛋白buffer混合（3∶1），蛋白變性。8 μL蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將其蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，將anti-EPO（1∶800）、anti-Bax（1∶800）、anti-Bcl-2（1∶1 000）、anti-PCNA（1∶1 000）與PVDF膜共同孵育，4 ℃過夜。二抗（1∶2 500）室溫孵育1 h，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影。每組重復(fù)測定3次，ImageJ軟件對Western blot條帶進(jìn)行分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有測定數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（SEM）”表示，SPSS 20.0用于分析數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布和方差齊性，使用單因素（ANOVA）Duncan法進(jìn)行比較分析，統(tǒng)計顯著性以 * 表示，*表示Plt;0.05；**表示Plt;0.01；***表示Plt;0.001；ns表示不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 EPO在成年黃牛和牦牛腎臟中的定位及表達(dá)

2.1.1 免疫組織檢測

選取健康的腎臟組織用于免疫組織化學(xué)檢測。結(jié)果顯示（圖1），EPO在成年牦牛和黃牛腎臟中均呈陽性表達(dá)，主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞、集合管上皮細(xì)胞、腎小管周間質(zhì)成纖維樣細(xì)胞。

2.2 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和活性檢測

對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞形似紡錘狀或不規(guī)則的三角形（圖3A）。在傳至第三代時，細(xì)胞狀態(tài)最為良好，細(xì)胞呈克隆樣集落生長，增殖速度較快（圖3B）。但在培養(yǎng)至第七代時，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，其細(xì)胞核增大，部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡，且增殖速度較慢，這表明細(xì)胞開始老化，不再適合用作試驗材料（圖3C）。

選用狀態(tài)良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行活性檢測，使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒進(jìn)行細(xì)胞生長曲線測定（圖3D）。原代細(xì)胞在培養(yǎng)1～2天時，增殖速度較為緩慢，在第3天時，細(xì)胞呈指數(shù)生長，直到第5天，細(xì)胞進(jìn)入平臺期，增殖速度下降，且在第7天時，由于細(xì)胞鋪滿皿底，融合率達(dá)到95%以上，開始出現(xiàn)接觸抑制，部分細(xì)胞死亡，出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量下降的情況。

2.3 腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的鑒定

對所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光檢測，為鑒定所培養(yǎng)的是否存在和腎小管上皮細(xì)胞雜糅的情況。選取上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白CK18為對照組，成纖維細(xì)胞的特異性蛋白Vimentin和α-SMA為試驗組。Vimentin和α-SMA在所培養(yǎng)的細(xì)胞骨架上呈陽性表達(dá)且熒光信號較強(qiáng)（圖4C、F），CK18呈陰性表達(dá)（圖4I）。試驗結(jié)果表明，通過原代培養(yǎng)與純化，獲得了純度較高的牦牛RIFs，可用于后續(xù)試驗。

2.4 IOX3誘導(dǎo)的EPO對凋亡相關(guān)基因及蛋白的影響

本研究選用IOX3為EPO的激活劑，它可以促進(jìn)EPO生成和胎兒血紅蛋白的表達(dá)。藥物濃度的選用根據(jù)說明書推薦范圍設(shè)置成4個濃度（25μmol·mL-1、50μmol·mL-1，、75μmol·mL-1和100μmol·mL-1），并對EPO和凋亡相關(guān)基因進(jìn)行mRNA和蛋白水平的檢測。mRNA表達(dá)水平如圖5所示，與對照組相比，隨著藥物誘導(dǎo)濃度的增加，EPO的mRNA表達(dá)水平逐漸升高，且呈劑量依賴性，在100μmol·mL-1時達(dá)到最大值（Plt;0.001）。Bcl-2和PCNA的mRNA表達(dá)水平也隨著藥物濃度的升高而上調(diào)，而Bax的mRNA表達(dá)水平在試驗組的表達(dá)水平極顯著地低于對照組（Plt;0.0001）。試驗結(jié)果表明：IOX3成功誘導(dǎo)了EPO在mRNA水平上的高表達(dá)，且EPO的表達(dá)上調(diào)對Bcl-2和PCNA在mRNA水平的表達(dá)有促進(jìn)作用，對Bax在mRNA水平的表達(dá)有抑制作用。

為進(jìn)一步驗證EPO過表達(dá)后對Bax、Bcl-2和PCNA在蛋白水平上的調(diào)控作用，采用Western blot技術(shù)檢測相關(guān)蛋白表達(dá)情況。由圖6可知，EPO、Bcl-2和PCNA在試驗組的蛋白表達(dá)量極顯著高于對照組（Plt;0.001）。而Bax在試驗組的蛋白表達(dá)量極顯著低于對照組（Plt;0.001）。試驗結(jié)果表明：IOX3成功誘導(dǎo)了EPO在蛋白水平的高表達(dá)，且EPO的表達(dá)上調(diào)對Bcl-2和PCNA蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用，對Bax蛋白的表達(dá)有抑制作用。

2.5 LW6抑制EPO在RIFs中對凋亡相關(guān)基因及蛋白的影響

上述結(jié)果證明了IOX3誘導(dǎo)的EPO發(fā)揮抗凋亡作用。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們使用EPO的抑制劑LW6處理RIFs。藥物濃度設(shè)定根據(jù)所推薦的濃度設(shè)置為3個藥物梯度，分別為5μmol·mL-1，、10μmol·mL-1和20μmol·mL-1 。藥物處理結(jié)果如圖7所示，與對照組相比隨著LW6濃度的增加，EPO、Bcl-2和PCNA的mRNA水平在試驗組的表達(dá)極顯著低于對照組（Plt;0.001），而Bax的mRNA水平在試驗組的表達(dá)極顯著高于對照組（Plt;0.001）。

隨后我們又檢測了EPO、Bcl-2、Bax和PCNA蛋白的相對表達(dá)水平。由圖8可知，EPO、Bcl-2和PCNA在試驗組的蛋白表達(dá)量極顯著低于對照組（Plt;0.001）。而Bax在試驗組的蛋白表達(dá)量極顯著高于對照組（Plt;0.001）。試驗結(jié)果表明：LW6也抑制了EPO在蛋白水平的表達(dá)，且EPO的表達(dá)下調(diào)對Bcl-2和PCNA蛋白的表達(dá)有抑制作用，對Bax蛋白的表達(dá)有促進(jìn)作用。試驗結(jié)果表明：LW6成功的抑制了EPO在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，且EPO的表達(dá)下調(diào)對Bcl-2和PCNA的表達(dá)有抑制作用，對Bax的表達(dá)有促進(jìn)作用。

2.6 EPO對牦牛RIFs凋亡和增殖的影響

上述結(jié)果表明藥物IOX3、LW6可以激活或抑制EPO的表達(dá)。我們用不同濃度的IOX3（100 μmol·mL-1）和LW6（20 μmol·mL-1）分別處理RIFs，檢測其凋亡和增殖的發(fā)生情況。EdU染色表明，Control組細(xì)胞沒有發(fā)生明顯的增殖，IOX3組細(xì)胞增殖相對對照組增加，而LW6組的細(xì)胞增殖降低（圖9A1-C3）。通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測IOX3和LW6對腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Control組的凋亡率為7.91%；IOX3組的凋亡率為7.21%；LW6組的凋亡率為10.44%（圖9D、E、F）。這與蛋白和基因表達(dá)數(shù)據(jù)結(jié)果相一致，說明EPO在牦牛RIFs中起到抗凋亡的作用。

3 討 論

腎臟作為動物泌尿系統(tǒng)重要的組成部分之一，在高原動物低氧適應(yīng)性中發(fā)揮著重要的作用。研究表明，在貧血或缺氧等應(yīng)激條件下，機(jī)體需要適應(yīng)低氧的條件，以維持各機(jī)能的正常運(yùn)行，紅細(xì)胞數(shù)量相應(yīng)增多［15-16］。EPO作為調(diào)控紅細(xì)胞生成的核心因子，對于高原動物在低氧環(huán)境中的適應(yīng)性至關(guān)重要，表達(dá)失調(diào)通常會導(dǎo)致各種病理結(jié)果［17-18］。對于身處低氧環(huán)境中的牦牛而言，紅細(xì)胞數(shù)量的增多是其適應(yīng)不利環(huán)境重要方式之一。由于體內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量增多不僅要保障正常的供氧量，還要避免出現(xiàn)紅細(xì)胞過度增多引起的臨床癥狀。因此，EPO對紅細(xì)胞生成的調(diào)控必須十分精確。除此之外，EPO還具有抗凋亡功能。相關(guān)研究表明，它是一種具有抗凋亡活性的細(xì)胞因子，可有效緩解由缺血缺氧導(dǎo)致的腎損傷等疾?。?9-20］。然而，牦牛長期生活在高海拔低氧環(huán)境下卻未發(fā)現(xiàn)相關(guān)腎臟疾病。因此，我們推測EPO可能在牦牛腎臟中的抗凋亡功能是一重要因素。本研究通過對牦牛和黃牛的對比，發(fā)現(xiàn)EPO在腎內(nèi)的集合管上皮細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞中均有陽性表達(dá)，這一結(jié)果與EPO在其他哺乳動物腎臟中表達(dá)分布結(jié)果一致［21-22］。但在表達(dá)水平上，我們發(fā)現(xiàn)，牦牛腎內(nèi)EPO的表達(dá)量顯著高于黃牛。其機(jī)制可能是在低氧條件下促進(jìn)了缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致了腎臟中EPO的產(chǎn)生增加［23］。有研究表明，一定濃度的重組人促紅細(xì)胞生成素對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡具有較大的抑制作用，其體現(xiàn)為對腎臟一種保護(hù)性的效果［24-25］。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的生理或病理條件下主動的、程序化的死亡過程，受多種基因精確調(diào)控，是機(jī)體重要的自穩(wěn)調(diào)節(jié)機(jī)制［26］。通過大量學(xué)者研究表明，線粒體通路在細(xì)胞凋亡機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，其中Bcl-2等抗凋亡因子及Bax、Cyto-C等促凋亡因子在細(xì)胞凋亡線粒體途徑中起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，通常情況下Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達(dá)量相對穩(wěn)定，而當(dāng)Bax在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)時，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量大量上升，細(xì)胞產(chǎn)生死亡信號，啟動凋亡；而當(dāng)Bcl-2高表達(dá)時，則Bax/Bax二聚體大量解離，發(fā)揮抗凋亡的作用，使細(xì)胞存活期延長［27-28］。PCNA是真核細(xì)胞合成所必需的一種核蛋白，研究表明，PCNA的表達(dá)及合成與細(xì)胞增生周期有關(guān)。G1期PCNA表達(dá)逐漸升高，在S期達(dá)到頂峰。因此，PCNA表達(dá)高低能準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的生長狀態(tài)，其表達(dá)上調(diào)促進(jìn)細(xì)胞的增殖［29］。

EPO不僅作為一種促紅細(xì)胞生成因子，還可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其生長［30］。既往的研究表明，EPO通過與其受體（EPOR）結(jié)合，抑制了PI3K/Akt信號通路的激活，從而抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮糾正貧血的作用［31］。有研究表明，促紅細(xì)胞生成素可以抑制人腎小球系膜細(xì)胞的凋亡，而該抑制作用與其濃度水平相關(guān)［32］。有研究證明，EPO顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞單層凋亡，其作用機(jī)制是上調(diào)了Bcl-2的表達(dá)，同時下調(diào)了Bax的表達(dá)［33］。在大鼠腦出血病理模型中，注射外源EPO后，檢測到正常大鼠海馬組織中Bcl-2的表達(dá)量明顯低于腦出血組，TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)，注射組中凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯低于腦出血組，結(jié)果證實(shí)了rhEPO具有抗凋亡作用［34］。此外，在糖尿病小鼠模型中，EPO在胰島內(nèi)也能夠發(fā)揮抗凋亡、促增殖的作用，從而對胰島細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用［35］。此外，在癲癇大鼠的病理模型中，EPO對癲癇大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用可以通過激活TGF-β/Smad信號通路來實(shí)現(xiàn)，從而緩解神經(jīng)元凋亡，改善癲癇癥狀，結(jié)果證實(shí)了EPO具有抗凋亡作用［36］。本試驗中，藥物IOX3能夠激活牦牛RIFs中EPO的高表達(dá)，且隨著IOX3濃度的增加，EPO的表達(dá)水平逐漸升高，且呈劑量依賴性；藥物L(fēng)W6能夠抑制牦牛RIFs中EPO的表達(dá)，與對照組相比隨著LW6濃度的增加，EPO的表達(dá)水平顯著低于對照組。EPO高表達(dá)組能夠顯著地促進(jìn)RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)；細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞增殖率增加。EPO抑制組能夠顯著地抑制RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)并促進(jìn)Bax的表達(dá)。還有研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度時，EPO以劑量依賴性的方式促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖［37］。以上研究結(jié)果表明，EPO在不同物種和病理模型中都具有抗凋亡和促增殖的作用，但是其具體的信號傳導(dǎo)通路與作用途徑，仍需進(jìn)一步的試驗研究來論證。本研究選用IOX3和LW6藥物處理牦牛RIFs，從而導(dǎo)致EPO的激活和抑制。研究結(jié)果表明，當(dāng)EPO的表達(dá)量出現(xiàn)變化時，細(xì)胞凋亡率也隨之變化，并調(diào)控Bcl-2、PCNA和Bax的表達(dá)水平。這表明EPO可以在牦牛腎臟中起到抗凋亡的作用。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，EPO主要分布于牦牛和黃牛腎臟中的腎小管上皮細(xì)胞和小管周間質(zhì)成纖維樣細(xì)胞中，且EPO在牦牛腎內(nèi)的表達(dá)顯著高于黃牛。EPO激活組能夠顯著地促進(jìn)RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)；細(xì)胞凋亡率下降，細(xì)胞增殖增加。EPO抑制組能夠顯著地抑制RIFs中Bcl-2和PCNA的表達(dá)并促進(jìn)Bax的表達(dá)。細(xì)胞凋亡率上升，細(xì)胞增殖下降。這表明EPO在牦牛RIFs中起到抗凋亡的作用。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ JELKMANN W.Physiology and pharmacology of erythropoietin［J］.Transfus Med Hemother，2013，40（5）：302-309.

［2］ 李 慧.低氧條件下成年牦牛腎間質(zhì)成纖維樣細(xì)胞中EPO的適應(yīng)性調(diào)控研究［D］.蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2020.

LI H.Adaptive regulation of EPO in adult yak renal interstitial fibroblasts-like cells under hypoxia［D］.Lanzhou：Gansu Agricultural University，2020.（in Chinese）

［3］ SUZUKI N.Erythropoietin gene expression：developmental-stage specificity，cell-type specificity，and hypoxia inducibility［J］. Tohoku J Exp Med，2015，235（3）：233-240.

［4］ REN C C，ZHU W，WANG Q W，et al.The renal protect function of erythropoietin after release of bilateral ureteral obstruction in a rat model［J］.Clin Sci （Lond），2018，132（18）：2071-2085.

［5］ HAN X P，ZHANG F Q，TAN X S，et al.EPO modified MSCs can inhibit asthmatic airway remodeling in an animal model［J］.J Cell Biochem，2018，119（1）：1008-1016.

［6］ 朱國萍，婁 陽，徐 沖.Bcl-2蛋白家族與細(xì)胞凋亡［J］.細(xì)胞生物學(xué)雜志，2001，23（1）：20-23.

ZHU G P，LOU Y，XU C.Bcl-2 protein family and apoptosis［J］.Journal of Cell Biology，2001，23（1）：20-23.（in Chinese）

［7］ 龐 睿.重組人促紅細(xì)胞生成素抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的實(shí)驗研究［J］.科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，2019，17（10）：66-67.

PANG R.Experimental study on the inhibition of endothelial cell apoptosis by recombinant human erythropoietin［J］.Scientific and Technological Innovation，2019，17（10）：66-67.（in Chinese）

［8］ NEKOUI A，DEL CARMEN ESCALANTE TRESIERRA V，ABDOLMOHAMMADI S，et al.Neuroprotective effect of erythropoietin in postoperation cervical spinal cord injury：case report and review［J］.Anesthesiol Pain Med，2015，5（6）：e28849.

［9］ SINGH A K，KOLLIGUNDLA L P，F(xiàn)RANCIS J，et al.Detrimental effects of hypoxia on glomerular podocytes［J］.J Physiol Biochem，2021，77（2）：193-203.

［10］ CIANCI R，SIMEONI M，CIANCI E，et al.Stem cells in kidney ischemia：from inflammation and fibrosis to renal tissue regeneration［J］.Int J Mol Sci，2023，24（5）：4631.

［11］ NASU K，KAWAKAMI T，SHINOHARA A，et al.Munc18-1-interacting protein 3 mitigates renal fibrosis through protection of tubular epithelial cells from apoptosis［J］.Nephrol Dial Transplant，2020，35（4）：576-586.

［12］ ADAMS J M，CORY S.The Bcl-2 protein family：arbiters of cell survival［J］.Science，1998，281（5381）：1322-1326.

［13］ 羅文捷，張啟芳，孟云超，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠受損腸黏膜修復(fù)作用的探究［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，54（12）：1882-1887.

LUO W J，ZHANG Q F，MENG Y C，et al.Effect of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of damaged intestinal mucosa in mice with ulcerative colitis［J］.Acta Universitatis Medicinalis Anhui，2019，54（12）：1882-1887.（in Chinese）

［14］ 宋楠萌，桑建利，徐 恒.增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）的分子結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展［J］.自然科學(xué)進(jìn)展，2006，16（10）：1201-1209.

SONG N M，SANG J L，XU H.Advances in molecular structure and biologicalfunction of proliferating cell nuclear antigen （PCNA）［J］.Progress in Natural Science，2006，16（10）：1201-1209.（in Chinese）

［15］ PALIEGE A，ROSENBERGER C，BONDKE A，et al.Hypoxia-inducible factor-2α-expressing interstitial fibroblasts are the only renal cells that express erythropoietin under hypoxia-inducible factor stabilization［J］.Kidney Int，2010，77（4）：312-318.

［16］ 錢慶元，潘錦超，楊 軍，等.不同缺氧干預(yù)對低壓低氧模型鼠血?dú)饧凹t細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的影響［J］.浙江大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2023，52（6）：777-784.

QIAN Q Y，PAN J C，YANG J，et al.Effect of different hypoxic and hypobaric interventions on blood gas and erythrocyte-related indicators in rats［J］.Journal of Zhejiang University （Medical Sciences），2023，52（6）：777-784.（in Chinese）

［17］ HAASE V H.HIF-prolyl hydroxylases as therapeutic targets in erythropoiesis and iron metabolism［J］.Hemodial Int，2017， 21（S1）：S110-S124.

［18］ SUZUKI N，YAMAMOTO M.Roles of renal erythropoietin-producing （REP） cells in the maintenance of systemic oxygen homeostasis［J］.Pflugers Arch Eur J Physiol，2016，468（1）：3-12.

［19］ SANKARAN V G，WEISS M J.Anemia：progress in molecular mechanisms and therapies［J］.Nat Med，2015，21（3）：221-230.

［20］ VICTOR S，ROCHA-FERREIRA E，RAHIM A，et al.New possibilities for neuroprotection in neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy［J］.Eur J Pediatr，2022，181（3）：875-887.

［21］ SEMENZA G L.Involvement of oxygen-sensing pathways in physiologic and pathologic erythropoiesis［J］.Blood， 2009， 114（10）：2015-2019.

［22］ 楊 歡，石玉紅，冉海鳳，等.促紅細(xì)胞生成素的生理功能及生成來源［J］.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2021，26（4）：434-443.

YANG H，SHI Y H，RAN H F，et al.Erythropoietin′s biological function and source ［J］.Chinese Journal of Clinical Pharmacology and Therapeutics，2021，26（4）：434-443.（in Chinese）

［23］ 姚一凡，張伊陽，董仕慧，等.低氧下牦牛、黑白花牛腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞PDK1、Smad2、Caspase3等因子表達(dá)差異研究［J］.核農(nóng)學(xué)報，2023，37（7）：1335-1343.

YAO Y F，ZHANG Y Y，DONG S H，et al.Differential expression of PDK1，Smad2 and Caspase3 in renal interstitial fibroblasts of Yak and Holstein under hypoxia［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences，2023，37（7）：1335-1343.（in Chinese）

［24］ 張 晶，張承英.抗EPO抗體特性、分類及其相關(guān)純紅細(xì)胞再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制及診治進(jìn)展［J］.武警醫(yī)學(xué)，2018，29（12）：1169-1172.

ZHANG J，ZHANG C Y.Latest diagnosis of pure red cell aplastic anemia related to anti-EPO antibodies［J］.Medical Journal of the Chinese Peoples Armed Police Forces，2018，29（12）：1169-1172.（in Chinese）

［25］ 李晶晶，伍 超，柯 慧，等.腎虛免疫低下大鼠EPO的變化及右歸飲與外源性EPO的逆轉(zhuǎn)作用［J］.中國中藥雜志，2019，44（6）：1246-1257.

LI J J，WU C，KE H，et al.Changes of EPO in rats with chronic renal failure and low immunity and reversal effects of Yougui Yin and exogenous EPO［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2019，44（6）：1246-1257.（in Chinese）

［26］ 董雅潔，高維娟.bcl-2、bax、caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用及其關(guān)系［J］.中國老年學(xué)雜志，2012，32（21）：4828-4830.

DONG Y J，GAO W J.The role of bcl-2，bax，caspase-3 in apoptosis and their relationship［J］.Chinese Journal of Gerontology，2012，32（21）：4828-4830.（in Chinese）

［27］ TSUKAHARA S，YAMAMOTO S，TIN-TIN-WIN-SHWE，et al.Inhalation of low-level formaldehyde increases the Bcl-2/Bax expression ratio in the hippocampus of immunologically sensitized mice［J］.Neuroimmunomodulation，2006，13（2）：63-68.

［28］ 劉大銳，李報春，李懷東.細(xì)胞凋亡核心基因Caspase家族的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2020，22（11）：800-805.

LIU D R，LI B C，LI H D.Research progress in Caspase family of apoptosis core gene［J］.Chinese Journal of Medicinal Guide，2020，22（11）：800-805.（in Chinese）

［29］ AYMONNIER K，BOSETTA E，LEBORGNE N G F，et al.G-CSF reshapes the cytosolic PCNA scaffold and modulates glycolysis in neutrophils［J］.J""" Leukocyte Biol，2024，115（2）：205-221.

［30］ VTSVEEN T K，SPONAAS A M，TIAN E M，et al.Erythropoietin （EPO）-receptor signaling induces cell death of primary myeloma cells in vitro［J］.J Hematol Oncol，2016，9（1）：75.

［31］ 牟云鴻.促紅細(xì)胞生成素對高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞凋亡的影響及其可能機(jī)制［D］.南昌：南昌大學(xué)，2019.

MOU Y H.Effect of EPO on high glucose-cultured apoptosis of human glomerular mesangial cells and its possible mechanisms［D］.Nanchang：Nanchang University，2019.（in Chinese）

［32］ YI X Y，YAN W H，GUO T L，et al.Erythropoietin mitigates diabetic nephropathy by restoring PINK1/Parkin-mediated Mitophagy［J］.Front Pharmacol，2022，13：883057.

［33］ WARREN J S，ZHAO Y，YUNG R，et al.Recombinant human erythropoietin suppresses endothelial cell apoptosis and reduces the ratio of Bax to Bcl-2 proteins in the aortas of apolipoprotein E-deficient mice［J］.J Cardiovasc Pharmacol，2011，57（4）： 424-433.

［34］ 潘廣艷.重組人促紅細(xì)胞生成素對腦出血大鼠認(rèn)知功能及海馬組織凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax表達(dá)的影響［D］.遵義：遵義醫(yī)科大學(xué)，2020.

PAN G Y.Effects of recombinant human erythropoietin on cognitive function and expression of apoptosis-related factors Bcl-2 and Bax in hippocampus of rats with intracerebral hemorrhage［D］.Zunyi：Zunyi Medical University，2020.（in Chinese）

［35］ CHOI D，SCHROER S A，LU S Y，et al.Erythropoietin protects against diabetes through direct effects on pancreatic β cells［J］.J Exp Med，2010，207（13）：2831-2842.

［36］ PAN X X，GONG X Q，PAN L L，et al.Erythropoietin relieves neuronal apoptosis in epilepsy rats via TGF-β/Smad signaling pathway［J］.Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2023，69（10）：239-243.

［37］ 殷亮亮，李春年.EPO對低氧狀態(tài)下牙髓細(xì)胞增殖和保護(hù)的實(shí)驗研究［J］.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2021，42（7）：765-769.

YIN L L，LI C N.Experimental study of EPO on proliferation and protection of dental pulp cells under hypoxia［J］.Journal of Hebei Medical University，2021，42（7）：765-769.（in Chinese）

（編輯 郭云雁）