摘 要： 旨在從脂質(zhì)代謝的角度探討載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，Apoa1）是否介導(dǎo)了雙酚A（bisphenol A，BPA）暴露所致小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株（TM3）睪酮合成的降低。將TM3細(xì)胞隨機(jī)分為不同濃度的BPA暴露劑量（0、5、10、20、40、60、80 μmol·L-1）組，0 μmol·L-1 BPA為對(duì)照組（CON）。給予相應(yīng)劑量處理24 h后，運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)TM3細(xì)胞活力，確定BPA最適染毒劑量；通過(guò)ELISA檢測(cè)TM3細(xì)胞培養(yǎng)上清液睪酮（testosterone，T）含量；利用RT-qPCR檢測(cè)TM3細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Apoa1、Apoa2（apolipoprotein A2）、Apoc3（apolipoprotein C3）的mRNA表達(dá)水平；運(yùn)用Western blot和免疫熒光方法檢測(cè)APOA1蛋白表達(dá)水平；采用油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴累積情況。結(jié)果表明，20 μmol·L-1 BPA處理24 h對(duì)TM3細(xì)胞活力無(wú)顯著影響，40 μmol·L-1 BPA處理24 h后，TM3細(xì)胞活力受到極顯著抑制（Plt;0.01）；此外，20 μmol·L-1 BPA處理TM3細(xì)胞24 h后，培養(yǎng)上清液中睪酮含量極顯著低于對(duì)照組（Plt;0.01），Apoa1基因的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)量極顯著升高（Plt;0.001），但Apoa2和Apoc3基因的mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著變化；與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1 BPA處理24 h，TM3細(xì)胞的脂滴累積量極顯著降低（Plt;0.000 1）。綜上，BPA可通過(guò)上調(diào)Apoa1基因的表達(dá)水平，增強(qiáng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport， RCT），引起TM3細(xì)胞內(nèi)的脂滴含量減少，導(dǎo)致TM3細(xì)胞的睪酮合成分泌降低。

關(guān)鍵詞： 雙酚A（BPA）；載脂蛋白A1（Apoa1）；小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞（TM3）；睪酮（T）

中圖分類號(hào)：S814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3516-10

收稿日期：2023-11-03

基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金優(yōu)秀青年基金項(xiàng)目（YQ2022C018）

作者簡(jiǎn)介：趙 彤（2000-），女，遼寧朝陽(yáng)人，碩士，主要從事動(dòng)物繁殖生理學(xué)研究，E-mail：ZT215926@163.com

通信作者：趙立佳，主要從事動(dòng)物繁殖生理學(xué)研究，E-mail： ljzhao@neau.edu.cn

Bisphenol A Inhibits Testosterone Synthesis in TM3 Cells by Upregulating Apoa1

Gene Expression

ZHAO" Tong1， YANG" Wenzhe1， PAN" Feilong1， ZHAO" Shuchen1，2， LIU" Kexiang1，2， L Zhanjun1，2，

ZHAO" Lijia1，2*

（1.College of Animal Medicine， Northeast Agricultural University， Harbin 150030，" China;

2.

Key Laboratory of the Provincial Education Department of Heilongjiang for Common Animal Disease Prevention

and Treatment， Harbin 150030，" China）

Abstract：" The aim of the study was to investigate whether apolipoprotein A1 （apolipoprotein A1，Apoa1） mediates the reduction of testosterone synthesis in mouse Leydig cells line （TM3） induced by bisphenol A （BPA） exposure from the perspective of lipid metabolism. TM3 cells were randomly divided into 7 groups with different concentrations （0， 5， 10， 20， 40， 60， and 80 μmol·L-1）， and 0 μmol·L-1 BPA was the control group （CON）; After 24 h of treatment with the different concentrations， cell viability was detected using theby CCK-8 method to determine the optimal dose of BPA." Testosterone （testosterone， T） synthesiscontent in TM3 cell supernatant was detected by ELISA; mRNA expression levels of lipid metabolism-related genes Apoa1， Apoa2 （apolipoprotein A2） and Apoc3 （apolipoprotein C3） genes were measured in TM3 cells usingby RT-qPCR. APOA1 protein expression level was detected usingby Western blot and immunofluorescence method. Intracellular lipid droplet accumulation was observed usingby oil red O staining. The results showed that 20 μmol·L-1 BPA treatment for 24 h had no significant effect on the viability of TM3 cells; However， an extremely significant inhibition of TM3 cell viability was observed followingin treatment with 40 μmol·L-1 BPA for 24 h （Plt;0.01）; In addition， after 20 μmol·L-1 BPA treatment on TM3 cells for 24 h， the testosterone content in the culture supernatant was extremely significantly lower than that in the CON group （Plt;0.01）， the mRNA expression level and protein expression of Apoa1 gene were extremely significantly elevated （Plt;0.001）， but there was no significant change in the mRNA expression level of Apoa2 andor Apoc3 genes; The accumulation of lipid droplets in TM3 cells was extremely significantly reduced by 20 μmol·L-1 BPA treatment for 24 h compared with the CON group （Plt;0.000 1）. In conclusion， BPA can reduce the lipid droplets accumulation in TM3 cells by up-regulating Apoa1 expression levels， enhancing reverse cholesterol transport （Reverse cholesterol transport， RCT）， leading to a decrease in testosterone synthesis in TM3 cells.

Key words： bisphenol A （BPA）; apolipoprotein A1 （Apoa1）; mouse Leydig cells （TM3）; testosterone （T）

*Corresponding author： ZHAO Lijia，E-mail： ljzhao@neau.edu.cn

雙酚A（bisphenol， BPA）是聚碳酸酯（polycarbonate， PC）塑料的主要成分，因其具有高強(qiáng)度和透明度等特性，在建筑、汽車、電子、醫(yī)療器械制造及航空航天等多個(gè)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用［1］。然而，由于BPA的高需求和大范圍使用，導(dǎo)致其在環(huán)境中大量積累，進(jìn)而在動(dòng)植物甚至人類體內(nèi)殘留［2］。經(jīng)調(diào)查研究顯示，BPA存在于人的血液、尿液甚至母乳中［3］。此外，當(dāng)生物攝入BPA后，通過(guò)食物鏈層層積累放大，更增加了生物群體的安全風(fēng)險(xiǎn)。大量研究表明，BPA暴露可引起內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、代謝和神經(jīng)行為等方面的疾?。?-7］。以往研究結(jié)果顯示，BPA可促使更多脂肪酸從脂肪組織向肝轉(zhuǎn)運(yùn)，刺激肝內(nèi)源性脂肪酸的生成，最終導(dǎo)致肝中甘油三酯的過(guò)度累積［8］。Kim等［9］研究表明，BPA暴露可引起成年小鼠糖脂代謝紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞異常分化和脂肪堆積，從而增加代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)［9］。然而，BPA是否通過(guò)影響脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成尚不清楚。

載脂蛋白（apolipoprotein）在體內(nèi)脂質(zhì)運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其有助于將水不溶性的膽固醇、甘油三酯和其他脂質(zhì)從一個(gè)組織或細(xì)胞轉(zhuǎn)移到其他組織或細(xì)胞，通過(guò)協(xié)助膽固醇的逆向運(yùn)輸和調(diào)節(jié)甘油三酯水平，以滿足機(jī)體能量需求、脂質(zhì)儲(chǔ)存及維護(hù)體內(nèi)的脂質(zhì)平衡。載脂蛋白家族成員主要包括APOA1（apolipoprotein A1）、APOA2（apolipoprotein A2）、APOB（apolipoprotein B）和APOC3（apolipoprotein C3）等蛋白，它們通過(guò)影響膽固醇和甘油三酯的運(yùn)輸和代謝，在脂質(zhì)代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10-11］。APOA1是高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）的主要成分，其通過(guò)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1（ATP-binding cassette transporter protein A1，ABCA1）與膽固醇結(jié)合生成HDL，將外周細(xì)胞內(nèi)的膽固醇運(yùn)回肝，這一生理過(guò)程被稱為膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport， RCT），有助于機(jī)體清除體內(nèi)多余的膽固醇［12］。已有研究表明，BPA通過(guò)調(diào)控稀有鰷魚啟動(dòng)子區(qū)Esr募集和DNA甲基化來(lái)上調(diào)睪丸Apoa1基因的表達(dá)，增加RCT，并降低睪丸中的膽固醇水平［13］。脂質(zhì)代謝紊亂已被證明與生殖異常存在關(guān)聯(lián)［10］。睪酮作為一種重要的類固醇激素，在雄性生長(zhǎng)發(fā)育、性欲維持、生殖功能、物質(zhì)代謝及衰老等生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用［14］。在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，膽固醇作為合成睪酮的前體，參與睪酮的合成過(guò)程［15］。Bernecic等［16］研究表明，膽固醇水平與睪酮含量呈正相關(guān)。因此，睪丸間質(zhì)細(xì)胞獲得足夠的膽固醇是產(chǎn)生睪酮并維持正常水平的必要前提。然而，Apoa1是否介導(dǎo)BPA暴露抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的研究鮮有報(bào)道。

本試驗(yàn)以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株TM3細(xì)胞為研究模型，經(jīng)BPA染毒24 h后，觀察細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)累積情況，檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA及蛋白的表達(dá)水平，評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的睪酮含量，為從脂質(zhì)代謝角度揭示BPA暴露抑制小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成機(jī)制提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株TM3細(xì)胞由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院李金龍教授惠贈(zèng)。

主要試劑：BPA（≥99%，Sigma，USA）、DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基（HyClone，USA）、10%胎牛血清（四季青，中國(guó)）、1%青霉素/鏈霉素溶液（HyClone，USA）、DMSO（細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)）（索萊寶，中國(guó)）、增強(qiáng)型CCK-8試劑盒（碧云天，中國(guó)）、RNA提取試劑RNAiso Plus（TaKaRa，日本）、PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，日本）、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO，日本）、增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（碧云天，中國(guó)）、雙色SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6×）（碧云天，中國(guó)）、PVDF膜（索萊寶，中國(guó)）、兔抗APOA1（Proteintech，USA）、鼠抗β-actin（生工，中國(guó)）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體（索萊寶，中國(guó)）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠抗體（生工，中國(guó)）、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（Bioss，中國(guó)）、3% Triton X-100、DAPI染色試劑、抗熒光淬滅封片劑、牛血清白蛋白（Biosharp，中國(guó)）、飽和油紅O染色液（索萊寶，中國(guó)）、睪酮檢測(cè)試劑盒（南京建成，中國(guó)）。

主要儀器：CO2培養(yǎng)箱（Boxun，中國(guó)），超凈工作臺(tái)（Boxun，中國(guó)），倒置顯微鏡（新惠澤奧，中國(guó)），Epoch型酶標(biāo)儀（BioTek，美國(guó)），line gene 9600型熒光定量PCR儀（BIOER，中國(guó)），iCEN-24R型高速冷凍離心機(jī)（奧盛儀器，中國(guó)），流式圖像計(jì)數(shù)儀（卓微，中國(guó)）、Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)（原平皓，中國(guó)）、徠卡DM IL LED熒光倒置顯微鏡（徠卡，德國(guó)）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BPA對(duì)TM3細(xì)胞的最適染毒劑量篩選

TM3細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶（含EDTA）消化后，將細(xì)胞密度稀釋為2×104個(gè)·mL-1，以100 μL·孔-1種于96孔板中，培養(yǎng)板四周孔中加入200 μL PBS作為保濕孔。將96孔板置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。吸棄全部培養(yǎng)液，分別加入含BPA濃度為0、5、10、20、40、60、80 μmol·L-1的培養(yǎng)液，并將每組中DMSO的濃度調(diào)至0.1%，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔中加入10 μL CCK-8試劑溶液，混勻后在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，之后于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)D值，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.2.2 睪酮含量測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TM3細(xì)胞，每孔2 mL密度為2.5×105個(gè)·mL-1細(xì)胞混懸液，接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素溶液的DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為2組，具體為對(duì)照組（0 μmol·L-1 BPA）和篩選出的對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響的BPA濃度組，每組3個(gè)重復(fù)，處理24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA試劑盒測(cè)定睪酮含量。在酶標(biāo)儀450 nm處讀取D值。

1.2.3 RNA提取和RT-qPCR

將TM3細(xì)胞按5×105個(gè)·孔-1密度接種于6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分組及處理時(shí)間同“1.2.2”。用TRIzol 法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，超微量紫外分光光度儀檢測(cè)總RNA的濃度和純度，A260/A280范圍為1.8～2.1，反轉(zhuǎn)錄采用20 μL體系，設(shè)置為37℃ 15 min，85℃ 5 s，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。根據(jù)GenBank中小鼠的Apoa1、Apoa2、Apoc3、Gapdh基因序列，使用Primer-Blast設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，序列見表1。采用20 μL體系，擴(kuò)增反應(yīng)條件設(shè)置為：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 5 s、55℃ 10 s、72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán)。以2 μL的cDNA為模板， Gapdh作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)Apoa1、Apoa2、Apoc3基因的mRNA的表達(dá)，按2-ΔΔCt計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot

將TM3細(xì)胞按5×105個(gè)·孔-1的密度接種于6孔板中，37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，分組方式及處理時(shí)間同“1.2.2”。收集細(xì)胞，提取蛋白后，使用增強(qiáng)型BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)濃度。按比例加入雙色SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（6×），95℃、5 min變性，-20℃保存。以β-actin為內(nèi)參蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，待蛋白分離之后，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液在25℃下封閉15 min后，加入抗APOA1抗體（1∶1 000）、抗β-actin 抗體（1∶500）于4℃孵育過(guò)夜。次日將膜取出TBST清洗3次，每次10 min；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗（1∶5000）37℃孵育1 h，經(jīng)TBST清洗3次后，用ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色。用Tanon 5200發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，運(yùn)用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度值分析，目的基因灰度值/內(nèi)參基因灰度值得出相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 免疫熒光

將TM3細(xì)胞接種于提前放置玻片的6孔板內(nèi)，每孔接入2×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，按照“1.2.2”的分組及處理時(shí)間進(jìn)行染毒。用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100室溫孵育5 min完成通透，以5%牛血清白蛋白封閉2 h。用PBS清洗，于爬片上滴加1∶200比例稀釋的一抗50 μL，濕盒內(nèi)4℃孵育過(guò)夜。第2日以PBS洗滌含細(xì)胞的爬片后，加1∶200稀釋的二抗50 μL，濕盒內(nèi)37℃避光孵育1 h后，再以PBS洗滌，加入DAPI染核，并用PBS洗滌，待爬片干后用抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察，拍照。每組隨機(jī)選擇3個(gè)不同視野，并運(yùn)用ImageJ軟件對(duì)3張圖片進(jìn)行量化分析。

1.2.6 油紅O染色

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分組及處理時(shí)間同“1.2.2”。吸去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次；加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗凈；油紅O染色30 min；PBS清洗3次；自來(lái)水充分沖洗后風(fēng)干，甘油明膠進(jìn)行封片，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的情況并采集圖像。每組隨機(jī)選擇三張圖片，采用ImageJ軟件進(jìn)行量化分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Graph Pad Prism 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各獨(dú)立試驗(yàn)至少重復(fù)3次，以Plt;0.05表示差異顯著。*表示CON組與BPA組比較差異顯著（P＜0.05），**、***、****表示CON組與BPA組比較差異極顯著（P＜0.01）。*代表Plt;0.05，**代表Plt;0.01，***代表Plt;0.001，****代表Plt;0.000 1。

2 結(jié) 果

2.1 BPA 對(duì) TM3 細(xì)胞活力的影響

為了篩選出BPA對(duì)TM3細(xì)胞活力無(wú)顯著影響的染毒劑量，將TM3細(xì)胞暴露于不同劑量的BPA（0、5、10、20、40、60、80 μmol·L-1）24 h后，使用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力。如圖1所示，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1 BPA處理對(duì)TM3細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響，但BPA濃度增加至40 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力極顯著降低（Plt;0.01）。此外，當(dāng)BPA濃度為60和80 μmol·L-1時(shí)，TM3細(xì)胞的細(xì)胞活力進(jìn)一步降低（Plt;0.000 1），表明隨著BPA劑量濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，呈劑量依賴性關(guān)系。上述結(jié)果說(shuō)明，BPA處理24 h對(duì)TM3細(xì)胞的細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響的最大濃度為20 μmol·L-1，因此本研究選用20 μmol·L-1 BPA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 BPA對(duì)TM3細(xì)胞睪酮含量的影響

為探討B(tài)PA暴露對(duì)TM3細(xì)胞睪酮合成含量的影響，本研究收集了經(jīng)BPA處理24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，運(yùn)用ELISA檢測(cè)其中的睪酮含量。結(jié)果如圖2所示，20 μmol·L-1 BPA處理組與對(duì)照組相比，TM3細(xì)胞培養(yǎng)上清中睪酮含量極顯著降低（Plt;0.01）。結(jié)果表明，20 μmol·L-1 BPA暴露24 h顯著抑制TM3細(xì)胞睪酮合成。

2.3 BPA對(duì)TM3細(xì)胞載脂蛋白相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

為探究BPA暴露抑制TM3細(xì)胞睪酮合成與脂質(zhì)代謝的關(guān)系，將TM3細(xì)胞分為對(duì)照組和20 μmol·L-1 BPA處理組，采用RT-qPCR檢測(cè)經(jīng)BPA處理24 h的TM3細(xì)胞載脂蛋白相關(guān)基因Apoa1、Apoa2、Apoc3 mRNA水平。結(jié)果如圖3A所示，與對(duì)照組相比，20 μmol·L-1 BPA處理組Apoa1基因mRNA表達(dá)水平極顯著增加（Plt;0.001），圖3B、3C顯示，Apoa2、Apoc3基因mRNA表達(dá)量與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，BPA暴露24 h能夠顯著上調(diào)TM3細(xì)胞中Apoa1 mRNA的表達(dá)，Apoa1表達(dá)增加會(huì)增強(qiáng)RCT過(guò)程，進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平發(fā)生改變，從而導(dǎo)致TM3細(xì)胞睪酮含量降低。

2.4 BPA對(duì)TM3細(xì)胞APOA1蛋白表達(dá)的影響

為驗(yàn)證BPA對(duì)APOA1蛋白的影響，本研究采用Werstern blot檢測(cè)APOA1蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果如圖4A所示，經(jīng)灰度值相關(guān)性分析并量化處理后，如圖4B所示，20 μmol·L-1 BPA處理組的APOA1蛋白表達(dá)水平相比于對(duì)照組極顯著增加（Plt;0.001）。結(jié)果表明，20 μmol·L-1 BPA處理24 h不僅能夠上調(diào)TM3細(xì)胞的Apoa1基因mRNA表達(dá)水平，還顯著提高了APOA1蛋白表達(dá)水平（Plt;0.001）。

2.5 免疫熒光測(cè)定BPA對(duì)TM3細(xì)胞APOA1蛋白表達(dá)的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證BPA對(duì)APOA1蛋白表達(dá)的影響，本研究通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)觀察細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)情況。如圖5A所示，與對(duì)照組相比20 μmol·L-1 BPA干預(yù)24 h后細(xì)胞內(nèi)APOA1熒光強(qiáng)度明顯變強(qiáng)。對(duì)熒光圖進(jìn)行量化分析，結(jié)果如圖5B所示，20 μmol·L-1 BPA處理組熒光強(qiáng)度極顯著高于對(duì)照組（Plt;0.01）。上述結(jié)果表明，20 μmol·L-1 BPA 處理極顯著上調(diào)了TM3細(xì)胞中APOA1的蛋白表達(dá)量，此結(jié)果與RT-qPCR及Western blot的結(jié)果一致。

2.6 BPA對(duì)TM3細(xì)胞脂滴含量的影響

脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的主要儲(chǔ)存部位，主要包括甘油三酯和膽固醇酯。睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)用于合成睪酮的膽固醇主要來(lái)源于脂滴的分解，脂滴的儲(chǔ)備量可以間接反映細(xì)胞內(nèi)部膽固醇的含量。本研究使用油紅O染色檢測(cè)了經(jīng)過(guò)20 μmol·L-1 BPA處理24 h的TM3細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化。結(jié)果如圖6A所示，對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)可見有大量紅色、大而圓的脂滴，20 μmol·L-1 BPA處理組的脂滴數(shù)量明顯少于對(duì)照組。量化分析結(jié)果如圖6B所示，20 μmol·L-1 BPA處理組脂滴積累量極顯著低于對(duì)照組（Plt;0.000 1）。結(jié)果表明，20 μmol·L-1 BPA處理能夠降低TM3細(xì)胞內(nèi)脂滴的累積，使細(xì)胞內(nèi)部的膽固醇含量減少，最終導(dǎo)致睪酮合成降低。

3 討 論

本研究以小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞株TM3細(xì)胞為研究對(duì)象，從脂質(zhì)代謝角度探討B(tài)PA是否通過(guò)Apoa1基因調(diào)控TM3細(xì)胞睪酮合成分泌。結(jié)果顯示，細(xì)胞存活率隨著BPA的染毒劑量增加而逐漸降低，表明BPA對(duì)細(xì)胞的損害呈劑量依賴性。BPA暴露極顯著提高了Apoa1基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平，并極顯著降低了TM3細(xì)胞的脂滴累積水平及睪酮分泌量。

BPA是一種無(wú)處不在的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，可引起生殖功能異常。睪酮對(duì)雄性性別分化、維持雄性第二性征和精子發(fā)生至關(guān)重要，而間質(zhì)細(xì)胞是睪酮合成分泌的主要場(chǎng)所，在維持睪酮水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用［17］。本研究CCK-8結(jié)果顯示，40 μmol·L-1 BPA處理TM3細(xì)胞24 h后，細(xì)胞活力出現(xiàn)了極顯著降低，而20 μmol·L-1 BPA對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著影響。Jambor等［18］研究結(jié)果表明，高濃度（10、25和50 μg·mL-1）的BPB（Bisphenol B）、BPA、BPF（Bisphenol F）和BPS（Bisphenol S）在體外培養(yǎng)48 h后顯著降低TM3細(xì)胞的活力，5 μg·mL-1 BPA暴露于TM3細(xì)胞，其代謝活性沒(méi)有受到顯著影響。Li等［19］也描述了類似的效果，其研究結(jié)果證實(shí)，當(dāng)BPA濃度分別為5、10和20 μg·mL-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力有顯著抑制作用（Plt;0.05、Plt;0.001），與本試驗(yàn)結(jié)果一致。Lan等［20］研究表明發(fā)現(xiàn)，MA-10細(xì)胞系（Mesenchymal stromal cell tumour cell lines）在小于96 μmol·L-1 BPA中培養(yǎng)1 h后不發(fā)生凋亡，在200 μmol·L-1 BPA染毒24 h后細(xì)胞活力顯著降低。Qian等［21］研究表明，小鼠TM4細(xì)胞暴露于0.02、0.2、2.0、20 μmol·L-1 BPA 12 h后，細(xì)胞沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的損傷，而在較高濃度（2或20 μmol·L-1）下染毒24 h，與對(duì)照組相比，細(xì)胞活力出現(xiàn)明顯的降低；而20 μmol·L-1 BPA孵育48 h明顯誘導(dǎo)TM4細(xì)胞凋亡。本研究與Lan等［20］及Qian等［21］報(bào)道使細(xì)胞活力顯著下降的BPA濃度有所不同，這可能是由于不同的細(xì)胞對(duì)BPA毒性的耐受程度不同，也可能是由于處理時(shí)長(zhǎng)的差異所造成。

APOA1是組成HDL的主要載脂蛋白，在HDL合成和RCT過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。已有研究表明，APOA1被廣泛認(rèn)為具有心臟保護(hù)功能，其機(jī)制主要是血清APOA1水平升高可以促進(jìn)RCT過(guò)程，降低血液中膽固醇水平，反之，APOA1缺乏則會(huì)產(chǎn)生相反的效果［22］。APOA2是HDL顆粒中含量第二高的載脂蛋白，在人血漿中以同源二聚體的形式存在。有研究顯示，Apoa2基因可增加內(nèi)臟脂肪積累［23］。APOC3可抑制脂蛋白脂肪酶對(duì)乳糜微粒和極低密度脂蛋白中三酰甘油的分解，并可抑制肝對(duì)殘余脂蛋白的攝取。Apoc3基因功能喪失性突變可導(dǎo)致三酰甘油分解加快，血漿中三酰甘油水平下降。已有研究表明，人體內(nèi)Apoc3基因過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致高三酰甘油血癥，進(jìn)而可能發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化［24］。睪丸中的膽固醇在很大程度上來(lái)自于內(nèi)源性合成和從血液中對(duì)脂蛋白的攝取，多余的膽固醇則通過(guò)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制運(yùn)回肝組織，最終排泄到膽汁中［25］。本研究中，qPCR結(jié)果顯示，在20 μmol·L-1 BPA暴露下，TM3細(xì)胞中的Apoa1 mRNA水平極顯著增加，而Apoa2、Apoc3的mRNA水平?jīng)]有顯著變化，結(jié)合油紅O染色的結(jié)果表明，TM3細(xì)胞中的脂滴含量降低，這表明BPA通過(guò)上調(diào)Apoa1的表達(dá)增強(qiáng)RCT過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的游離膽固醇含量降低，使TM3細(xì)胞的膽固醇代謝發(fā)生紊亂。Zhang等［26］研究結(jié)果顯示，BPA通過(guò)調(diào)節(jié)Apoa1基因的表達(dá)水平導(dǎo)致鰷魚睪丸膽固醇紊亂，這一發(fā)現(xiàn)在其他研究中也得到了證實(shí)，例如，雄性昆明鼠連續(xù)4周內(nèi)每天分別接受25 mg·kg-1 BPA灌胃喂后，睪丸中的膽固醇水平受到顯著抑制［27］，這與本研究相一致。此外，本研究的Western blot和免疫熒光結(jié)果也支持了這一觀點(diǎn)，提示BPA通過(guò)上調(diào)Apoa1基因的表達(dá)增強(qiáng)了RCT過(guò)程，進(jìn)而引起睪酮合成的前體物質(zhì)游離膽固醇（free cholesterol， FC）累積量顯著降低，導(dǎo)致TM3細(xì)胞睪酮合成受到抑制。

BPA是一種被廣泛認(rèn)知的內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素效應(yīng)。已有研究表明，BPA通過(guò)激活c-Jun磷酸化，誘導(dǎo)類固醇基因的表達(dá)，導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞和受BPA處理的動(dòng)物的睪酮/雌激素（testosterone/estrogen，T/E）比率顯著下降［28］。Hinfray等［29］研究推測(cè)，BPA可能通過(guò)調(diào)節(jié)性激素合成基因的表達(dá)來(lái)影響性激素合成分泌。此外，BPA還通過(guò)多種機(jī)制影響激素水平，包括對(duì)小鼠下丘腦-垂體-性腺軸的影響［30］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，BPA暴露會(huì)抑制嚙齒動(dòng)物的睪酮合成分泌［28］。然而以往的研究大多從睪酮合成基因及神經(jīng)體液調(diào)節(jié)方面開展，鮮有研究報(bào)道BPA影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞中膽固醇水平對(duì)睪酮合成和分泌的直接作用。脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂質(zhì)的主要儲(chǔ)存部位，其核心由中性脂肪組成，主要包括甘油三酯和膽固醇酯，由單層磷脂分子和圍繞核心的各種蛋白質(zhì)包裹。有研究證明，細(xì)胞內(nèi)脂滴水平在一定情況下可以反映游離膽固醇的水平，當(dāng)細(xì)胞需要膽固醇時(shí)，細(xì)胞內(nèi)脂滴進(jìn)行水解釋放膽固醇，這表明細(xì)胞內(nèi)高水平的脂滴通常意味著較高的膽固醇儲(chǔ)存［10］。因此，在一定條件下，脂滴水平可以間接反映出FC的水平［31］。FC是睪酮合成的前體物質(zhì)。已有研究證實(shí)，F(xiàn)C水平與性激素水平密切相關(guān)［32］。本研究對(duì)TM3細(xì)胞的脂滴水平進(jìn)行了檢測(cè)，油紅O染色結(jié)果顯示，BPA處理組的脂滴水平明顯少于對(duì)照組。因此，本研究為BPA暴露后睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮水平改變的機(jī)制提供了另一種可能的解釋。

本研究首次從BPA影響膽固醇水平的角度探討B(tài)PA對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成睪酮含量降低的機(jī)制，盡管目前僅限于小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3細(xì)胞株水平，但本研究已為BPA抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成的機(jī)制提供了新的見解。TM3細(xì)胞來(lái)源于雄性小鼠睪丸，其具有增殖能力強(qiáng)、易于傳代培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)。而小鼠原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞是從睪丸組織通過(guò)膠原酶消化法分離，Percoll等密度梯度離心法進(jìn)行純化等一系列方法獲得的細(xì)胞［33］。原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞相比于TM3細(xì)胞株，其細(xì)胞學(xué)特性未發(fā)生很大變化，仍保持原有的生物特征，可更好地反映細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而更易獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù)［34］。下一步本團(tuán)隊(duì)計(jì)劃開展小鼠原代睪丸間質(zhì)細(xì)胞和在體試驗(yàn)研究，以從更加全面的角度驗(yàn)證本研究的結(jié)論。

4 結(jié) 論

本研究旨在探究BPA暴露抑制TM3細(xì)胞睪酮合成的調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注其對(duì)Apoa1基因表達(dá)和膽固醇穩(wěn)態(tài)的影響。研究結(jié)果顯示，BPA暴露上調(diào)了TM3細(xì)胞中Apoa1基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平，減少了細(xì)胞內(nèi)脂滴的積累，從而導(dǎo)致睪酮的合成分泌降低。這一發(fā)現(xiàn)為從脂質(zhì)代謝角度深入了解BPA暴露導(dǎo)致TM3細(xì)胞睪酮含量降低的分子機(jī)制提供了新視角。

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（編輯 范子娟）