摘 要： 本試驗(yàn)旨在采用高通量測(cè)序技術(shù)，測(cè)定內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡時(shí)瘤胃及糞便真菌多樣性的定植規(guī)律，為后續(xù)絨山羊早期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)依據(jù)。選取按照?qǐng)鰠^(qū)正常生產(chǎn)管理并飼養(yǎng)的10、30、50、150日齡體重分別為（4.99±0.13）、（7.71±0.52）、（13.83±0.18）、（20.60±0.81）kg的內(nèi)蒙古白絨山羊母羔各3只（每只為1個(gè)重復(fù)，共12只），進(jìn)行屠宰、取瘤胃液（R組）及糞便（F組）。采用特異性引物對(duì)ITS1F/ITS2R擴(kuò)增瘤胃和糞便真菌ITS區(qū)，用Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明：1）本試驗(yàn)24個(gè)樣共獲得1 636 055條優(yōu)化序列（Clean tags），平均每個(gè)樣含有（68 168±24 317）條，每條序列平均長(zhǎng)度為（244±28）bp。2）隨日齡的增加，瘤胃和糞便真菌總OTUs以及與后一個(gè)日齡共享的OTUs開始時(shí)稍有降低，但隨后逐漸增加。10、30、50、150日齡時(shí)瘤胃和糞便共享的真菌OTUs分別占同日齡檢測(cè)到的瘤胃和糞便OTU總數(shù)的34.22%、20.87%、27.63%和20.53%。3）隨日齡的增加，瘤胃真菌群落Shannon、Simpson、Ace、Chao指數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05），而50、150日齡時(shí)糞便中真菌Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于10日齡組（Plt;0.05）。50日齡時(shí)瘤胃中真菌Shannon和Simpson指數(shù)分別顯著高于和低于糞便組（Plt;0.05）。4）50日齡和150日齡瘤胃真菌菌群β多樣性極顯著聚為一類（Plt;0.01），并與10日齡和30日齡瘤胃真菌菌群β多樣性極顯著分開（Plt;0.01）。50日齡和150日齡糞便真菌群落β多樣性分別極顯著獨(dú)立分布且與10日齡和30日齡糞便真菌群落β多樣性分開（Plt;0.01）。另外，150日齡瘤胃及糞便組內(nèi)真菌群落β多樣性相似度大于其他日齡組。5）當(dāng)日齡為10、30、50、150 d時(shí)，在門水平上瘤胃及糞便真菌組成相似，均為子囊菌門（Ascomycota）、未分類的真菌（Unclassified_k_fungi）、新美鞭菌門（Neocallimastigomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota），其中子囊菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。而在屬水平上瘤胃及糞便真菌組成稍有差異。瘤胃中豐度最高的物種在10、50日齡時(shí)均為未分類的真菌，在30、150日齡時(shí)分別為莢孢腔菌屬（Sporormiella）和酵母菌屬（Saccharomyces）。糞便中豐度最高的物種10、50日齡時(shí)分別為未分類的真菌和新美鞭菌屬（Neocallimastix），30、150日齡時(shí)分別為Cleistothelebolus和枝孢菌層（Cladosporium）。6）在門水平上的進(jìn)一步LefSe分析發(fā)現(xiàn)，新美鞭菌門無(wú)論是在150日齡內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃中還是在50日齡內(nèi)蒙古白絨山羊糞便中均是顯著富集的物種（Plt;0.05）；比較同日齡瘤胃和糞便真菌群落時(shí)，只有在150日齡瘤胃和糞便中分別顯著富集了未分類的真菌和子囊菌門。7）基于FUNGuild功能預(yù)測(cè)，瘤胃真菌在羔羊10、50日齡時(shí)分別以未分類營(yíng)養(yǎng)型（Unclassified）和病理營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph）為主，30、150日齡時(shí)均以腐生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph）為主。糞便真菌在10、150日齡時(shí)均以病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph）為主，30、50日齡時(shí)均以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主。由此可見，隨著內(nèi)蒙古白絨山羊羔羊的發(fā)育，瘤胃真菌群落逐漸有利于飼料中纖維的降解。幼齡時(shí)期瘤胃和糞便中還存在很多豐度較高且未分類的物種，其功能還未明確，因此還需要更深一步的研究。

關(guān)鍵詞： 高通量測(cè)序技術(shù)；內(nèi)蒙古白絨山羊；不同日齡；瘤胃；糞便；真菌多樣性

中圖分類號(hào)：S826.95

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3526-15

收稿日期：2023-09-28

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021MS03009）

作者簡(jiǎn)介：娜梅拉（1998-），女，內(nèi)蒙古赤峰人，博士生，主要從事動(dòng)物環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail： 969119894@qq.com

通信作者：娜仁花，主要從事動(dòng)物環(huán)境與營(yíng)養(yǎng)研究，E-mail： nrh0123456@hotmail.com

Study on the Differences of Fungal Diversity in Rumen and Feces of Inner Mongolia Cashmere

Goats at Different Ages

NA" Meila， LI" Kenan， DU" Haidong， GUO" Wenliang， NA" Renhua*

（College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，" China）

Abstract：" The purpose of this experiment was to determine the colonization of fungal diversity in rumen and feces of Inner Mongolia white cashmere goats at different ages by high-throughput sequencing technology， and to provide data basis for subsequent research on early nutritional regulation of cashmere goats. Three female lambs of Inner Mongolia white cashmere goats of each days of age （10，30，50 and 150） with body weight of （4.99±0.13）， （7.71±0.52）， （13.83±0.18） and （20.60±0.81） kg at 10， 30， 50 and 150 days of agerespectively were selected according to the normal production management and feeding in the farm area， each lamb was a replicate， all together 12 lambs， a total of 12）. They were slaughtered and rumen fluid （group R） and feces （group F） were taken. The ITS region of rumen and fecal fungi was amplified by specific primers ITS1F/ITS2R， and sequenced by Illumina Miseq PE300 platform. The results showed that ： 1） A total of 1 636 055 clean tags were obtained from 24 samples in this experiment， with an average of （68 168±24 317） clean tags per sample and an average length of （244±28） bp per sequence. 2） With the increase of age， the total OTU of rumen and fecal fungi and the OTU shared with the next day-of-age decreased slightly at first， but then increased gradually. The fungal OTUs shared by rumen and feces at 10，30，50 and 150 days of age accounted for 34.22%， 20.87%， 27.63% and 20.53% of the total number of OTUs detected in rumen and feces at the same age， respectively. 3） There was no significant difference in Shannon， Simpson， Ace and Chao indexes of rumen fungal community with the increase of age （Pgt;0.05）， but the Shannon and Simpson indexes of fecal fungi at 50 and 150 days of age were significantly higher and lower than those at 10 days of age， respectively （Plt;0.05）. At 50 days of age， the Shannon and Simpson index of fungi in rumen were significantly higher and lower than those in fecal group （Plt;0.05）. 4） The β diversity of rumen fungi at 50 days of age and 150 days of age was significantly clustered into one group （Plt;0.01）， and was significantly separated from the β diversity of rumen fungi at 10 days of age and 30 days of age （Plt;0.01）. The β diversity of fecal fungi of 50-day-old and 150-day-old were significantly independent distribution and the β diversity of fecal fungi ofwere seperated from 10-day-old and 30-day-old were significantly independent distribution （Plt;0.01）. In addition， the similarity of fungi β diversity in rumen and feces groups at 150 days of age was higher than that in other age groups. 5） At 10，30，50 and 150 days of age， the composition of rumen and fecal fungi was similar at the phylum level， which were Ascomycota， Unclassified_k_fungi， Neocallimastigomycota， Basidiomycota and Mortierellomycota， among which Ascomycota was dominant. At the genus level， the composition of rumen and fecal fungi was slightly different. The species with the highest abundance in rumen were Unclassified_k_fungi at 10 and 50 days of age， Sporormiella and Saccharomyces at 30 and 150 days of age， respectively. The species with the highest abundance in feces were Unclassified_k_fungi and Neocallimastix at 10 and 50 days of age， respectively， and Cleistothelebolus and Cladosporium at 50 and 150 days of age， respectively. 6） Further LefSe analysis at the phylum level showed that Neocallimastigomycota was significantly enriched in the rumen aged 150 days and in feces of Inner Mongolia Cashmere Goat aged 50 days（Plt;0.05）. When comparing the rumen and fecal fungal communities at the same age， Unclassified_k_fungi and Ascomycota were significantly enriched only in the rumen and feces at 150 days of age. 7） Based on FUNGuild function prediction， rumen fungi were dominated by Unclassified and Pathotroph at 10 and 50 days of age， respectively， and Saprotroph was dominant at 30 and 150 days of age. Fecal fungi were mainly Pathotroph-Saprotroph-Symbiotroph at 10 and 150 days of age， and Saprotroph at 30 and 50 days of age. It can be seenconcluded that with the development of Inner Mongolia Cashmere Goat lambs， the rumen fungal community is gradually conducive to the degradation of fiber in the feed， and the digestion ability is significantly enhanced. There are still many high-abundance and unclassified species in the rumen and feces of young age， and their functions are not yet clear， so further research is needed.

Key words： high-throughput sequencing technology; Inner Mongolia white cashmere goat; different days of age; rumen; feces; fungal diversity

*Corresponding author： NA Renhua，E-mail： nrh0123456@hotmail.com

內(nèi)蒙古白絨山羊是中國(guó)優(yōu)良絨山羊品種之一，所產(chǎn)的羊絨品質(zhì)優(yōu)良，享譽(yù)世界，對(duì)我國(guó)的羊絨生產(chǎn)業(yè)有很大貢獻(xiàn)。反芻動(dòng)物的生產(chǎn)力主要由瘤胃微生物驅(qū)動(dòng)，瘤胃微生物包括細(xì)菌、產(chǎn)甲烷菌、真菌和原蟲等功能性微生物群，使瘤胃變成了復(fù)雜而完善的生態(tài)環(huán)境。其中瘤胃真菌占瘤胃微生物的5%～20%，主要降解纖維素，在降低木質(zhì)素對(duì)瘤胃負(fù)面影響的同時(shí)還可產(chǎn)生50%以上的可發(fā)酵糖［1-3］。已有研究證明，在無(wú)細(xì)菌條件下，瘤胃中真菌能降解粗飼料中62%的干物質(zhì)［4］。真菌不僅能利用其特有的假根系統(tǒng)附著于粗飼料的木質(zhì)化組織進(jìn)行物理性降解，還可以分泌大量纖維素酶、木質(zhì)素酶等相關(guān)水解酶對(duì)植物中的結(jié)構(gòu)性多糖和非結(jié)構(gòu)性多糖進(jìn)行化學(xué)性降解，同時(shí)有利于其他瘤胃微生物附著于粗飼料表面進(jìn)行分解，進(jìn)而生成醋酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、H2、CO2、甲酸鹽等代謝終產(chǎn)物［5-7］。另外，瘤胃真菌還具備了降解蛋白質(zhì)和淀粉的能力［2，8］。除此之外，腸道微生物也參與宿主的發(fā)育和進(jìn)化，其中腸道真菌不僅能夠抵御多種病原細(xì)菌的侵入，還會(huì)影響除腸道外免疫器官的形成和免疫反應(yīng)［9-10］。據(jù)研究報(bào)道，在健康狀態(tài)下的腸道真菌與宿主之間是互惠或偏利共生的關(guān)系［11］。糞便主要是由食物殘?jiān)⑺趾臀⑸飿?gòu)成，含有未被消化道吸收利用的物質(zhì)，是機(jī)體代謝物的主要排泄形式，因而糞便菌群群落也是反映動(dòng)物健康的關(guān)鍵因素。另外，糞便真菌還具有參與糞的降解和礦化的功能［12］，是草原生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。因此研究糞便微生物群落隨日齡的變化和與瘤胃微生物的區(qū)別也有一定的生物學(xué)意義。據(jù)研究，反芻動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系受到年齡、遺傳、飼糧等多個(gè)因素的影響［13］。近年來(lái)基于ITS（Internal Transcribed Spacer）基因進(jìn)行DNA測(cè)序是系統(tǒng)進(jìn)化分類真菌過(guò)程中既相對(duì)變化又穩(wěn)定的方法。因此，本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同日齡的內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌的組成和多樣性進(jìn)行縱向和橫向比較，探討幼齡時(shí)期真菌的定植規(guī)律，有助于為反芻動(dòng)物早期營(yíng)養(yǎng)調(diào)控相關(guān)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市土默特左旗金來(lái)牧業(yè)科技有限公司分別隨機(jī)選取10、30、50、150日齡體重分別為（4.99±0.13）、（7.71±0.52）、（13.83±0.18）、（20.60±0.81）kg的健康發(fā)育的白絨山羊母羔各3只，每只為1個(gè)重復(fù)，共12只。飼養(yǎng)按照?qǐng)鰠^(qū)正常的生產(chǎn)管理：從初生到20日齡，自由吸吮母乳；20到90日齡，除母乳外補(bǔ)飼精料（大北農(nóng)981號(hào)精料）和苜蓿干草；91日齡斷奶，斷奶后飼喂同一種成年絨山羊料。飼料放入干凈食槽中自由采食，自由飲水。

1.2 樣品的采集及處理

宰前24 h禁食，屠宰過(guò)程符合動(dòng)物福利規(guī)程，按照試驗(yàn)動(dòng)物的解剖標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程及生物樣品的采集對(duì)瘤胃液及糞便進(jìn)行取樣，并分別記作R組（瘤胃液樣品）和F組（糞便樣品），并按日齡分別記作R10、R30、R50、R150、F10、F30、F50、F150。瘤胃液采集方法：每只羊需要采集瘤胃液15 mL，分別用4層紗布過(guò)濾，分裝于2個(gè)2 mL的凍存管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，待測(cè)；糞便采集方法：從直腸末端處采集糞便約5 g，直接分裝于2個(gè)2.0 mL 的凍存管中，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，待測(cè)。

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增及Illumina Miseq測(cè)序

將采集的樣品解凍后，使用FastDNA Spin Kit for Soil試劑盒（MP Biomedicals， 美國(guó)）提取瘤胃及糞便真菌的總DNA。并以真菌總DNA為模板，使用引物ITS1F（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）和ITS2R（5′-GCTGCGTTCTTC-ATCGATGC-3′）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR采用的反應(yīng)體系包括：5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol·L-1 dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL、下游引物（5 μmol·L-1） 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、10 ng DNA模板、補(bǔ)ddH2O至20 μL。每個(gè)樣本3個(gè)PCR 重復(fù)，將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合；使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。使用Axyprep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行產(chǎn)物純化。之后將PCR產(chǎn)物用 QuantusTM Fluorometer 進(jìn)行檢測(cè)定量。按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合。最后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，利用Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。以上委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用FASTQ軟件對(duì)原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾，F(xiàn)LASH軟件進(jìn)行拼接，UPARSE軟件對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類（根據(jù)97%的相似度），用RDP classifier 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%，得到物種分類水平上（門、屬）的分類信息表。根據(jù)OTU聚類分析結(jié)果信息，采用Mothur 1.30.2軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)。當(dāng)數(shù)據(jù)非正態(tài)分布時(shí)，使用T檢驗(yàn)對(duì)數(shù)值進(jìn)行比較。使用加權(quán)遺傳距離矩陣（weighted unifrac distance）計(jì)算并使用R語(yǔ)言（version 3.3.1）構(gòu)建主坐標(biāo)分析圖（PCoA分析）?；诜菂?shù)因子克魯斯卡爾-沃利斯秩和驗(yàn)檢（non-parametric factorial Kruskal-Wallis sum-rank test），使用線性判別分析（linear discriminant analysis， LDA）檢測(cè)門水平上具有顯著豐度差異特征的物種（LDA評(píng)分≥4，P≤0.05）。通過(guò)FUNGuild預(yù)測(cè)對(duì)真菌群落營(yíng)養(yǎng)型進(jìn)行分類分析。使用美吉生物云平合（https：∥cloud.majorbio.com）進(jìn)行部分?jǐn)?shù)據(jù)分析與圖表制作，使用Excel 2019對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，應(yīng)用SAS 9.2單因素方差分析（one-way ANOVA） 并對(duì)差異顯著者進(jìn)行Duncan氏法多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，Pgt;0.05表示差異不顯著，P≤0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各樣品測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

經(jīng)Illumina MiSeq高通量測(cè)序，本試驗(yàn)24個(gè)樣品共獲得1 636 055條優(yōu)化序列（Clean tags），平均每個(gè)樣品含有（68 168±24 317）條，每條序列平均長(zhǎng)度為（244±28）bp。由樣本的稀釋曲線（圖1）可知，隨著樣本數(shù)目的增加，其稀釋曲線趨于平緩，測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，說(shuō)明本次測(cè)序量和測(cè)序深度合理，足夠覆蓋每組樣品的多數(shù)真菌，可以進(jìn)行后續(xù)分析。

2.2 基于OTU的物種Venn圖分析

本試驗(yàn)中8組共有3 192個(gè)OTUs，其中R組有1 779個(gè)OTUs，F(xiàn)組有1 413個(gè)OTUs，R10、R30、R50、R150、F10、F30、F50、F150分別有757、295、344、383、520、213、235、445個(gè)OTUs。由圖2A可知，8組共享的OTU有23個(gè)，R組特有的OTU有359個(gè)，F(xiàn)組獨(dú)有的OTU有304個(gè)。由圖2B可知，R組內(nèi)，4個(gè)日齡共享的真菌OTU有71個(gè)，R10組與R30、R50、R150組共享的OTU分別有142、136、142個(gè)，R30組與R50、R150組共享的OTU分別均有120個(gè)，R50組與R150組共享的OTU有250個(gè)。由圖2C可知，F(xiàn)組內(nèi)，4個(gè)不同日齡組共享的真菌OTU有35個(gè)，F(xiàn)10組與F30、F50、F150組共享的OTU分別有66、52、82個(gè)，F(xiàn)30組與F50、F150組共享的OTU分別有65、98個(gè)，F(xiàn)50組與F150組共享的OTU有126個(gè)。由圖2D～G可知，10、30、50日齡時(shí)，R組真菌總OTU與獨(dú)有的OTU均大于F組，而150日齡時(shí)F組真菌總OTU與獨(dú)有的OTU大于R組，R組與F組共有的OTU分別有437、106、160、170個(gè)。

2.3 α多樣性分析

8組樣品覆蓋率均大于99.82%，表明本次測(cè)序能夠反映出較好的真菌多樣性。內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性指數(shù)見表1。在4個(gè)不同日齡組間，R組Shannon、Simpson、Ace和Chao指數(shù)差異不顯著（Pgt;0.05）。F組50和150日齡時(shí)真菌Shannon指數(shù)顯著高于10日齡組（Plt;0.05），而其Simpson指數(shù)則顯著低于10日齡組（Plt;0.05）；比較同一個(gè)日齡組發(fā)現(xiàn)，50日齡時(shí)，R組Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別顯著大于和小于F組（Plt;0.05）。

2.4 β多樣性分析

由圖3A可知，R組50日齡和150日齡組樣本極顯著聚為一類（Plt;0.01），并與10日齡和30日齡組樣本極顯著分開（Plt;0.01），并且組內(nèi)相似度會(huì)隨日齡的增加而增高。由圖3B可知，F(xiàn)組50日齡和150日齡組樣本分別均極顯著獨(dú)立分布與10日齡和30日齡組樣本（Plt;0.01），而且150日齡組內(nèi)相似度較大。由圖3C～F可知，從10日齡到150日齡，R組與F組間差異會(huì)越來(lái)越大。此外，F(xiàn)組組內(nèi)個(gè)體的聚集程度相比R組會(huì)隨日齡的增加而較快增高。

2.5 不同分類水平上真菌群落組成及相對(duì)豐度

在不同分類水平上對(duì)測(cè)序所得到的有效序列進(jìn)行物種注釋和統(tǒng)計(jì)，24個(gè)樣品共檢測(cè)到12個(gè)門、32個(gè)綱、78個(gè)目、183個(gè)科、365個(gè)屬。

2.5.1 門水平上真菌群落組成及相對(duì)豐度

在門水平上對(duì)10、30、50、150日齡R組與F組相對(duì)豐度大于1%的物種進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。由表2、圖4可知，R組與F組豐度最高的前5個(gè)物種均為子囊菌門、未分類的真菌、新美鞭菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉門，其中子囊菌門是4個(gè)日齡階段每組中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的物種。R組中，10日齡時(shí)子囊菌門豐度顯著低于，而被孢霉門豐度顯著高于其他三個(gè)日齡組（P≤0.05）。新美鞭菌門豐度50、150日齡時(shí)顯著高于10、30日齡組（Plt;0.05）。F組中，新美鞭菌門相對(duì)豐度50日齡時(shí)極顯著大于其他三個(gè)日齡組（Plt;0.01）。

2.5.2 屬水平上真菌群落組成及相對(duì)豐度

在屬水平上對(duì)10、30、50、150日齡R組與F組相對(duì)豐度大于2%的物種進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。由表3、圖5可知R組與F組相對(duì)豐度最高的前10個(gè)菌屬。在R組，酵母菌屬豐度150日齡時(shí)極顯著高于其他三個(gè)日齡組（Plt;0.01）。殼二孢屬（Ascochyta）相對(duì)豐度150日齡時(shí)極顯著高于10、30日齡組，而極顯著低于50日齡組（Plt;0.01）。被孢霉門相對(duì)豐度10日齡時(shí)顯著高于其他三個(gè)日齡組（P≤0.05）；在F組，枝孢菌屬（Cladosporium）相對(duì)豐度50日齡時(shí)極顯著高于10、30日齡組，而極顯著低于150日齡組（Plt;0.01）。青霉菌屬（Penicillium）豐度150日齡時(shí)極顯著高于其他三個(gè)日齡組（Plt;0.01）。新美鞭菌屬相對(duì)豐度50日齡時(shí)顯著大于其他三個(gè)日齡組（P≤0.01）。

2.6 真菌群落LEfSe多級(jí)物種差異判別分析

由圖6可知，在R組中，子囊菌門顯著富集在30日齡組，新美鞭菌門顯著富集在150日齡組。在F組中，擔(dān)子菌門顯著富集在30日齡組，新美鞭菌門顯著富集在50日齡組；另外，通過(guò)分析同日齡R組和F組真菌群落發(fā)現(xiàn)，10、30、50日齡時(shí)沒有顯著差異的物種，150日齡時(shí)R組和F組中分別顯著富集了未分類的真菌和子囊菌門。

2.7 真菌群落功能預(yù)測(cè)分析

由表4可知，R組中，在羔羊10、50日齡時(shí)分別以未分類營(yíng)養(yǎng)型和病理營(yíng)養(yǎng)型為主，在羔羊30、150日齡時(shí)均以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主。其中病理營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度在50、150日齡時(shí)顯著高于10日齡組，病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Saprotroph）真菌豐度在30日齡時(shí)顯著高于其他3個(gè)日齡組（Plt;0.05）。F組中，10、150日齡時(shí)均以病理-腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型為主，30、50日齡時(shí)均以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主。病理-腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌豐度在50、150日齡時(shí)顯著高于10日齡組（Plt;0.05）。除此之外，本試驗(yàn)還檢測(cè)到了共生營(yíng)養(yǎng)型（Symbiotroph）、腐生-共生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph-Symbiotroph）、病理-共生營(yíng)養(yǎng)型（Pathotroph-Symbiotroph）、腐生-病理-共生營(yíng)養(yǎng)型（Saprotroph-Pathotroph-Symbiotroph）為主的真菌。

3 討 論

3.1 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌基于OTU的Venn圖分析

Venn圖可用于統(tǒng)計(jì)多組所共有和獨(dú)有的物種（如OTU）數(shù)目。在本試驗(yàn)中，隨日齡的增加，瘤胃和糞便中的真菌總OTU以及與后一個(gè)日齡共享的真菌OTU開始時(shí)稍有降低，但隨后會(huì)逐漸增加。是由于發(fā)育早期羔羊瘤胃功能還不完善，內(nèi)環(huán)境還

未建立有效的競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制以及穩(wěn)定的微生物區(qū)系，主要依靠食管溝閉合反射來(lái)攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與能量，因此，母體和外界環(huán)境中的微生物易在胃腸道內(nèi)定植，從而10日齡時(shí)檢測(cè)到的瘤胃和糞便真菌物種較多。之后經(jīng)過(guò)適應(yīng)和選擇在胃腸道中存活、增殖，并逐漸形成穩(wěn)定的微生物區(qū)系［14-16］，使檢測(cè)到的物種數(shù)量先降低后增加。并且據(jù)研究證實(shí)，幼齡山羊出生后0～14日齡時(shí)易受到母體、日糧以及外界環(huán)境各方面因素的影響，14～28日齡期間不同種屬的瘤胃真菌群落會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)而導(dǎo)致其含量會(huì)發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，28～56日齡時(shí)瘤胃真菌群落趨于穩(wěn)定平衡［17］。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，在羔羊10、30、50、150日齡時(shí)瘤胃和糞便共享的真菌OTU分別占同日齡檢測(cè)到的瘤胃及糞便OTU總數(shù)的34.22%、20.87%、27.63%和20.53%。因此，內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便中真菌結(jié)構(gòu)差異較大。

3.2 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性的分析

α多樣性分析可以反映微生物的多樣性和豐度。其中Shannon和Simpson指數(shù)綜合反映微生物群落的多樣性和均勻度。Shannon 指數(shù)值越高，Simpson 指數(shù)值越小，表明群落的多樣性越高，各物種個(gè)體數(shù)量越多。Ace和Chao指數(shù)用于表示微生物豐富度，其指數(shù)越大代表物種總數(shù)越多，群落的豐富度越高。已有研究表明，反芻動(dòng)物胃腸道微生物多樣性指數(shù)會(huì)隨年齡的增長(zhǎng)而升高［18］。劉潔等［19］的研究也表明，日齡能顯著影響羔羊（道賽特羊、湖羊和小尾寒羊）瘤胃及直腸真菌α多樣性，而不同品種之間的差異不明顯。葉倩文等［20］的研究中，一月齡內(nèi)羔羊腸道菌群α多樣性顯著低于斷奶后。本研究中，隨日齡的增加糞便真菌α多樣性會(huì)顯著增加，但日齡不能顯著影響瘤胃真菌α多樣性。可能是由于本試驗(yàn)僅選擇了5月齡內(nèi)羔羊而導(dǎo)致與上述研究不盡相同。微生物群落的豐度越高，意味著動(dòng)物分解飲食的效率就越高［21］，本試驗(yàn)中瘤胃及糞便真菌豐富度總體上有隨日齡的增長(zhǎng)而增高的趨勢(shì)，由此可知，隨日齡的增加瘤胃中功能性真菌群落逐漸定植并發(fā)揮作用中。瘤胃微生物多樣性與維持穩(wěn)定的微生物群落密切相關(guān)，較高的微生物多樣性對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性和抵抗力［22］。本試驗(yàn)在4個(gè)日齡階段瘤胃及糞便中真菌多樣的波動(dòng)表明，在羔羊發(fā)育早期動(dòng)物胃腸道內(nèi)還沒形成穩(wěn)定的微生物生態(tài)環(huán)境。

本研究比較同一個(gè)日齡瘤胃及糞便真菌α多樣性發(fā)現(xiàn)，瘤胃真菌多樣性均高于糞便組，其中50日齡時(shí)差異顯著；瘤胃組真菌豐富度指數(shù)10、30、50日齡時(shí)均大于糞便組，150日齡時(shí)小于糞便組，但差異不顯著。王繼文等［23］也發(fā)現(xiàn)，10月齡山羊瘤胃及糞便α多樣性沒有顯著差異，但數(shù)值上糞便組的各項(xiàng)指標(biāo)略大于瘤胃組的。王遁剛等［9］研究發(fā)現(xiàn)，6月齡藏系綿羊瘤胃微生物Ace和Chao1指數(shù)顯著高于糞便組，而Shannon和Simpson指數(shù)兩組間無(wú)顯著差異。并諸多研究證明，當(dāng)斷奶日齡、日糧精粗比或營(yíng)養(yǎng)水平不同時(shí)，瘤胃真菌菌群會(huì)發(fā)生顯著變化［2-3，24］。

3.3 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌β多樣性的分析

β多樣性用于分析分組間微生物組成的相似及差異。其中PCoA聚類分析是從復(fù)雜數(shù)據(jù)中提取和可視化最主要的元素和結(jié)構(gòu)，圖中點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離便可以反映微生物相似性或差異性。從本試驗(yàn)PCoA聚類圖結(jié)果得知，隨日齡的增加，瘤胃和糞便組間真菌組成差異會(huì)逐漸增大，并組內(nèi)相似度會(huì)隨日齡的增加而增大，其中糞便組內(nèi)差異會(huì)較快降低。說(shuō)明隨著日齡的增加瘤胃和糞便真菌群落不斷被演替著，其中糞便菌群群落逐漸趨于較高的穩(wěn)定性。這是因?yàn)榱鑫肝⑸锶郝涫秋暳侠眯手械暮诵?，通過(guò)發(fā)酵飼料活性調(diào)節(jié)宿主可獲得的能量［11］，因此反芻初階段瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定較慢。6月齡藏系綿羊與10月齡山羊瘤胃微生物群落均與糞便微生物清晰地分開，且糞便組內(nèi)相似度高于瘤胃組。Meale等［25］的研究中，隨著動(dòng)物由非反芻階段轉(zhuǎn)到反芻階，犢牛腸道微生物群會(huì)重組。以上結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

3.4 內(nèi)蒙古白絨山羊不同日齡瘤胃及糞便真菌的組成、相對(duì)豐度及物種差異分析

據(jù)研究，已知98%的真菌都屬于子囊菌門和擔(dān)子菌門［26］。本研究發(fā)現(xiàn)，10、30、50、150日齡時(shí)內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌前5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門組成相似，均為子囊菌門、未分類的真菌、新美鞭菌門、擔(dān)子菌門和被孢霉菌門。以往研究中，綿羊、山羊、奶牛及馬等其他反芻動(dòng)物瘤胃和糞便真菌在門水平上的組成也與本試驗(yàn)相似［27-29］。因此，在門水平上在以上的幾種動(dòng)物類群間，其瘤胃和糞便真菌菌群結(jié)構(gòu)在有相似之處，但在屬水平上的瘤胃和糞便真菌組成稍有差距，且不同物種之間同一個(gè)采樣部位間的菌屬也有差異。王彩蝶等［30］的研究中，哈薩克羊瘤胃真菌優(yōu)勢(shì)菌屬為假絲酵母屬（Candida）、假散囊菌屬（Pseudeurotium）和梅奇酵母屬（Metschnikowia）等。灘羊瘤胃中真菌豐度較高的菌屬為梨霉菌屬、廣義釀酒酵母菌屬和裂褶菌屬［31］。伊犁馬腸道中的優(yōu)勢(shì)菌為隱球酵母菌屬（Cryptococcus）和畢赤酵母屬（Pichia）［31］。

本試驗(yàn)中，在門水平上，隨日齡的增加瘤胃中子囊菌門和新美鞭菌門豐度會(huì)增加。并在4個(gè)日齡階段，子囊菌門在瘤胃中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，150日齡時(shí)瘤胃中顯著富集新美鞭菌門。韓旭峰［32］的研究中，甚至2周歲陜北絨山羊瘤胃真菌優(yōu)勢(shì)菌門同樣為子囊菌門。這主要是因?yàn)殡S著生長(zhǎng)發(fā)育，羔羊逐漸習(xí)慣采食粗飼料且使瘤胃初具消化粗飼料的能力，使功能性菌種定植而導(dǎo)致的。而瘤胃真菌雖然只占整個(gè)瘤胃微生物的5%～20%，但其降解植物纖維的能力要超過(guò)整個(gè)細(xì)菌群體［33］。其中子囊菌門是真菌界最大的一類微生物，瘤胃中不僅能夠?yàn)閰捬醢l(fā)酵環(huán)境清除氧氣，而且主要參與木質(zhì)素和角蛋白等有機(jī)物質(zhì)的降解過(guò)程［34-36］。新美鞭菌門廣泛存在于反芻動(dòng)物胃腸道中，參與木質(zhì)化纖維素、蛋白質(zhì)和淀粉降解的專性厭氧菌，并為宿主提供所需要的營(yíng)養(yǎng)成分［37-38］。本試驗(yàn)中，被孢霉門豐度與子囊菌門和新美鞭菌門豐度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但其在瘤胃中的功能還未明確報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。在屬水平上，隨日齡的增加，瘤胃中酵母菌屬豐度會(huì)極顯著增加，而孢霉菌屬豐度會(huì)顯著減少。其中酵母菌屬和孢霉菌屬分別屬于子囊菌門和孢霉菌門。酵母菌屬有利于動(dòng)物生長(zhǎng)性能及自身健康，具有分泌較高活性的消化酶的作用，并其產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物（B族微生物、氨基酸等）能夠被動(dòng)物直接吸收利用［39］。另外，張潔等［31］研究發(fā)現(xiàn)，9月齡舍飼灘羊瘤胃真菌以子囊菌門為主，而放牧組以新美鞭菌門為主。與喂食高谷物日糧相比，喂食高纖維日糧的動(dòng)物瘤胃中屬于新美鞭菌門的物種的多樣性更豐富達(dá)到70%［40］。Mao等［41］研究中，山羊（體重為25±3 kg）瘤胃真菌群落的優(yōu)勢(shì)菌屬為新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬和瘤胃壺菌屬，與本研究得結(jié)果不一致。Boots等［42］研究表明，飼喂高纖維日糧和谷物的閹牛瘤胃真菌組成不同。因此，除了年齡，日糧組成也是導(dǎo)致瘤胃真菌菌種組成差異的關(guān)鍵因素。

在門水平上，50日齡時(shí)糞便中顯著富集新美鞭菌門。屬水平上，隨日齡的增加，糞便中青霉菌屬和枝孢菌屬豐度會(huì)極顯著增加，并50日齡時(shí)新美鞭菌屬的豐度顯著增加。其中，青霉菌屬屬于子囊菌門，是最具有代表性的絲狀真菌菌屬之一，不僅對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素有很強(qiáng)的降解作用，還能分解胞外酶，也是溶磷微生物的重要類群［43-46］。根據(jù)CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)，由真核宏基因組微生物基因組（eukMAGs）為代表的新美鞭菌屬每個(gè)基因組中包含100種以上的各類型碳水化合物活性酶（CAZyme），且僅在經(jīng)過(guò)抗生素處理（青霉素-鏈霉素（PS）或氯霉素（CM））和培養(yǎng)的菌群中富集［42］。枝孢菌屬屬于芽枝霉門，研究表明，枝孢菌屬的含量下降對(duì)腸道健康和免疫功能有負(fù)面影響［47］。因此，本試驗(yàn)結(jié)果能間接表明隨日齡的增加羔羊消化能力在明顯變強(qiáng)，并機(jī)體功能在逐漸增強(qiáng)。

在4個(gè)日齡階段，從瘤胃和糞便真菌菌群組成來(lái)看，子囊菌門豐度最高，在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化過(guò)程中以腐生為主。并使用FUNGuid的功能預(yù)測(cè)表明，10日齡后，50日齡時(shí)瘤胃真菌菌群以病理營(yíng)養(yǎng)型為主，其余的都以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主。因此內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便真菌主要以腐生營(yíng)養(yǎng)型為主。腐生營(yíng)養(yǎng)型真菌主要分解瘤胃內(nèi)的有機(jī)物質(zhì)［48］。病原營(yíng)養(yǎng)型真菌從宿主獲得營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，易造成植物病害，而共生營(yíng)養(yǎng)型真菌則對(duì)植株生長(zhǎng)和品質(zhì)等產(chǎn)生有益作用［49］。

另外，無(wú)論是在門水平上還是在屬水平上，內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃和糞便中有大量未分類的真菌，特別在10日齡羔羊瘤胃和糞便中，其豐度隨日齡的增加而減少。而且10日齡時(shí)瘤胃及糞便真菌菌群均以未分類的營(yíng)養(yǎng)型為主，其隨日齡的變化趨勢(shì)與未分類真菌豐度的變化相符合，因此10日齡時(shí)有主導(dǎo)作用的未分類營(yíng)養(yǎng)型與大量未分類真菌有直接關(guān)系。這些未分類的真菌可能對(duì)消化母乳時(shí)有著一定的作用，需要進(jìn)一步探索以深入了解反芻動(dòng)物真菌生態(tài)系。

4 結(jié) 論

4.1 本試驗(yàn)中日齡會(huì)顯著影響內(nèi)蒙古白絨山羊瘤胃及糞便中真菌群落的β多樣性、物種組成和豐度、顯著富集的物種以及真菌的營(yíng)養(yǎng)型，而對(duì)瘤胃α多樣性的影響不顯著。

4.2 比較同一個(gè)日齡瘤胃及糞便真菌群落時(shí)發(fā)現(xiàn)，150日齡時(shí)糞便真菌總OTU、Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均小于瘤胃真菌。瘤胃和糞便真菌菌群組成、β多樣性和顯著富集的物種、真菌營(yíng)養(yǎng)型存在一定的差異。

4.3 瘤胃和糞便中還有很多豐度較高的未分類菌群，對(duì)此還需要進(jìn)一步研究。

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（編輯 范子娟）