摘 要： 本研究旨在建立一種基于豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）S基因便捷、高效和特異的由重組酶介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增（recombinase-aid amplification，RAA）檢測(cè)方法。通過(guò)基因組序列比對(duì)，選擇TGEV S基因中特定片段為檢測(cè)靶標(biāo)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-S，設(shè)計(jì)并篩選RAA引物和探針；建立RAA檢測(cè)方法；評(píng)價(jià)該方法靈敏度、特異性和重復(fù)性；運(yùn)用該方法檢測(cè)腹瀉臨床樣品，與熒光定量PCR方法比較檢測(cè)結(jié)果的符合率。結(jié)果確定最佳引物對(duì)F2/R1和探針PF2；該方法在40 ℃恒溫條件下，30 min即可完成反應(yīng)；熒光型RAA法最低檢出限可達(dá)1.34×101 copies·μL-1；與豬流行性腹瀉病毒、豬丁型冠狀病毒、豬呼吸道冠狀病毒等常見豬源病毒核酸無(wú)交叉反應(yīng)；采用該方法檢測(cè)107份臨床樣本，陽(yáng)性率為5.61%（6/107），與熒光定量PCR法相比較，檢測(cè)結(jié)果一致。本研究成功建立了一種靈敏、特異、可視化的RAA檢測(cè)方法，可擺脫對(duì)昂貴設(shè)備、專業(yè)人員和檢測(cè)技術(shù)的依賴，為臨床檢測(cè)TGEV提供良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 豬傳染性胃腸炎病毒；基礎(chǔ)型RAA；熒光型RAA；可視化檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）08-3590-10

收稿日期：2023-10-23

基金項(xiàng)目：國(guó)家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心先導(dǎo)科技項(xiàng)目（NCTIP-XD/B11）；國(guó)家動(dòng)物疫病長(zhǎng)期性觀測(cè)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目（ZX06S2302）

作者簡(jiǎn)介：呂林丹（2000-），女，重慶榮昌人，碩士生，主要從事動(dòng)物冠狀病毒致病機(jī)理、檢測(cè)技術(shù)等研究，E-mail：276121248@qq.com；Tel：15314776253

通信作者：宋振輝，主要從事動(dòng)物冠狀病毒病原學(xué)、流行病學(xué)、致病機(jī)理、防控措施等研究，E-mail：szh7678@swu.edu.cn；楊 柳，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)防控、畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣等研究，E-mail：492691662@qq.com

Establishment and Preliminary Application of RAA Assay for the Detection of Porcine

Transmissible Gastroenteritis Virus based on S Gene

L Lindan1， MU" Hao2，3， HU" Xia1， LIU" Mingni2， LI" Shaomei2， LI" Xing2， SONG" Zhenhui1*， YANG

Liu2，3*

（1.Southwest University， Chongqing 402460，" China;

2.National Center of Technology Innovation

for Pigs， Chongqing 402460，" China;

3.Chongqing Academy of Animal Sciences， Chongqing 402460，

China）

Abstract：" The aim of this study was to establish a convenient， efficient and specific recombinase-aid amplification （RAA） assay based on the porcine TGEV S gene. Comparing the genome sequence， selecting specific segment of TGEV S gene to construct the recombinant plasmid pUC57-S as templete. RAA primers and probes were designed and screened. RAA assays were established. The sensitivity， specificity and repeatability of the method were evaluated. Verifying the established test method by clinical samples of diarrhea， and compare the consistency with the testing results of the fluorescence quantitative PCR assay. Our results showed that the best primer pair F2/R1 and probe were screened out. The assay can be completed in 30 min at 40 ℃. The lowest detection limit of fluorescent RAA assay was 1.34×101 copies·μL-1. There was no cross reaction with other virus nucleic acid， as porcine epidemic diarrhea virus， porcine delta coronavirus， porcine respiratory coronavirus and other common swine viruses. A total of 107 clinical samples were tested using this method， and positive rate was 5.61% （6/107）， which was consistent with the test results of fluorescence quantitative PCR. This study successfully established a sensitive， specific and visual RAA test method， which can get rid of the dependence of expensive equipment， the professional and technical detection technology， and provided a reliable technical basis for the clinical detect of TGEV.

Key words： porcine transmissible gastroenteritis virus; basic RAA; fluorescent RAA; visual detection

*Corresponding authors：SONG Zhenhui， E-mail： szh7678@swu.edu.cn；YANG Liu， E-mail： 492691662@qq.com

豬傳染性胃腸炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）可感染不同階段和品種的豬，尤其2周齡以內(nèi)的仔豬感染癥狀最為顯著，主要以嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、最終因極度脫水而死亡為特征［1］，死亡率高達(dá)100% ［2-3］。隨著豬日齡增長(zhǎng)，發(fā)病率降低，通常在15%～20%，染病豬死亡率也呈逐漸遞減趨勢(shì)［4］，但其后期生長(zhǎng)發(fā)育遲緩并可長(zhǎng)期帶毒。母豬攜帶病毒也可通過(guò)母乳將病毒傳染給仔豬［5］，成為重要傳染源之一。本病分布廣泛，危害嚴(yán)峻，一年四季都有發(fā)生［6-7］，嚴(yán)重影響豬健康和養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。隨著TGEV疫苗免疫接種的普及和推廣，TGE發(fā)病率逐年下降且呈現(xiàn)穩(wěn)定，但成年豬群的持續(xù)帶毒、排毒使得豬場(chǎng)仍廣泛存在該病的傳播。感染TGEV或其他腹瀉病毒的患豬在臨床癥狀和病理變化上相似，且廣泛存在混合感染和隱性感染，臨床上很難作出準(zhǔn)確診斷，需要依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)［8］。

現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在操作繁瑣、周期長(zhǎng)、對(duì)儀器設(shè)備、技術(shù)人員要求高等缺點(diǎn)?；赗AA技術(shù)［9］的新型核酸檢測(cè)方法，溫度適應(yīng)性強(qiáng)，能夠在37～42 ℃恒溫條件下、15～30 min內(nèi)快速完成核酸擴(kuò)增［10-11］，具備耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便、不受檢測(cè)場(chǎng)地限制等優(yōu)點(diǎn)，借助SYBR green 染料或膠體金側(cè)流層析試紙等技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可視化判定［12］，是理想的臨場(chǎng)檢測(cè)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)之一，已應(yīng)用于多種豬傳染性病原的檢測(cè) ［13-14］。

S蛋白是TGEV重要結(jié)構(gòu)蛋白，TGEV毒株差異及其感染潛力高度依賴于S蛋白［15］，由于TGEV Ｓ基因序列中621～681 個(gè)堿基的缺失，導(dǎo)致其形成病毒毒力下降、親嗜性由小腸轉(zhuǎn)至呼吸道且與TGEV序列相似性高達(dá)96%的豬呼吸道冠狀病毒（porcine respiratory coronavirus，PRCV）［16］。TGEV和PRCV具有相似的分子特征及抗原結(jié)構(gòu)［17］，難以用血清學(xué)方法區(qū)分［18］。因此，建立在TGEV S基因以外的檢測(cè)方法，難以實(shí)現(xiàn)鑒別TGEV。本研究基于TGEV S 基因建立的TGEV RAA檢測(cè)方法，特別是熒光型RAA擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合膠體金側(cè)流層析試紙條［19］ 顯色，實(shí)現(xiàn)了肉眼觀察即可判斷檢測(cè)結(jié)果，為 TGEV臨床快速檢測(cè)提供一種新的思路和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒核酸

TGEV（Miller M6株）病毒核酸和PRCV病毒核酸由西南大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院贈(zèng)送；用于特異性檢測(cè)的TGEV（SCJY-1株）、豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）（SCSZ-1株）核酸為重慶澳龍生物制品有限公司贈(zèng)送。

1.1.2 臨床樣品 "豬丁型冠狀病毒（porcine delta cortonavirus，PDCoV）、豬嵴病毒（porcine kobu virus，PKoV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2，PCV2）等的陽(yáng)性病料及107份采集自腹瀉仔豬的臨床樣品（包括糞便拭子、腸組織及內(nèi)容物等）由國(guó)家生豬技術(shù)創(chuàng)新中心疫病防控院保存。

1.1.3 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑PrimeScript@ RT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa公司；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自江蘇奇天基因生物科技公司；RAA核酸擴(kuò)增試劑盒（熒光型）購(gòu)自南寧壯博生物科技公司；生物素和FITC標(biāo)記的通用型膠體金側(cè)流層析試紙條（Universal lateral flow dipstick for detection of biotin-and FITC-labeled analytes）購(gòu)自Milenia Biotec GmbH公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析與重組質(zhì)粒的制備

采用GenBank中發(fā)布的TGEV和PRCV全基因組序列，利用生物信息學(xué)軟件Clustal W進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果選擇TGEV S基因與PRCV差異區(qū)域特定片段作為檢測(cè)靶標(biāo)序列。將該序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行化學(xué)合成，克隆到載體pUC57中以構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC57-S。將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E. coli DH5α中培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒并測(cè)序驗(yàn)證，用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，并經(jīng)公式“拷貝數(shù)（copies·μL-1）=6.02×1023 ×濃度（ng·μL-1）×10-9/片段長(zhǎng)度×660”計(jì)算拷貝數(shù)。將重組質(zhì)粒10×倍比稀釋，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物、探針的設(shè)計(jì)與合成

利用Primer amp; probe design for RPA/RAA引物設(shè)計(jì)軟件（https：∥ezassay.com/primer）設(shè)計(jì)基礎(chǔ)型RAA引物5條（表1），其中上游引物3條，下游引物2條；設(shè)計(jì)熒光RAA探針2條及Biotin標(biāo)記的下游引物1條（表2）。引物、探針由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2.3 核酸提取和cDNA制備

核酸提取步驟如下：取250 μL待提取樣品，加入750 μL Trizol，振蕩混勻后，室溫放置5 min。加入氯仿250 μL，振蕩混后，室溫放置 5～15 min，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min。取上層水相 400～500 μL，加入等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃放置2 h以上或-80 ℃放置0.5 h，4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min。去上清，緩緩加入75%乙醇（用DEPC水配制）1.0 mL 洗滌12 000 r·min-1離心5 min。去上清，室溫干燥20 min，加入DEPC水20 μL使充分溶解。提取的核酸置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。cDNA制備步驟如下：逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液A（50 μmol·L-1隨機(jī)引物1 μL，10 mmol·L-1 dNTP混合物1 μL）；逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液B（逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL，用于逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的水補(bǔ)足至10 μL）。將8 μL RNA加入到逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液A中后，首先在65 ℃保溫5 min，隨后冰上迅速冷卻。將上一步產(chǎn)物10 μL全部轉(zhuǎn)移至逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液B中后緩慢混勻，30 ℃反應(yīng)10 min，42 ℃，反應(yīng)30 min；后95 ℃保溫5 min使酶失活。cDNA 置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物、探針的篩選及探針用量?jī)?yōu)化

引物篩選：將合成的引物兩兩隨機(jī)組合為F1/R1、F1/R2、F2/R1、F2/R2、F3/R1、F3/R2 6對(duì)引物對(duì)，以重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行基礎(chǔ)型RAA 擴(kuò)增。反應(yīng)溫度在37 ℃，擴(kuò)增50 min，產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳進(jìn)行顯示，綜合比較并確定最佳引物對(duì)。探針篩選：以重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光型RAA 擴(kuò)增，分別添加被FAM和FITC標(biāo)記的探針，反應(yīng)溫度39 ℃，擴(kuò)增21 min（1 min；30 s，40個(gè)循環(huán)，每 30 s收集1次熒光），結(jié)果由擴(kuò)增曲線分析。探針確定后，為優(yōu)化膠體金側(cè)流層析試紙條可視化的檢測(cè)效果，開展探針用量條件探索。采用最佳引物對(duì)，探針用量分別為1.0 μL、1.5 μL和2.0 μL，反應(yīng)溫度39 ℃，擴(kuò)增30 min（1 min；30 s，58個(gè)循環(huán)，每30 s收集1次熒光），產(chǎn)物采用膠體金側(cè)流層析試紙條顯示。

1.2.5 建立RAA核酸檢測(cè)體系

基礎(chǔ)型RAA反應(yīng)體系為50 μL體系，包括2×Buffer V 25 μL、無(wú)菌無(wú)酶水 14 μL、正向引物（10 μmol·L-1）2 μL、反向引物（10 μmol·L-1）2 μL、乙酸鎂Ⅰ（280 mmol·L-1）5 μL、模板2 μL。熒光型RAA擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL體系，包括：A Buffer 25 μL、探針（10 μmol·L-1）1.0 μL、無(wú)菌無(wú)酶水 12.5 μL、正向引物（10 μmol·L-1）2 μL、反向引物（10 μmol·L-1）2 μL、模板5 μL、B Buffer 2.5 μL。待RAA反應(yīng)結(jié)束后，基礎(chǔ)型RAA擴(kuò)增產(chǎn)物用氯仿和苯酚1∶1混合溶液進(jìn)行純化，純化后產(chǎn)物通過(guò)2%的凝膠電泳進(jìn)行分析；熒光型RAA擴(kuò)增產(chǎn)物取10～20 μL加到膠體金側(cè)流層析試紙條100 μL緩沖液中，混勻后將試紙條插入其中，反應(yīng)5～10 min后判讀結(jié)果。

1.2.6 反應(yīng)溫度和時(shí)間優(yōu)化

根據(jù)“1.2.5”體系，以37、38、39、40、41、42 ℃等溫度反應(yīng)50 min作溫度優(yōu)化；在此基礎(chǔ)上作時(shí)間優(yōu)化，分別反應(yīng)30、35、40、45、50 min，以確定最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.2.7 靈敏度試驗(yàn)

基礎(chǔ)型RAA分別以108～100 copies·μL-1 9個(gè)濃度梯度的重組質(zhì)粒為模板；熒光型RAA分別以107～100 copies·μL-1 8個(gè)濃度梯度的重組質(zhì)粒為模板，以RNase free H2O為模板的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照，采用本研究建立的檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增，確定該方法的最低檢出限。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

以最低檢出濃度的重組質(zhì)粒為模板，以RNase free H2O為模板的反應(yīng)體系作為陰性對(duì)照，用本研究建立的方法進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的重復(fù)性。

1.2.9 特異性試驗(yàn)

以TGEV（SCJY-1株）、PEDV（SCSZ-1株）、PDCoV、PKoV、PCV2、PRRSV、PRCV等病毒核酸為模板，以RNase free H2O為模板的反應(yīng)體系為陰性對(duì)照，用本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性。

1.2.10 臨床樣本檢測(cè)

收集107份臨床樣本（包括糞便、肛拭子、咽拭子、腦脊液、鼻拭子等），進(jìn)行核酸提取并反轉(zhuǎn)錄得到 cDNA，采用本研究建立的熒光型RAA檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，與熒光定量PCR方法的檢測(cè)結(jié)果作比較。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息分析和陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

TGEV與PRCV基因組序列比對(duì)結(jié)果顯示，S基因序列差異明顯，PRCV S基因序列存在大量堿基缺失，與覃健萍［16］等報(bào)道相符。選擇TGEV Miller M6（登錄號(hào)：DQ811785）S基因中362 bp DNA序列為檢測(cè)靶標(biāo)序列構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序結(jié)果正確后，將其作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。抽提的質(zhì)粒濃度經(jīng)測(cè)定為（289.0±0.2）ng·μL-1，并計(jì)算得拷貝數(shù)為1.34×1012 copies·μL-1。

2.2 最佳引物對(duì)、探針及探針添加量

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行基礎(chǔ)型RAA引物對(duì)篩選，結(jié)果顯示引物對(duì)F2/R1的擴(kuò)增條帶大小與預(yù)期一致、條帶明亮特異（圖1A），是最佳引物對(duì)。熒光型RAA探針篩選結(jié)果顯示，均有明顯的擴(kuò)增曲線（圖1B），為滿足試紙條顯色條件，選擇FITC標(biāo)記的PF2作為最適探針。在探針引物不同添加量下，檢測(cè)試紙條均出現(xiàn)了預(yù)期的、可見的檢測(cè)條帶（圖1C），當(dāng)探針引物添加量為1 μL時(shí)，已可見清楚明顯的檢測(cè)線，考慮到FITC標(biāo)記的成本，最終選擇添加量為1 μL。

2.3 最佳溫度、時(shí)間條件

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，添加最佳引物對(duì)和探針，在37、38、39、40、41、42 ℃下，分別進(jìn)行基礎(chǔ)型和熒光型RAA擴(kuò)增。凝膠電泳結(jié)果顯示，在40 ℃時(shí)條帶（泳帶4）最清晰明亮（圖2A），試紙條顯色結(jié)果表明在40（試紙條4）、41 ℃（試紙條5）時(shí)Test Band條帶最明顯（圖2B）。綜合分析對(duì)比后，確定RAA擴(kuò)增最適溫度為40 ℃。

以最適溫度40 ℃，分別進(jìn)行基礎(chǔ)型和熒光型RAA擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間為30、35、40、45、50 min。凝膠電泳圖顯示擴(kuò)增時(shí)間為30 min（泳帶1）和40 min（泳帶3）的條帶均清晰明亮（圖3A），試紙條顯色結(jié)果表明擴(kuò)增時(shí)間為30（試紙1）和50 min（試紙5）時(shí)Test Band條帶均明顯可見（圖3B）。為減少擴(kuò)增時(shí)間，確定RAA擴(kuò)增時(shí)間為30 min。

2.4 靈敏度試驗(yàn)

在40 ℃恒溫條件下，分別以不同濃度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板的基礎(chǔ)型和熒光型RAA擴(kuò)增30 min。凝膠電泳圖顯示（圖4A）在模板濃度稀釋至1.34×105 copies·μL-1（泳帶4）和試紙條顯色結(jié)果表明（圖4B）在模板濃度稀釋至1.34×101copies·μL-1（試紙7），均有清晰可見的單一條帶。綜合分析對(duì)比后，確定熒光型RAA比基礎(chǔ)型RAA檢測(cè)靈敏度高，最低檢出限可達(dá)1.34×101 copies·μL-1。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

針對(duì)基礎(chǔ)型RAA檢測(cè)法的最低檢出限（濃度為1.34×105 copies·μL-1）和熒光型RAA檢測(cè)法的最低檢出限（濃度為1.34×101 copies·μL-1）的重復(fù)試驗(yàn)。凝膠電泳圖顯示（圖5A）和試紙條Test Band顯色結(jié)果表明（圖5B），3次重復(fù)結(jié)果均呈現(xiàn)清晰明顯的單一條帶，證明該方法具有良好重復(fù)性。

2.6 特異性試驗(yàn)

用建立的基礎(chǔ)型和熒光型RAA檢測(cè)法對(duì)多種豬源病毒核酸進(jìn)行檢測(cè)。凝膠電泳圖（圖6A）顯示和試紙條Test Band顯色結(jié)果（圖6B）表明，均只有以 TGEV 核酸為模板的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生了單一、明亮條帶，判定為陽(yáng)性；而以其他病毒核酸為模板和陰性對(duì)照雖有少量彌散帶產(chǎn)生，但未出現(xiàn)單一、明顯條帶，判定為陰性，證明該方法具有良好的特異性。

2.7 臨床樣品檢測(cè)

用建立的熒光型RAA檢測(cè)方法對(duì)107份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢測(cè)出6份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為5.61%（6/107），與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果相符。以6份陽(yáng)性樣品的核酸為模板，分別進(jìn)行熒光型RAA法與熒光定量PCR法檢測(cè)，結(jié)果顯示檢測(cè)信號(hào)均十分明顯（圖7），可作出準(zhǔn)確判斷。

3 討 論

由TGEV感染引起的豬傳染性胃腸炎，臨床癥狀與其他腹瀉病毒感染很難區(qū)分，特別是存在多病原混合感染的情況下，會(huì)嚴(yán)重干擾臨床診斷 ［20-21］。

因此，快速準(zhǔn)確地診斷TGEV感染，對(duì)TGE的疫情防治至關(guān)重要。

目前，TGEV常規(guī)檢測(cè)方法主要有病毒的分離鑒定、ELISA、電鏡觀察法、病毒中和試驗(yàn)、核酸探針雜交技術(shù)等，但這些方法操作繁瑣、周期較長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)TGE疫情突發(fā)時(shí)對(duì)其的快速檢測(cè)。近年來(lái)，一系列的核酸診斷技術(shù)也應(yīng)用于TGEV檢測(cè)，如PCR技術(shù)、qPCR技術(shù)、巢式RT-PCR技術(shù)等。這些方法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短，但需使用精密復(fù)雜的熱循環(huán)設(shè)備，且都無(wú)法避免繁瑣操作和需求專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員。無(wú)需依賴精密溫控設(shè)備，可在恒溫條件下對(duì)DNA進(jìn)行高效擴(kuò)增的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)逐漸興起，如RAA、重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、核酸序列依賴性擴(kuò)增 （nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）、依賴解旋酶等溫?cái)U(kuò)增（helicase-dependent amplification，HDA）及鏈置換等溫?cái)U(kuò)增（strand displacement amplification helicase，SDA）等。雖然以上技術(shù)都可在恒溫條件下進(jìn)行，但除RAA/RPA外核酸擴(kuò)增時(shí)間均超過(guò)1 h，特別是LAMP技術(shù)需設(shè)計(jì)多對(duì)引物，可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定［22］。

基于RAA的便捷性及可靠性，建立在RAA擴(kuò)增上的檢測(cè)方法在病原檢測(cè)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注，如Wang等［23］利用熒光型RAA技術(shù)建立的雞新城疫病毒檢測(cè)方法；吳穎臻等［24］基于RAA技術(shù)建立的滑液囊支原體快速檢測(cè)方法等。本研究通過(guò)分析基因組序列比對(duì)結(jié)果，選擇TGEV S基因序列中特有、PRCV缺失的核酸片段，設(shè)計(jì)保守的引物和探針，結(jié)合RAA技術(shù)的操作簡(jiǎn)便、對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器要求低且僅需一對(duì)引物等優(yōu)勢(shì)［25］，創(chuàng)建了針對(duì)TGEV的RAA檢測(cè)方法。該檢測(cè)方法用時(shí)較短，在30 min內(nèi)即可完成擴(kuò)增，可極大地提高檢測(cè)效率；靈敏度高，特別是熒光型RAA最低檢出限達(dá)1.34×101 copies·μL-1，高于原冬偉等［26］參考TGEV JS2012株N基因保守序列建立的qRT-PCR方法（檢測(cè)下限為6.06×102 copies·μL-1）和焦韻潔等［27］針對(duì)TGEV M基因設(shè)計(jì)的RT-LAMP方法（檢測(cè)下限為3.7×103 copies· μL-1）等檢測(cè)方法，與呂蕎等［28］針對(duì)TGEV N基因設(shè)計(jì)的RT-RAA方法（檢測(cè)下限為6.62×101 copies· μL-1）檢測(cè)結(jié)果相近；特異性好，基于TGEV S基因建立的RAA檢測(cè)方法，較以N或M基因等建立的檢測(cè)方法有更好的準(zhǔn)確性，避免了PRCV混合感染時(shí)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響；并且熒光型RAA采用膠體金側(cè)流層析試紙條呈現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了可視化檢測(cè)，具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。運(yùn)用本研究建立的熒光型RAA檢測(cè)方法檢測(cè)107份臨床樣本，陽(yáng)性率為5.61%（6/107），與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致。本研究為TGEV檢測(cè)提供了一種新的方法，可準(zhǔn)確地對(duì)TGEV感染作出診斷。

4 結(jié) 論

本研究建立的基于TGEV S基因RAA檢側(cè)方法耗時(shí)短、無(wú)需精密儀器，對(duì)PRCV混和感染的樣品也可準(zhǔn)確檢測(cè)，結(jié)合試紙條顯色實(shí)現(xiàn)可視化判斷，具有良好的應(yīng)用前景，可為TGE的診斷和流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ COOPER V L. Diagnosis of neonatal pig diarrhea［J］. Vet Clin North Am Food Anim Pract， 2000， 16（1）：117-133.

［2］ GUO R L， FAN B C， CHANG X J， et al. Characterization and evaluation of the pathogenicity of a natural recombinant transmissible gastroenteritis virus in China［J］. Virology， 2020， 545：24-32.

［3］ 李嘉琛， 吳華偉， 陳曉春， 等. 豬傳染性胃腸炎病毒的分離與鑒定［J］. 中國(guó)獸藥雜志， 2018， 52（3）：25-30.

LI J C， WU H W， CHEN X C， et al. Isolation and identification of porcine transmissible gastroenteritis virus［J］. Chinese Journal of Veterinary Drug， 2018， 52（3）：25-30. （in Chinese）

［4］ 鄭德勝， 徐國(guó)彬， 杜香明， 等. 一起豬傳染性胃腸炎的診療及防控［J］. 江西畜牧獸醫(yī)雜志， 2019（6）：49-50.

ZHENG D S， XU G B， DU X M， et al. Diagnosis and control of transmissible gastroenteritis virus of swine［J］. Jiangxi Journal of Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2019（6）：49-50. （in Chinese）

［5］ 姚金水. 豬傳染性胃腸炎的流行病學(xué)、臨床癥狀、鑒別診斷及防控措施［J］. 現(xiàn)代畜牧科技， 2020（12）：134-135.

YAO J S. Epidemiology， clinical symptoms， differential diagnosis and prevention and control measures of transmissible gastroenteritis virus of swine［J］. Modern Animal Husbandry Science amp; Technology， 2020（12）：134-135. （in Chinese）

［6］ 程 宵， 劉 源， 龔志軍. 規(guī)?；i場(chǎng)傳染性胃腸炎防治［J］. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版）， 2019（17）：124-125.

CHENG X， LIU Y， GONG Z J. Prevention and treatment of transmissible gastroenteritis virus in large-scale pig farms［J］. Animal Science （Electronic Version）， 2019（17）：124-125. （in Chinese）

［7］ 薛瑞雪， 田 野， 田夫林， 等. 山東省部分地區(qū)仔豬病毒性腹瀉流行病學(xué)調(diào)查［J］. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2015， 37（4）：254-257.

XUE R X， TIAN Y， TIAN F L， et al. Epidemiological investigation of piglet diarrhea virus disease in Shandong province［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2015， 37（4）：254-257. （in Chinese）

［8］ VEMULAPALLI R， GULANI J， SANTRICH C. A real-time TaqMan RT-PCR assay with an internal amplification control for rapid detection of transmissible gastroenteritis virus in swine fecal samples［J］. J Virol Methods， 2009， 162（1-2）：231-235.

［9］ 呂 蓓， 程海榮， 嚴(yán)慶豐， 等. 用重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)快速擴(kuò)增核酸［J］. 中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué)， 2010， 40（10）：983-988.

L B， CHENG H R， YAN Q F， et al. Recombinase-aid amplification：a novel technology of in vitro rapid nucleic acid amplification［J］. Scientia Sinica Vitae， 2010， 40（10）：983-988. （in Chinese）

［10］ FAN X X， LI L， ZHAO Y G， et al. Clinical validation of two recombinase-based isothermal amplification assays （RPA/RAA） for the rapid detection of African swine fever virus［J］. Front Microbiol， 2020， 11：16961708.

［11］ 馬巧妮， 王 萌， 朱興全， 等. 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)及其在病原微生物快速檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展［J］. 中國(guó)生物工程雜志， 2021， 41（6）：45-49.

MA Q N， WANG M， ZHU X Q， et al. Research advances in recombinase-aided amplification technology and its application in rapid detection of pathogenic microorganisms［J］. China Biotechnology， 2021， 41（6）：45-49. （in Chinese）

［12］ LI J， MACDONALD J， VON STETTEN F. Review：a comprehensive summary of a decade development of the recombinase polymerase amplification［J］. Analyst， 2019， 144（1）：31-67.

［13］ 趙凱穎， 曾德新， 胡永新， 等. 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光RAA檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2021， 51（1）：1-8.

ZHAO K Y， ZENG D X， HU Y X， et al. Establishment of a real-time recombinase aidedamplification （RAA） for the detection of African swine fever virus［J］. Veterinary Science in China， 2021， 51（1）：1-8. （in Chinese）

［14］ 吳 江， 林彥星， 黃超華， 等. 豬圓環(huán)病毒3型RAA檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)， 2021， 51（11）：1348-1354.

WU J， LIN Y X， HUANG C H， et al. Establishment and preliminary applications of the RAA method for detection of porcine circovirus type 3［J］. Chinese Veterinary Science， 2021， 51（11）：1348-1354. （in Chinese）

［15］ KRIMMLING T， BEINEKE A， SCHWEGMANN-WESSELS C. Infection of porcine precision cut intestinal slices by transmissible gastroenteritis coronavirus demonstrates the importance of the spike protein for enterotropism of different virus strains［J］. Vet Microbiol， 2017， 205：1-5.

［16］ 覃健萍， 曹永長(zhǎng)， 畢英佐. 豬呼吸道冠狀病毒（PRCV）研究概況［J］. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2004， 29（2）：15-16.

QIN J P， CAO Y C， BI Y Z. Review on porcine respiratory corona virus［J］. Guangdong Journal of Animal and Veterinary Science， 2004， 29（2）：15-16. （in Chinese）

［17］ MAGTOTO R， POONSUK K， BAUM D， et al. Evaluation of the serologic cross-reactivity between transmissible gastroenteritis coronavirus and porcine respiratory coronavirus using commercial blocking enzyme-linked immunosorbent assay kits［J］. mSphere， 2019， 4（2）：e00017-19.

［18］ WOODS R D， WESLEY R D， KAPKE P A， et al. Neutralization of TGEV by complement dependent monoclonal antibodies［J］. Am J Vet Res， 1998（49）：300-304.

［19］ 孫亞寧， 王 麗， 王 棟， 等. 豬瘟抗體檢測(cè)試紙研發(fā)及制備工藝的優(yōu)化［J］. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 28（2）：169-175.

SUN Y N， WANG L， WANG D， et al. Optimization of key reagents used for research and development of immunochromatographic strip for detecting CSFV-specific antibodies［J］. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica， 2019， 28（2）：169-175. （in Chinese）

［20］ 李麗敏， 朱衛(wèi)霞， 王曉波， 等. 豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬A型輪狀病毒多重RT-PCR方法的建立及其應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2016， 36（2）：216-220， 227.

LI L M， ZHU W X， WANG X B， et al. Establishment and application of a multiplex reverse transcription-PCR for detecting porcine epidemic diarrhea virus， porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine group A rotavirus［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2016， 36（2）：216-220， 227. （in Chinese）

［21］ 韋學(xué)雷， 梁青青， 曹貝貝， 等. 豬Delta冠狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒多重 RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2018， 38（1）：11-16.

WEI X L， LIANG Q Q， CAO B B， et al. Establishment and application of a multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of porcine delta coronavirus， porcine transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2018， 38（1）：11-16. （in Chinese）

［22］ 李 婷， 劉燕紅， 趙 松， 等. 重組酶介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增熒光法快速檢測(cè)日本血吸蟲感染性釘螺［J］. 中國(guó)血吸蟲病防治雜志， 2019， 31（2）：109-114.

LI T， LIU Y H， ZHAO S， et al. Rapid detection of Schistosoma japonicum-infected snails with recombinase-aided isothermal amplification assay［J］. Chinese Journal of Schistosomiasis Control， 2019， 31（2）：109-114. （in Chinese）

［23］ WANG W J， WANG C G， BAI Y， et al. Establishment of reverse transcription recombinase-aided amplification-lateral-flow dipstick and real-time fluorescence-based reverse transcription recombinase-aided amplification methods for detection of the Newcastle disease virus in chickens［J］. Poult Sci， 2020， 99（7）：3393-3401.

［24］ 吳穎臻， 楊福劍， 杜文珍， 等. 滑液囊支原體RAA快速檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用［J］. 畜牧與獸醫(yī)， 2023， 55（11）：88-93.

WU Y Z， YANG F J， DU W Z， et al. Establishment and application of a RAA method for rapid detection of Mycoplasma synoviae［J］. Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2023， 55（11）：88-93. （in Chinese）

［25］ 張 娟， 綦 艷， 嚴(yán)家俊， 等. 重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)在生物安全檢測(cè)中的應(yīng)用研究［J］. 中國(guó)釀造， 2022， 41（11）：14-19.

ZHANG J， QI Y， YAN J J， et al. Application of recombinase-aid amplification technology in biosafety detection［J］. China Brewing， 2022， 41（11）：14-19. （in Chinese）

［26］ 原冬偉， 顏?zhàn)雍?申貴男， 等. 豬傳染性胃腸炎病毒qRT-PCR檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2020， 40（10）：1913-1917.

YUAN D W， YAN Z H， SHEN G N， et al. Establishment of qRT-PCR for detection of transmissible gastroenteritis virus［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2020， 40（10）：1913-1917. （in Chinese）

［27］ 焦韻潔， 張 欣， 朱海鵬， 等. 豬傳染性胃腸炎病毒可視化RT-LAMP檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2020， 40（7）：1272-1279， 1285.

JIAO Y J， ZHANG X， ZHU H P， et al. Establishment of a visual RT-LAMP detection assay for TGEV［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2020， 40（7）：1272-1279， 1285. （in Chinese）

［28］ 呂 蕎， 趙鐘毅， 尹德瑋， 等. 豬傳染性胃腸炎病毒熒光RT-RAA方法的建立及初步應(yīng)用［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（5）：2208-2214.

L Q， ZHAO Z Y， YIN D W， et al. Establishment and preliminary application of a real-time RT-RAA for detection of transmissible gastroenteritis virus［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2023， 54（5）：2208-2214. （in Chinese）

（編輯 白永平）