摘要：【目的】紅松（Pinus koraiensis）是分布在中國(guó)東北地區(qū)的珍貴樹(shù)種，由于近百年的人類干擾，其自然種群分布數(shù)量及范圍逐漸減少。探究紅松的遺傳多樣性和構(gòu)建天然紅松的核心種質(zhì)，可為有效保存、管理和利用紅松種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。【方法】以東北地區(qū)黑龍江省鶴北、五營(yíng)、小北湖和雞西，以及吉林省露水河5個(gè)保存現(xiàn)狀良好的紅松種群為研究對(duì)象，采用表型數(shù)據(jù)和分子標(biāo)記相結(jié)合的方法，進(jìn)行其核心種質(zhì)構(gòu)建?！窘Y(jié)果】分子和表型方差分析結(jié)果均表明：紅松天然種群的遺傳變異主要來(lái)源于個(gè)體間，分別占總變異的96%和72.84%。雞西種群與其他種群有著較遠(yuǎn)的遺傳距離，平均遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.026 8，同時(shí)具有較高的遺傳多樣性，Shannon指數(shù)和表型多樣性指數(shù)分別為1.111和2.00。結(jié)構(gòu)分析表明5個(gè)紅松天然種群沒(méi)有明顯亞群結(jié)構(gòu)。不同林齡紅松種群的遺傳多樣性沒(méi)有明顯變化，且較小林齡的種群不存在雜合缺失和近親繁殖的現(xiàn)象，針葉性狀與地理因素存在廣泛的相關(guān)性，造成不同紅松種群的表型分化?！窘Y(jié)論】以分子和表型標(biāo)記共同構(gòu)建30%取樣比例的紅松核心種質(zhì)，Shannon指數(shù)與表型多樣性指數(shù)分別為1.076、2.018，能夠較好地代表紅松天然種群的遺傳現(xiàn)狀，也能更好地促進(jìn)紅松種質(zhì)資源管理、保護(hù)和利用；根據(jù)紅松遺傳結(jié)構(gòu)特征，建議重點(diǎn)從原地保護(hù)方面開(kāi)展對(duì)紅松天然種質(zhì)的保護(hù)，以促進(jìn)紅松天然種群的生態(tài)恢復(fù)、種質(zhì)保護(hù)及利用。

關(guān)鍵詞：紅松；天然種群；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)；核心種質(zhì)；林木育種；鄉(xiāng)土樹(shù)種

中圖分類號(hào)：S791.247；S722"""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

文章編號(hào)：1000-2006（2024）05-0069-12

Analysis of genetic diversity and construction of core collections of Korean pine （Pinus koraiensis） natural population

YAN Pingyu， ZHANG Lei， WANG Jiaxing， FENG Kele， WANG Haohao，ZHANG Hanguo

（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding， Northeast Forestry University， Harbin" 150040， China）

Abstract：【Objective】 Korean pine （Pinus koraiensis） is a valuable tree species that is distributed throughout northeastern China. Over the past century， human interference has led to a gradual decrease in the number of individuals and distribution" of its natural population. Assessing the genetic diversity and building a core collection of natural Korean pine could provide a scientific basis for the effective conservation， management， and utilization of Korean pine germplasm resources. 【Method】 A total of five well-preserved natural populations of Korean pine in Hebei， Wuying， Xiaobeihu" and Jixi in Heilongjiang Province and Lushuihe in Jilin Province in northeast China were studied. A combination of phenotypic data and molecular markers was used to construct the core collection. 【Result】 Molecular and phenotypic ANOVA results showed that the genetic variation of Korean pine natural populations mainly originated from inter-individual differences， which accounted for 96% and 72.84% of the total variation， respectively. The Jixi population was genetically distant from other populations， with an average Fst of 0.026 8. It also had a high genetic diversity， with Shannon and phenotypic" diversity index values of 1.111 and 2.00， respectively. The population structure analysis showed that the five Korean pine natural populations had no obvious subpopulation structure. There were no significant changes in the genetic diversity of Korean pine populations among the different forest ages. Additionally， in the younger forest there was no evidence of heterozygous deletions or inbreeding. There was a broad correlation between needle traits and geographic factors， resulting in the phenotypic differentiation of Korean pine populations. 【Conclusion】 The Shannon and phenotypic" diversity indexes of the core collection constructed by combining molecular and phenotypic markers with a 30% sampling ratio were 1.076 and 2.018， respectively， which was representative of the genetic status of Korean pine populations. This information can be used to better manage the germplasm resources of Korean pine and promote its protection and use. The genetic structure characteristics indicated a need to focus on in situ protection of the natural germplasm and" to promote ecological recovery， germplasm protection， and use of Korean pine.

Keywords：Korean pine（Pinus koreciensis）; natural populations; genetic diversity; genetic structure; core collection; forest breeding; native trees

紅松（Pinus koraiensis）天然分布范圍主要在我國(guó)東北地區(qū)長(zhǎng)白山及其北部的張廣才嶺、老爺嶺、完達(dá)山和小興安嶺[1]，在俄羅斯、朝鮮和日本也有分布[2]，既是優(yōu)良的用材樹(shù)種，也是珍貴的食用干果和油料樹(shù)種[3]。由于紅松生長(zhǎng)緩慢且童期較長(zhǎng)，在自然條件下更新緩慢，一旦被破壞就很難恢復(fù)[4]。紅松天然林資源較少，已被列為國(guó)家重點(diǎn)二級(jí)保護(hù)野生植物[2]。因此，評(píng)估紅松的遺傳多樣性以促進(jìn)對(duì)現(xiàn)有天然紅松種質(zhì)資源的有效管理和保護(hù)十分必要。

對(duì)物種多樣性進(jìn)行全方位評(píng)價(jià)和遺傳背景調(diào)查是保護(hù)野外種群的重要環(huán)節(jié)[5]。群體遺傳多樣性研究是保護(hù)遺傳學(xué)的基礎(chǔ)，種質(zhì)資源保護(hù)是其核心[6]。對(duì)物種遺傳多樣性的研究可對(duì)物種現(xiàn)有的生存方式及狀態(tài)進(jìn)行有效評(píng)估[7]。目前除了傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記，分子標(biāo)記技術(shù)在多樣性分析方面已被廣泛應(yīng)用。如張巍等[8]用10個(gè)ISSR標(biāo)記對(duì)10個(gè)不同紅松天然林種源進(jìn)行多樣性分析結(jié)果表明，小興安嶺林區(qū)紅松種群的遺傳多樣性水平較高，各種源遺傳分化大且與地理分布相關(guān)；童茜坪等[9]利用11條具有多態(tài)性的ISSR引物進(jìn)行紅松種子園單株遺傳多樣性分析，證明了紅松種子園單株具有豐富的遺傳多樣性。

核心種質(zhì)資源（core collection）指保存種質(zhì)資源的一個(gè)核心子集，是采用一定方法從保存的種質(zhì)資源中進(jìn)行抽取，以最少的遺傳資源樣本量來(lái)最大限度地代表整個(gè)資源群體的遺傳多樣性和分布范圍，而未列入核心種質(zhì)的其他資源材料則作為保留樣本予以保存[10-11]。因此核心種質(zhì)可以作為種質(zhì)資源研究和利用的切入點(diǎn)，從而提高整個(gè)種質(zhì)庫(kù)的管理和利用水平。一些學(xué)者也對(duì)植物核心種質(zhì)構(gòu)建的方法進(jìn)行了分析和探討，如多樣性指數(shù)法的系統(tǒng)抽樣法、分組法和最小距離逐步抽樣法[12-14]。

由于分子標(biāo)記克服了表型性狀易受環(huán)境影響的缺點(diǎn)，從而提高了所構(gòu)建核心種質(zhì)的有效性，目前分子標(biāo)記已成為構(gòu)建植物核心種質(zhì)的有效研究手段，被廣泛應(yīng)用于樹(shù)木的核心種質(zhì)資源庫(kù)構(gòu)建中。如Boccacci等[15]使用10個(gè)簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）標(biāo)記，建立了代表歐榛（Corylus avellana）遺傳多樣性的核心種質(zhì)庫(kù)；Yang等[16]采用20個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)來(lái)自中國(guó)8個(gè)地點(diǎn)304株馬尾松（P. massoniana）的遺傳多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，構(gòu)建了104個(gè)個(gè)體的核心庫(kù)。然而在構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫(kù)的過(guò)程中，植物的表型也不應(yīng)被忽視，因?yàn)楸硇妥儺愂鞘苓z傳因素和環(huán)境因素共同影響，是同種植物適應(yīng)不同環(huán)境條件的結(jié)果，在適應(yīng)和進(jìn)化上具有重要意義。因此，也有不少研究將分子標(biāo)記和表型性狀結(jié)合來(lái)進(jìn)行核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建，如Duan等[17]測(cè)量了中國(guó)南方6個(gè)省份的杉木（Cunninghamia lanceolata）10個(gè)生長(zhǎng)和材性性狀，并使用SSR標(biāo)記評(píng)估該種質(zhì)資源的遺傳變異，建立了一個(gè)能夠代表整個(gè)種質(zhì)的核心庫(kù)。Guo等[18]收集了1 054份刺槐（Robinia pseudoacacia）種質(zhì)，利用48個(gè)SSR標(biāo)記、13個(gè)表型性狀和3個(gè)生理性狀對(duì)種質(zhì)多樣性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，構(gòu)建了一個(gè)刺槐核心種質(zhì)庫(kù)?；诜肿訕?biāo)記與表型性狀共同構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)在松樹(shù)中也有研究，如Wang等[19]利用780個(gè)樣本的表型特征和SRAP標(biāo)記的綜合數(shù)據(jù)，構(gòu)建了云南松（P. yunnanensis）的核心庫(kù)。然而以上研究主要基于已收集或栽培馴化的種質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)及核心庫(kù)的構(gòu)建，通過(guò)構(gòu)建核心種質(zhì)的方法促進(jìn)天然群體種質(zhì)保護(hù)和利用的應(yīng)用較少，依據(jù)遺傳多樣性水平的高低結(jié)合表型遺傳變異大小來(lái)構(gòu)建紅松核心種質(zhì)（庫(kù)）以促進(jìn)天然種質(zhì)資源保護(hù)的研究也鮮見(jiàn)報(bào)道。

近幾十年間，由于過(guò)度砍伐導(dǎo)致大量紅松遺傳資源丟失，天然種群結(jié)構(gòu)及規(guī)模被嚴(yán)重破壞。因此，調(diào)查現(xiàn)有天然紅松種群并進(jìn)行遺傳分析，探究核心種質(zhì)構(gòu)建技術(shù)，以最少的種質(zhì)材料代表原始種質(zhì)資源的全部或大多數(shù)，將為當(dāng)前有效收集、評(píng)價(jià)和利用紅松種質(zhì)資源帶來(lái)便利，同時(shí)也為紅松天然種群恢復(fù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

參考夏德安等[20]關(guān)于紅松種源的區(qū)劃，選擇了黑龍江省鶴北、五營(yíng)、小北湖和雞西以及吉林省露水河5個(gè)保存現(xiàn)狀良好的紅松種群。每個(gè)種群設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)，采樣點(diǎn)相距8 km以上，記錄采樣點(diǎn)坐標(biāo)及海拔（表1）。每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)選擇22或25株中壯齡天然紅松，單株間距離50 m以上，于2022年7月初采集1～2年生針葉，并測(cè)量所選擇紅松單株胸徑。

1.2 試驗(yàn)方法

使用植物基因組提取試劑盒（天根DP-320，中國(guó)北京）對(duì)紅松樣本總DNA進(jìn)行提取，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA的完整性，并用MicroDrop 3000（Bio-DL，中國(guó)上海）檢測(cè)DNA濃度與質(zhì)量。將每個(gè)DNA樣本的質(zhì)量濃度稀釋至10 ng/μL，-20 ℃保存用于SSR擴(kuò)增。

從已發(fā)表的松科SSR引物中選擇火炬松（P. taeda）[21-22]、美國(guó)白松（P. albicaulis）[23]、大別山五針?biāo)桑≒. dabeshanensis）[24]、華山松（P. armandii）[25]、紅松（P. koraiensis）[3，26-27]、馬尾松（P. massoniana）[28]和毛枝五針?biāo)桑≒. wangii）[29]7個(gè)物種總計(jì)142對(duì)SSR引物，由生工生物工程（中國(guó)上海）股份有限公司合成，隨機(jī)選取10個(gè)紅松DNA樣本篩選多態(tài)性引物。PCR體系體積為20 μL，包含2U TaqDNA聚合酶、400 μmol/L dNTP、2.0 μL 10倍緩沖液、正反向引物各0.5 μmol/L和10 ng DNA。PCR程序如下：94 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，退火溫度Tm下30 s，72 ℃延伸15 s；72 ℃下最終延伸7 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)7%非變性PAGE進(jìn)行檢測(cè)，并通過(guò)銀染觀察最終篩選出11對(duì)具有明顯多態(tài)性且可穩(wěn)定重復(fù)的SSR標(biāo)記，在避光條件下用上述相同反應(yīng)體系進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司在ABI3730遺傳分析儀上進(jìn)行檢測(cè)，用Data Collection 3.0程序（ABI 3730遺傳分析儀自帶）收集原始二倍體基因型數(shù)據(jù)。

每株選擇3束2年生紅松針葉，用直尺及游標(biāo)卡尺分別測(cè)量針葉長(zhǎng)、針葉寬，計(jì)算葉長(zhǎng)寬比；用萬(wàn)分之一天平測(cè)量鮮質(zhì)量，65 ℃烘干至質(zhì)量恒定后，測(cè)量針葉干質(zhì)量并計(jì)算含水量；以丙酮-乙醇法[30]測(cè)定葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 遺傳分析

將DNA多態(tài)性信息處理為數(shù)據(jù)矩陣，利用軟件Data Formater將數(shù)據(jù)矩陣轉(zhuǎn)換成各種格式，以供進(jìn)一步分析[31]。利用軟件PowerMarker 3.25計(jì)算引物多態(tài)性信息含量（PIC）[32]，運(yùn)用GenAIEX6.51b2計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、基因流（Nm）、無(wú)偏期望雜合度（Hue）、固定指數(shù)（F）和遺傳分化指數(shù)（Fst）[33]，進(jìn)行分子方差分析以剖分遺傳變異來(lái)源，以及進(jìn)行主坐標(biāo)（PCoA）分析，生成種群間Nei遺傳距離及基因流矩陣，利用MEGA11生成紅松種質(zhì)聚類圖[34]。

利用Structure 2.3.4對(duì)遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，群體數(shù)（K）設(shè)置1～10，每個(gè)K值模擬運(yùn)算10次，將不作數(shù)迭代和不作數(shù)迭代后的MCMC均設(shè)為10萬(wàn)次；運(yùn)算結(jié)果導(dǎo)入Structure Harvester網(wǎng)站（https：//taylor0.biology.ucla.edu/structureHarvester/），根據(jù)Evanno 等[35]的方法選擇最佳K值。

根據(jù)紅松種群地點(diǎn)坐標(biāo)，通過(guò)以下公式計(jì)算種群間地理距離：

d=R×arcos[cos（Y1）×cos（Y2）×cos（X1-X2）+sin（Y1）×sin（Y2）]。（1）

式中：d為地點(diǎn)間距離，km;R為地球半徑6 371.0 km；X1、X2、Y1、Y2分別為兩個(gè)地點(diǎn)坐標(biāo)弧度，弧度為坐標(biāo)×π/180；用SPSS 27.0檢測(cè)5個(gè)天然種群間地理距離和遺傳距離之間的相關(guān)性。

對(duì)于天然紅松單株來(lái)說(shuō)，常用生長(zhǎng)錐鉆取木芯或伐木得到個(gè)體年齡，但對(duì)樹(shù)體破壞性較大，鑒于此，本研究采用胸徑大小代替年齡結(jié)構(gòu)分析其動(dòng)態(tài)特征，計(jì)算公式[36]如下：

t=e（+321.980 15）69.879 16。（2）

式中：t為估算林齡等級(jí)；為平均胸徑。

1.3.2 針葉性狀分析

用SPSS 27.0對(duì)紅松天然種群針葉表型性狀的平均值（）、標(biāo)準(zhǔn)差（δ）、方差和變異系數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并進(jìn)行表型多樣性指數(shù)、表型相關(guān)性分析，以及主成分和聚類分析。胸徑及針葉性狀被劃分為10個(gè)級(jí)別，數(shù)值lt;（-2σ）為第1級(jí)別，數(shù)值≥（+2σ）為第10級(jí)別，其中每0.5σ劃分為1個(gè)級(jí)別。

針葉表型多樣性指數(shù)采用Shannon-Weaver多樣性指數(shù)（H′）[37-38]，計(jì)算公式如下：

H′=-∑Pi（lnPi）。（3）

式中：H′為某一性狀的多樣性程度；Pi為某一性狀第i個(gè)級(jí)別的種質(zhì)份數(shù)占總種質(zhì)材料的百分比。

采用Lindgren等效緯度[39]的概念，其計(jì)算公式如下：

Le=L+（H-300）/a。（4）

式中：Le為等效緯度；L表示緯度；H表示海拔。當(dāng)H≥300 m時(shí)，a=140；當(dāng)H＜300 m時(shí)，a=200。

1.3.3 天然紅松核心庫(kù)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

計(jì)算個(gè)體間表型性狀歐氏距離和分子標(biāo)記遺傳距離，并參考徐海明[40]的方法對(duì)表型和分子遺傳距離進(jìn)行整合，基于以上3種距離按照UMPGA方法進(jìn)行聚類，分別按照10%、20%、30%、40%和50%的比例，利用逐步聚類取樣法進(jìn)行取樣；分別對(duì)各集合的遺傳參數(shù)和表型多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，并按照Hu等[41]的方法，計(jì)算均值差異百分率（MD）、方差差異百分率（VD）、極差符合率（CR）、變異系數(shù)（CV）和變異系數(shù)變化率（VR）來(lái)評(píng)價(jià)核心種質(zhì)的代表性。

基于核心種質(zhì)研究結(jié)果，分別利用針葉表型和分子標(biāo)記為第1、第2主成分因子得分繪制保留種質(zhì)和核心種質(zhì)的主坐標(biāo)分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然紅松種群遺傳分析

2.1.1 遺傳多樣性分析

為確定5個(gè)天然種群的變異特征，分子變異分析結(jié)果表明（表2）其遺傳變異主要存在于個(gè)體間，占總變異的96%，種群間遺傳變異的發(fā)生率僅為4%，這表明種群間的遺傳分化小，而種群內(nèi)個(gè)體間的遺傳變異大。

為了評(píng)估5個(gè)紅松種群的遺傳多樣性和遺傳分化程度，對(duì)其進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，紅松種群整體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性，Shannon多樣性指數(shù)為1.055（表3）。5個(gè)種群遺傳多樣性水平差異不大，其中雞西種群遺傳多樣性最高，等位基因和有效等位基因最多，分別為73.000和2.962，Shannon多樣性指數(shù)、觀測(cè)雜合度、期望雜合度和無(wú)偏期望雜合度也最高，分別為1.111、0.514、0.524和0.527；鶴北種群Shannon多樣性指數(shù)最低，為0.888，有效等位基因也最少，為2.200；觀測(cè)雜合度最低的為五營(yíng)種群。整體的固定指數(shù)（F）為0.010，說(shuō)明紅松天然種群整體上雜合度適中，各種群固定指數(shù)從-0.087（小北湖）至0.042（五營(yíng)）不等，顯示出五營(yíng)種群存在輕微的雜合缺失和近親繁殖。

對(duì)5個(gè)種群的個(gè)體進(jìn)行主坐標(biāo)分析結(jié)果（圖1a）顯示，軸1解釋了9.29%的變異，軸2解釋了7.58%的變異，說(shuō)明以上分子標(biāo)記各自具有較高的獨(dú)立性。圖中種群間具有高度的分布重疊，不存在明顯的遺傳分化。雞西種群分布范圍較大，部分個(gè)體顯示出相對(duì)獨(dú)立性，鶴北和小北湖種群部分個(gè)體分布相對(duì)聚集，且鶴北種群大多分布在坐標(biāo)軸左側(cè)，表明鶴北種群內(nèi)遺傳多樣性相對(duì)較低，這與Shannon多樣性指數(shù)估算結(jié)果相似。5個(gè)天然紅松種群間的遺傳分化指數(shù)Fst值從0.011 0～0.032 4不等（平均為0.024），種群間基因流Nm值在7.468 5～22.464 0之間變動(dòng)（平均為11.453），說(shuō)明種群間遺傳分化小且存在高頻率的基因流（圖1b）。紅松種群的Nei遺傳距離和地理距離間Person相關(guān)系數(shù)為0.135（P=0.704），說(shuō)明紅松種群遺傳距離與其地理距離之間沒(méi)有顯著的相關(guān)性。

2.1.2 遺傳結(jié)構(gòu)分析

為進(jìn)一步探索種群間遺傳關(guān)系，通過(guò)種群間的Nei遺傳距離進(jìn)行種群進(jìn)化分析，結(jié)果（圖2a）顯示，五營(yíng)種群和鶴北種群為同一進(jìn)化分支，露水河種群與小北湖種群為同一進(jìn)化分支且遺傳距離最短，雞西種群位于兩個(gè)遺傳簇的中間位置，這與以上分析結(jié)果一致，且說(shuō)明了雞西種群與其他種群相對(duì)特殊的遺傳關(guān)系。對(duì)所有參試材料進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析（圖2b、2c），K=1～10中，最佳K值為3，說(shuō)明遺傳變異來(lái)源于3個(gè)基因池，而且都是混合的，沒(méi)有明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，說(shuō)明紅松天然種群不存在明顯的結(jié)構(gòu)分化。

2.1.3 不同齡級(jí)遺傳分析

以胸徑調(diào)查結(jié)果代替不同年齡等級(jí)來(lái)分析紅松種群時(shí)間分布上的動(dòng)態(tài)，結(jié)果（圖3）顯示：5個(gè)紅松種群共分為林齡由大到小的9個(gè)種群，估算平均林齡最大種群為334 a，最小為125 a。整體上看，各個(gè)林齡種群的Shannon指數(shù)和雜合度沒(méi)有明顯變化。值得注意的是，年齡較小的3個(gè)種群與其他種群相比，固定指數(shù)均小于0，說(shuō)明相對(duì)于林齡較大的種群，較小林齡的紅松種群在自然更替的過(guò)程中不存在雜合缺失以及近親繁殖的現(xiàn)象，尤其是林齡最小的種群9，雖然僅有13個(gè)單株，但仍保持了較高的多樣性以及雜合度。

2.2 紅松種群針葉性狀分析

2.2.1 紅松種群針葉性狀表型變異和多樣性分析

對(duì)不同紅松天然種群間針葉性狀分析（表4）表明，9個(gè)針葉指標(biāo)在不同種群間均存在極顯著差異（Plt;0.01），各性狀來(lái)源于種群間和種群內(nèi)的方差分量百分比平均值分別為27.16%和72.84%，說(shuō)明針葉性狀變異主要來(lái)源于種群內(nèi)，其中針葉寬性狀尤為明顯，其種群內(nèi)方差分量占比達(dá)95.73%，僅針葉含水量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的方差分量種群間（61.08%）大于種群內(nèi)（38.92%），因?yàn)楹恐笜?biāo)可能更多受種群所處地點(diǎn)空氣及土壤干濕程度所影響。另外，鶴北種群的針葉表型性狀數(shù)值較大，小北湖和露水河種群數(shù)值最小，這可能與所處緯度及海拔等地理因素有關(guān)。

針葉性狀變異及多樣性分析結(jié)果（表5）表明，各性狀平均變異系數(shù)最小的是鶴北種群（16.51%），最大的是小北湖種群（21.32%），是唯一高于整體變異水平（20.59%）的種群。各種群表型平均多樣性指數(shù)與變異系數(shù)結(jié)果不同，雞西種群的平均多樣性指數(shù)最高（2.00），露水河種群的平均多樣性指數(shù)最低（1.97），均小于總體的平均多樣性指數(shù)（2.04）。各種群表型遺傳變異大小及表型多樣性指數(shù)除受遺傳控制外，還受立地條件及人為干擾程度影響，較大的遺傳變異反映出該種群較寬的遺傳背景外，也反映出適宜的立地條件以及較少的人為干擾。

2.2.2 紅松種群針葉性狀主坐標(biāo)分析

基于紅松種群針葉性狀的主成分分析，提取前兩個(gè)主成分因子得分，能夠分別解釋總方差的33.618%和25.080%。繪制5個(gè)種群的主坐標(biāo)分布圖（圖4），結(jié)果顯示，各種群內(nèi)個(gè)體分布在坐標(biāo)的中心具有高度重合，種群間具有各自相應(yīng)分布范圍，小北湖種群和露水河種群主要分布在縱坐標(biāo)左側(cè)，相對(duì)露水河種群，小北湖種群分布范圍更大，五營(yíng)種群主要分布在中間范圍，鶴北種群和雞西種群高度重合，主要分布在中心范圍及縱坐標(biāo)右側(cè)，雞西種群有著最大的分布范圍，這與基于分子標(biāo)記的紅松種群主坐標(biāo)分析結(jié)果一致。

2.2.3 紅松種群針葉性狀相關(guān)分析

紅松種群針葉性狀與所處地理氣候因子的相關(guān)性分析（圖5）表明：紅松針葉性狀與地理因素存在明顯的相關(guān)性，其中經(jīng)度與針葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量、葉綠素含量存在極顯著的正相關(guān)，與針葉長(zhǎng)寬比存在顯著正相關(guān)，而與含水量顯著負(fù)相關(guān)；緯度與針葉鮮質(zhì)量、葉綠素、含水量的相關(guān)性極顯著；海拔與針葉性狀主要為負(fù)相關(guān)，與針葉長(zhǎng)、針葉干質(zhì)量顯著負(fù)相關(guān)，與針葉鮮質(zhì)量、葉綠素含量以及含水量極顯著負(fù)相關(guān)。紅松針葉性狀間也存在明顯相關(guān)關(guān)系：針葉長(zhǎng)與針葉鮮質(zhì)量、針葉干質(zhì)量以及葉綠素含量存在極顯著的正相關(guān)；針葉寬與針葉鮮質(zhì)量、干質(zhì)量極顯著正相關(guān)，與葉綠素含量顯著負(fù)相關(guān)；針葉長(zhǎng)寬比與針葉干質(zhì)量及葉綠素含量極顯著正相關(guān)。

2.3 紅松核心種質(zhì)資源構(gòu)建

2.3.1 不同抽樣比例和抽樣策略的核心庫(kù)比較

按照逐步聚類取樣法分別以10%、20%、30%、40%、50%的取樣比例重復(fù)10次抽樣，在3種取樣數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建。比較不同取樣比例構(gòu)建的核心種質(zhì)遺傳差異發(fā)現(xiàn)，等位基因數(shù)、表型多樣性指數(shù)和極差符合率隨著取樣比例的增大而增大，有效等位基因數(shù)、期望雜合度、Shannon多樣性指數(shù)和變異系數(shù)變化率均在取樣比例為30%時(shí)達(dá)到最大值，觀測(cè)雜合度在30%、40%、50%的取樣比例時(shí)差別不大，分別為0.485、0.484、0.486，均值差異百分率和方差差異百分率則無(wú)明顯規(guī)律，且分別在50%和20%的取樣比例下表現(xiàn)出最大值?；诤诵姆N質(zhì)庫(kù)應(yīng)以最少樣本量最大限度地代表整個(gè)種群的原則，在紅松核心種質(zhì)的構(gòu)建中，30%的取樣比例最為適宜。在構(gòu)建紅松核心種質(zhì)庫(kù)時(shí)，依據(jù)不同類型的取樣數(shù)據(jù)得到的結(jié)果存在較大差異（表6）。

依據(jù)分子標(biāo)記及針葉表型共同構(gòu)建的5個(gè)集合整體表現(xiàn)最佳，5個(gè)集合的平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和期望雜合度均最大，分別為7.291、2.750、1.071和0.507，同時(shí)具有最大的表型多樣性指數(shù)（2.00）、變異系數(shù)變化率（101.95%）、極差符合率（83.32%）和最小的均值差異百分率（6.00%）。平均等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、期望雜合度和極差符合率最低的是依據(jù)分子標(biāo)記構(gòu)建的5個(gè)集合，分別為6.509、2.668、1.011、0.491和77.43%，但其均值差異百分率和方差差異百分率也最大（18.00%和10.00%）；基于針葉表型構(gòu)建的5個(gè)集合多樣性指數(shù)最低（1.980），因此在構(gòu)建紅松核心種質(zhì)時(shí)，應(yīng)當(dāng)結(jié)合分子標(biāo)記和表型性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行分析?；诜肿訕?biāo)記及表型性狀且以30%取樣比例構(gòu)建的集合3不僅能夠較好地還原原始種質(zhì)的均值和極差，提高變異系數(shù)，還具有較高的Shannon多樣性指數(shù)和表型多樣性指數(shù)及最大的觀測(cè)雜合度，最終確定集合3為天然紅松種群的核心種質(zhì)。

2.3.2 核心種質(zhì)的確認(rèn)

為了進(jìn)一步了解核心種質(zhì)資源代表性，基于針葉表型和分子標(biāo)記分別為第1、第2主成分因子得分繪制原始種質(zhì)和核心種質(zhì)主坐標(biāo)分布圖，結(jié)果（圖6）表明：核心種質(zhì)與原始種質(zhì)的分布范圍相當(dāng)且在原始種質(zhì)中均勻分布，表明核心種質(zhì)庫(kù)去除了冗余，在針葉表型和遺傳多樣性方面均有良好的代表性。

對(duì)核心種質(zhì)在各種群中的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在本研究初步構(gòu)建的核心種質(zhì)中，雞西種群的種質(zhì)份數(shù)占比最多，為39.25%，五營(yíng)種群的種質(zhì)占比最小，僅為5.61%，鶴北、雞西、小北湖種群核心種質(zhì)占比均高于原始種質(zhì)，表明3個(gè)種群在紅松天然種群中具有更重要的代表性。從材料來(lái)源地點(diǎn)種源區(qū)（表1）看，來(lái)自長(zhǎng)白山種源區(qū)的核心種質(zhì)占比最少，為12.15%，占比最高的為老爺嶺-張廣才嶺種源區(qū)（59.81%），也是唯一高于原始種質(zhì)的種源區(qū)，小興安嶺種源區(qū)的核心種質(zhì)占比為28.04%，遠(yuǎn)低于其原始種質(zhì)的42.02%。

3 討 論

基于SSR標(biāo)記的結(jié)果顯示，本研究中紅松的遺傳變異主要來(lái)源于天然種群內(nèi)個(gè)體間，占96%，種群間變異僅占4%，表明紅松不同種群之間遺傳分化很?。‵st=0.024），這與馮富娟等[42]研究認(rèn)為種源的多樣性主要來(lái)源于種源內(nèi)部的結(jié)果一致，這一現(xiàn)象應(yīng)與紅松為異花風(fēng)媒授粉植物以及具有較長(zhǎng)生命周期有關(guān)。

雞西種群遺傳多樣性水平最高（Ne=2.962，I=1.111，Ho=0.514），鶴北種群遺傳多樣性水平最低（Ne=2.200，I=0.888，Ho=0.474），其中五營(yíng)種群的有效等位基因數(shù)（2.865）和Shannon指數(shù)（1.037）大于張巍等[8]的研究結(jié)果（1.079 5和0.879 7），這可能是由于樣本量大小不同。除五營(yíng)種群外，其他種群都不存在近親繁殖現(xiàn)象，整個(gè)紅松天然種群具有合理的交配體系。紅松為演替的頂極群落中的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種，分布地域廣，壽命長(zhǎng)達(dá)300～400 a，這都是紅松具有較高遺傳多樣性的生物學(xué)基礎(chǔ)。遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究是制定物種保護(hù)措施的前提條件，也是科學(xué)合理地利用種質(zhì)資源和改進(jìn)遺傳特性的理論基礎(chǔ)[43]。聚類分析與主坐標(biāo)分析結(jié)果得到了相似的結(jié)論，也證明了個(gè)體間的遺傳變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種群間，說(shuō)明紅松種群間沒(méi)有阻止基因流動(dòng)的嚴(yán)重障礙，形成了較廣泛的基因交流。對(duì)思茅松（P. kesiya var. langbianensis）相關(guān)研究也有類似發(fā)現(xiàn)[44]?，F(xiàn)階段種群演替在空間上的差異可以反映種群在時(shí)間上的變化，不同時(shí)期紅松的遺傳多樣性略有波動(dòng)，但整體上看波動(dòng)不大，基本呈現(xiàn)穩(wěn)定的趨勢(shì)，這與邵丹等[45]的研究結(jié)果相似。值得注意的是，與較早的種群相比，較近時(shí)間內(nèi)的紅松種群不存在雜合缺失、過(guò)量純和的現(xiàn)象，說(shuō)明各時(shí)期的天然種群變化屬于自然演替過(guò)程，遺傳多樣性基本穩(wěn)定，更新種群不存在近親繁殖現(xiàn)象。

通過(guò)對(duì)紅松天然分布的5個(gè)種群針葉表型性狀的研究發(fā)現(xiàn)，紅松針葉表型性狀種群內(nèi)變異占據(jù)了更主要的位置（占比72.84%），這與白皮松（P. bungeana）相關(guān)研究結(jié)果類似[46]，變異主要來(lái)自針葉寬、針葉鮮質(zhì)量和針葉長(zhǎng)寬比，但各性狀在種群間仍存在極顯著的差異。大量研究表明，物種的表型變異程度往往與其分布范圍的大小呈正相關(guān)[47-49]，這在本研究中也得到了證實(shí)，紅松分布范圍較小且分布零散，難以形成單一純林或群落，所以其表型變異較小，平均變異系數(shù)為20.59%，變異幅度為4.48%～36.94%。在實(shí)地調(diào)查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，與其他種群相比，鶴北種群分布相對(duì)較為集中，故其針葉表型性狀的變異系數(shù)較低，針葉表型多樣性指數(shù)也得到了類似的結(jié)果。正因?yàn)榧t松分布區(qū)較小，分布區(qū)內(nèi)的氣候條件差異不大，所以種群間變異也較小。一般來(lái)說(shuō)，異花授粉植物的交配系統(tǒng)可以促進(jìn)種群間基因交流、增加有效種群大小、減少基因漂變對(duì)遺傳結(jié)構(gòu)的影響。紅松是雌雄同株的風(fēng)媒異花授粉植物，這在大大提升繁衍后代概率的同時(shí)也促進(jìn)了個(gè)體間的基因交流。紅松在適應(yīng)不同環(huán)境的過(guò)程中產(chǎn)生了表型的變異，本研究中各性狀在不同種群間也具有極顯著的差異，如小興安嶺種源區(qū)的五營(yíng)與鶴北種群具有較大的針葉長(zhǎng)、含水量和葉綠素含量，而最南部長(zhǎng)白山種源區(qū)的露水河種群針葉長(zhǎng)和針葉鮮質(zhì)量均最??；對(duì)針葉性狀進(jìn)行主坐標(biāo)分析可得到相同的結(jié)果。針葉表型與地理因素的相關(guān)分析也驗(yàn)證了這一結(jié)果，針葉長(zhǎng)、針葉鮮質(zhì)量、針葉干質(zhì)量、葉綠素含量和葉含水量等的性狀與其地點(diǎn)的緯度、海拔和等效緯度之間廣泛存在顯著甚至極顯著的相關(guān)性。

保護(hù)一個(gè)物種全部種質(zhì)資源的遺傳多樣性既困難又昂貴，因此應(yīng)該構(gòu)建具有最小重復(fù)性和最大遺傳多樣性的核心子集，以代表一個(gè)物種的整個(gè)基因庫(kù)[50]。目前核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建主要依據(jù)表型性狀或分子標(biāo)記手段，如陳存等[38，51]分別利用表型性狀和SSR分析標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行美洲黑楊核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建，結(jié)果認(rèn)為應(yīng)結(jié)合表型分析進(jìn)一步利用分子標(biāo)記的方法構(gòu)建核心種質(zhì)庫(kù)，從而更有效地保存種質(zhì)資源。徐益等[52]也認(rèn)為同時(shí)結(jié)合種質(zhì)的表型和遺傳信息特征的聚類分析結(jié)果對(duì)其進(jìn)行分組，構(gòu)建的核心種質(zhì)更具有代表性。Belaj等[53]認(rèn)為木本植物的取樣比例應(yīng)為10.00%～45.00%。本研究分別利用表型性狀、分子標(biāo)記數(shù)據(jù)以及兩者結(jié)合，利用逐步聚類取樣方法分別按照10%、20%、30%、40%、50%的取樣比例進(jìn)行紅松核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建，共得到15個(gè)不同的集合。目前，主要通過(guò)與原始種質(zhì)表型性狀均值差異百分率（MD）、方差差異數(shù)（VD）、極差符合率（CR）、變異系數(shù)符合率（VR）以及等位基因數(shù)（Na）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、觀測(cè)雜合度（Ho）之間的差異比較，評(píng)價(jià)核心種質(zhì)庫(kù)的代表性，MD越小，VD、CR和VD越大，核心種質(zhì)庫(kù)的代表性和表型多樣性越好[54]?；谝陨显瓌t，結(jié)合表型和分子的方法在30%取樣比例時(shí)最能有效代表原始種質(zhì)，其有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)和觀測(cè)雜合度分別為2.769、1.076和0.497，表型多樣性指數(shù)、均值差異數(shù)、方差差異數(shù)、極差符合率和變異系數(shù)符合率分別為2.018、0.00%、10.00%、105.27%和89.17%，最終確定為紅松核心種質(zhì)資源庫(kù)。通過(guò)比較核心種質(zhì)和原始種質(zhì)的主坐標(biāo)對(duì)核心種質(zhì)庫(kù)的代表性進(jìn)行確認(rèn)，在原始種質(zhì)中均勻分布的核心種質(zhì)最大限度地還原了原始種質(zhì)的多樣性。在各種群的種質(zhì)分布比例上，雞西種群、小北湖種群和鶴北種群比原始種質(zhì)占比更大，表明上述3個(gè)種群的變異程度較大，五營(yíng)種群變異程度較小。對(duì)比SSR多樣性與表型變異，在評(píng)價(jià)整體與各種群遺傳水平時(shí)可以得出一致的結(jié)果，但在種群間表型的變異遠(yuǎn)大于SSR，這說(shuō)明SSR標(biāo)記在反應(yīng)基因組水平上的變異存在一定的局限性，同時(shí)表型性狀由于受到環(huán)境的影響而表現(xiàn)出大于基因水平多樣性的變異，通過(guò)將二者結(jié)合的手段可以克服以上方法所存在的缺點(diǎn)。

由于人類的過(guò)度采伐和生產(chǎn)活動(dòng)造成天然紅松林分布區(qū)縮小及生態(tài)條件惡化，導(dǎo)致紅松遺傳資源急劇減少，因此有必要加強(qiáng)對(duì)天然紅松的保護(hù)和積極的人為擴(kuò)展，促進(jìn)紅松種質(zhì)遺傳多樣性恢復(fù)到其應(yīng)有水平，為保護(hù)種群穩(wěn)定存在創(chuàng)造有利的遺傳基礎(chǔ)。一般而言，原地保存和異地保存是植物種群保護(hù)的兩種主要方式[55]，針對(duì)現(xiàn)有種群進(jìn)行就地保護(hù)是最有效的保護(hù)措施[56]，異地保存通常針對(duì)群體間存在分化且遺傳多樣性低的群體[46]，原地保存通常針對(duì)群體間無(wú)明顯的遺傳分化且遺傳多樣性高的群體[55，57]。作為東北地區(qū)典型的珍貴樹(shù)種，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)紅松種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用，盡早選育以實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值為目的的優(yōu)良種質(zhì)，在實(shí)現(xiàn)生態(tài)價(jià)值的同時(shí)利用紅松種質(zhì)創(chuàng)造更多社會(huì)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。面對(duì)紅松未來(lái)育種需要，本研究所收集種質(zhì)及所構(gòu)建的核心種質(zhì)將利用更多技術(shù)手段，如高通量測(cè)序技術(shù)、表型組學(xué)技術(shù)等進(jìn)行評(píng)估，同時(shí)對(duì)紅松種質(zhì)的結(jié)實(shí)、材性等經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行繼續(xù)觀測(cè)，以滿足未來(lái)育種目標(biāo)的需要。紅松核心種質(zhì)庫(kù)的建立也能更好地促進(jìn)紅松種質(zhì)資源管理、保護(hù)和利用，為有效保存、管理和利用紅松種質(zhì)資源提供科學(xué)依據(jù)。

根據(jù)本研究結(jié)果，紅松的保護(hù)策略應(yīng)從原地保存方面重點(diǎn)開(kāi)展，對(duì)樹(shù)齡較大或性狀表現(xiàn)優(yōu)異的單株進(jìn)行掛牌保護(hù)，還可以在全分布區(qū)建立長(zhǎng)期觀測(cè)種源的試驗(yàn)基地[58]。另外也應(yīng)在異地保存方面開(kāi)展部分工作，如盡量采集不同種源地的種質(zhì)資源，建立紅松種質(zhì)資源圃進(jìn)行異地保存，最大程度保存遺傳多樣性的同時(shí)也可有效增加紅松對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力和適應(yīng)范圍，有利于對(duì)紅松適應(yīng)性、抗逆性及經(jīng)濟(jì)性等各方面進(jìn)行深入研究。

致謝：

本研究得到馮可樂(lè)、王佳興同學(xué)在采樣過(guò)程中的協(xié)助，王浩浩同學(xué)在數(shù)據(jù)處理過(guò)程中的協(xié)助，張含國(guó)老師和張磊老師在試驗(yàn)設(shè)計(jì)以及文章撰寫過(guò)程中的指導(dǎo)。

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（責(zé)任編輯 鄭琰燚）

基金項(xiàng)目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目 （2572022AW13）；林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)）創(chuàng)新項(xiàng)目（2022A02）。

第一作者：閆平玉（1321830425@qq.com），博士生。

*通信作者：張含國(guó)（hanguozhang1@sina.com），教授。