摘 要：建立超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定緩解疲勞保健食品中非法添加米羅那非、慶地那非含量的檢測方法。在電噴霧離子源正模式多反應監(jiān)測方式下，以米羅那非定量/定性子離子對99.1/296.1，慶地那非定量/定性子離子對285.2/327.1為目標監(jiān)測離子，空白基質(zhì)外標法定量。結果：空白基質(zhì)無干擾；米羅那非、慶地那非在10～1 000 ng·mL-1線性關系良好，相關系數(shù)分別為0.999 7和0.999 3；米羅那非的方法精密度為1.5%，平均回收率為90.4%～97.9%，相對標準偏差為0.9%～1.8%；慶地那非的方法精密度為1.2%，平均回收率為89.4%～96.6%，相對標準偏差為0.6%～2.4%；兩者方法檢出限、定量限分別為50 μg·kg-1和100 μg·kg-1。本文所建立的方法專屬性強、準確、靈敏，可作為緩解疲勞類保健食品中非法添加米羅那非、慶地那非的痕量分析方法。

關鍵詞：米羅那非；慶地那非；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS）；保健食品；非法添加

Determination of Mirodenafil and Gendenafil in the Heathy Food by UPLC-MS

WANG Fengqin1， ZHANG Huaiguang1， ZHANG Qiuyan2， LI Zihua1

（1.Fuyang Inspection and Testing Center， Fuyang 236111， China; 2.School of Biological and Food Engineering， Fuyang Normal University， Fuyang 236037， China）

Abstract： To establish a method for determination of mirodenafil and gendenafil illegally added in the relieve fatigue heathy food by UPLC-MS. Mirodenafil quantitive product ion 99.1 and qualitative product ion 296.1， gendenafil quantitive product ion 285.2 and qualitative product ion 327.1 were detected as target ions under the positive mode multiple reaction monitoring， and quantitative analysis used blank matrix external standard method. The results indicated that the blank matrix solution had no interference. Milonafil and gendenafil had a good linear relationship within the range of 10～1 000 ng·mL-1， with a correlation coefficient of 0.999 7 and 0.999 3， respectively. The precision of the method for mironafine is 1.5%， average recovery rates were from 90.4% to 97.9%， and the relative standard deviation were between 0.9% to 1.8% . The precision of the method for gendenafil is 1.2%， average recovery rates were between 89.4% to 96.6%， with relative standard deviation of 0.6% to 2.4%. The method detection limit and quantification limit are 50 μg·kg-1 and 100 μg·kg-1， respectively. The method is high specificity， accurate and sensitive， can be used as a trace analysis method for illegally adding mirodenafil and gendenafil in fatigue relieving health foods.

Keywords： mirodenafil; gendenafil; ultra high performance liquid chromatography-mass spectrometry （UPLC-MS）; heathy food; illegally added

保健食品是一類具有特定保健功能或者以補充維生素、礦物質(zhì)為目的，具有調(diào)節(jié)機體功能，并且對人體不產(chǎn)生任何急性、亞急性或慢性危害的食品[1]。隨著人們生活水平的提高，健康養(yǎng)生逐漸成為追求品質(zhì)生活的新風尚，保健食品的市場需求不斷增長。為保障人們的健康，我國針對保健食品頒布了一系列法規(guī)及標準。近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快，緩解疲勞類保健食品成為眾多腎虛、易疲勞人群青睞的消費品；一些不法分子將具有壯陽功能的5型磷酸二酯酶抑制劑添加到緩解疲勞類保健食品中，從中非法牟利[2-7]。

5型磷酸二酯酶抑制劑在臨床上對用藥品種和劑量有嚴格的要求，多用于治療男性勃起功能障礙，若服用硝酸酯類的心臟病患者和服用α受體阻滯劑的人群誤服，易出現(xiàn)低血壓甚至昏厥等癥狀[8-9]。消費者在不知情的情況下，長期攝入含有非法添加

5型磷酸二酯酶抑制劑的保健食品，可能會出現(xiàn)心率加快、血壓升高、消化不良和視力損傷等毒副作用，甚至危及生命安全[10]。目前已發(fā)現(xiàn)90多種5型磷酸二酯酶抑制劑及衍生物，我國批準上市的有枸櫞酸西地那非、枸櫞酸愛地那非、他達拉非、鹽酸伐地那非和阿伐那非，這些已批準上市的5型磷酸二酯酶抑制劑有其相應的檢驗方法[11-14]。但在保健食品中添加現(xiàn)行檢測方法范圍外又具有壯陽功能的新型

5型磷酸二酯酶抑制劑及其衍生物成為非法牟利的手段[15-17]，這些抑制劑并無藥理和毒理活性數(shù)據(jù)的論證，勢必會威脅公眾健康，因此開展緩解疲勞類保健食品中新型那非類衍生物檢驗方法的研究迫在眉睫。

米羅那非作為第二代5型磷酸二酯酶抑制劑于2007年出現(xiàn)在韓國，慶地那非藥理作用尚不明確，兩者在我國均未批準上市，因此國內(nèi)對這兩種新型那非類衍生物的檢驗方法鮮有報道[18]。本文采用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，建立了以米羅那非、慶地那非為非法添加目標物質(zhì)的測定方法，以期為緩解疲勞類保健食品違法添加的日常監(jiān)管工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試劑

樣品來源：行刑銜接委托檢驗樣品，劑型為片劑和膠囊；米羅那非（批號：G23110476，99.3%，墨壇質(zhì)檢）；甲醇中慶地那非標準溶液（批號：S086421，100 μg· mL-1，99.6%，阿爾塔）；甲醇、乙腈（色譜純，迪馬科技公司）；甲酸（色譜純，阿拉丁，≥98%）；分析用水均為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器

1290-6460 QQQ三重四極桿質(zhì)譜儀，安捷倫公司；ME XPR36/A梅特勒-托利多電子天平（百萬分之一），瑞士METTLER TOLEDO公司；ATY224島津電子天平（萬分之一），日本島津；Elma EASY300H超聲波清洗器，德國Elma公司；IKA A11粉碎機，德國IKA公司。

1.3 標準溶液的配制

精密稱取米羅那非2.518 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，折算純度后配制成100 μg·mL-1單標儲備液；甲醇中慶地那非標準溶液濃度為100 μg·mL-1；用甲醇逐級稀釋制成米羅那非、慶地那非各自濃度為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的系列混標溶液。

1.4 供試品溶液的配制

片劑粉碎備用，膠囊劑內(nèi)容物研細混勻備用。精密稱取樣品1 g（精確至0.000 1 g），溶解后置于50 mL容量瓶中，加適量甲醇，旋渦振蕩2 min，超聲提取15 min，冷卻至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，上清液過0.22 μm有機微孔濾膜，定性分析可以直接上機，定量分析需要參照定性分析響應值結果稀釋至定量線性范圍內(nèi)測試。

1.5 儀器條件優(yōu)化

1.5.1 色譜條件分析

（1）流動相優(yōu)化。實驗以甲醇-0.1%甲酸體系和乙腈-0.1%甲酸體系為考察對象，按照表1所示的梯度洗脫條件，流速0.2 mL·min-1，測定米羅那非、慶地那非各自濃度為100 ng·mL-1的混標溶液，比較兩種物質(zhì)的信噪比與峰面積。

（2）流速的優(yōu)化。以乙腈-0.1%甲酸為流動相體系，考察不同流速（0.2 mL·min-1、0.3 mL·min-1）對物質(zhì)信噪比及峰面積的影響。

1.5.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以米羅那非（500 ng·mL-1）和慶地那非（500 ng·mL-1）的混標溶液作為測試液，采用正離子模式，添加揮發(fā)性的甲酸考察離子化效率。

1.6 儀器條件

1.6.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 RRHD（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進樣體積：5 μL；柱溫35 ℃；流動相A：0.1%甲酸水溶液，流動相B：乙腈，流量為0.2 mL· min-1，梯度洗脫，程序見表1。

1.6.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正模式；多反應監(jiān)測掃描（Multiple Reaction Monitoring，MRM）；電離電壓：3 500 V；干燥氣流量：7 L·min-1；干燥氣溫度：325 ℃；鞘氣流量：11 L·min-1；鞘氣溫度：350 ℃；霧化氣流量：40 psi。

2 結果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件分析

（1）流動相選擇。由圖1（a）、圖1（b）可知，采用甲醇-0.1%甲酸體系，米羅那非、慶地那非無法洗脫出來；而乙腈-0.1%甲酸體系可以很好地將兩種物質(zhì)洗脫出來，米羅那非信噪比為857.4倍、慶地那非信噪比為734.4倍；兩者定量子離子峰面積響應值分別為5 403和4 919，表明采用乙腈-0.1%甲酸體系優(yōu)于甲醇-0.1%甲酸體系。

（2）流速優(yōu)化。由圖1（b）、圖1（c）可知，當流速為0.2 mL·min-1時，米羅那非、慶地那非信噪比分別為857.4倍和734.4倍；均高于0.3 mL·min-1流速下兩種物質(zhì)分別對應的信噪比（166.0倍和441.5倍）。當流速為0.2 mL·min-1時，米羅那非定量子離子峰面積為5 403，是0.3 mL·min-1流速下峰面積

2 010的2.6倍；慶地那非在兩種流速下峰面積差異不大。因低流速可降低柱壓，起到延長色譜柱壽命的作用，故綜合以上優(yōu)化實驗，采用乙腈-0.1%甲酸流動相體系（0.2 mL·min-1）梯度洗脫作為液相色譜的洗脫條件。

2.1.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

先進行離子全掃描確定母離子，再進行選擇離子監(jiān)測確定最優(yōu)裂解電壓，最后進行子離子掃描優(yōu)化最佳碰撞能，最終確定多重反應監(jiān)測的采集條件如表2所示。米羅那非定量、定性子離子m/z分別為99.1和296.1，慶地那非定量、定性子離子m/z分別為285.2和327.1，這與補充檢驗方法BJS201805所述不同（BJS201805中米羅那非定量、定性離子m/z分別為296.1和99.1，慶地那非定量、定性離子m/z分別為327.1和285），在質(zhì)譜分析中，可根據(jù)實際情況，選擇響應信號強且無干擾的離子對進行檢測，質(zhì)譜參數(shù)亦可根據(jù)實際可達到最優(yōu)靈敏度的條件進行設定[19]。

2.2 方法建立

2.2.1 樣品中米羅那非、慶地那非及標準品二級質(zhì)譜圖譜

米羅那非監(jiān)測母離子m/z為532.3，定性子離子m/z為296.1，定量子離子m/z為99.1，兩者相對豐度值為54.9%；慶地那非監(jiān)測母離子m/z為355.2，定性子離子為327.1，定量子離子m/z為285.2，兩者相對豐度值為85.3%。在定性分析中，滿足目標物保留時間與標準品保留時間一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；同時定性與定量子離子相對豐度值一致，表示該目標物為陽性[14]。由圖2可知，樣品中米羅那非和慶地那非相對豐度值為未檢出（Not Found），表示樣品為陰性。

2.2.2 方法專屬性

取溶劑甲醇上機測試，得到總離子流圖，與對照品溶液比對，提取米羅那非和慶地那非母離子流圖，均顯示無干擾離子，證明該法專屬性強，如圖3。

2.2.3 線性關系

取米羅那非和慶地那非濃度各自為10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、200 ng·mL-1、500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的混標系列溶液，按1.6的條件進樣測定。以多反應監(jiān)測掃描模式掃描的定量子離子濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。由表3可知，米羅那非和慶地那非在10～1 000 ng·mL-1時，線性關系良好，相關系數(shù)分別為0.999 7和0.999 3。

2.2.4 檢出限和定量限結果

用空白基質(zhì)甲醇溶液配制成米羅那非

（1.0 ng·mL-1）、慶地那非（1.0 ng·mL-1）混標溶液考察方法檢出限，上機連續(xù)測試10針，所得圖譜提取米羅那非、慶地那非定量子離子色譜圖計算信噪比，圖4顯示10針中米羅那非、慶地那非信噪比最小值分別為4.7倍和5.9倍，均大于3.0倍。重復上述操作，測試米羅那非（2.0 ng·mL-1）、慶地那非（2.0 ng·mL-1）混標溶液考察定量限，得米羅那非、慶地那非信噪比最小值分別為11.4倍和13.4倍，均大于10.0倍，均滿足以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限的通用要求[20]。

為提高方法的可信性，不再對測試濃度進行稀釋使之測試的信噪比剛好為3.0倍與10.0倍，將檢出限濃度定為1.0 ng·mL-1，將定量限濃度定為2.0 ng·mL-1；根據(jù)定容體積（50 mL）、稱樣量（1 g）計算得米羅那非、慶地那非的檢出限均為50 μg·kg -1，定量限均為100 μg·kg -1，這與補充檢驗方法BJS201805中給出的兩物質(zhì)的檢出限和定量限相同，表明該法具有較高的靈敏度，滿足這兩種物質(zhì)的痕量分析要求[19]。

2.2.5 方法精密度實驗結果

取米羅那非（100 ng·mL-1）、慶地那非（100 ng·mL-1）的混標溶液，按照1.6的條件連續(xù)測定9針，所得譜圖分別提取米羅那、慶地那非定量子離子色譜圖，對峰面積進行積分，計算各自峰面積的相對標準偏差。結果顯示米羅那非峰面積相對標準偏差為1.5%，慶地那非峰面積相對標準偏差為1.2%，表明該法測定米羅那非、慶地那非含量的精密度高，重現(xiàn)性好，滿足要求[20]。

2.2.6 加標回收率實驗結果

選取經(jīng)測定米羅那非、慶地那非成分陰性的A片劑和B膠囊作為加標樣品，精密稱取1 g（精確至0.000 1 g），分別吸取混標溶液（米羅那非、慶地那非濃度各為1 μg·mL-1）1.0 mL、2.5 mL、5.0 mL，置50 mL容量瓶中，按照1.4項處理制成3個濃度水平（加標量1.0 μg·g-1、2.5 μg·g-1 、5.0 μg·g-1）的混合加標溶液；每個添加濃度平行操作3次，計算回收率和相對標準偏差。由表4可知，米羅那非的平均回收率在90.4%～97.9%，相對標準偏差在0.9%～1.8%；慶地那非平均回收率在89.4%～96.6%，相對標準偏差在0.6%～2.4%，綜上表明該法檢測結果可靠。

2.3 樣品測定

采用上述方法對30批次行刑銜接委托檢驗宣稱有緩解疲勞功能的保健食品進行分析，結果顯示米羅那非、慶地那非均為陰性，如圖5所示。

3 結論

米羅那非、慶地那非藥理毒理活性尚未得到有效論證，非法添加勢必對公眾健康造成威脅，建立該類新型壯陽類化學物質(zhì)的檢驗方法迫在眉睫。本文建立了UPLC-MS聯(lián)用技術測定片劑、膠囊兩種劑型緩解疲勞類保健食品中非法添加米羅那非、慶地那非的檢測方法；采用乙腈-0.1%甲酸流動相體系0.2 mL·min-1流速梯度洗脫的色譜條件，質(zhì)譜選擇MRM正模式增強離子選擇性，無基質(zhì)效應，方法專屬性強；檢出限、定量限分別為50 μg·kg-1和100 μg·kg-1，滿足痕量分析要求；米羅那非回收率為90.4%～97.9%，慶地那非回收率為89.4%～96.6%。結果滿意，可為保健食品安全日常監(jiān)管提供強有力的技術支持。

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