摘 要： 旨在探究miR-127對(duì)綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞增殖與分化的影響，并通過(guò)鑒定miR-127上游核心啟動(dòng)子區(qū)域篩選調(diào)控其表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。本研究以體外分離培養(yǎng)的小尾寒羊胎羊骨骼肌原代成肌細(xì)胞為試驗(yàn)材料，過(guò)表達(dá)或干擾miR-127后，采用RT-qPCR、EdU染色、流式細(xì)胞儀分析、免疫熒光染色等方法探究miR-127對(duì)綿羊成肌細(xì)胞增殖、凋亡和分化的影響?；谏镄畔W(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)預(yù)測(cè)并鑒定綿羊miR-127核心啟動(dòng)子區(qū)域及其轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)果表明，在綿羊成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127后，促進(jìn)了細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA、CDK4的表達(dá)（Plt;0.01）；抑制了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase3、BAX的表達(dá)（Plt;0.05）；EdU結(jié)果顯示，綿羊成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127后，細(xì)胞陽(yáng)性率顯著提升（Plt;0.05）；流式細(xì)胞儀分析顯示，miR-127過(guò)表達(dá)可顯著增加成肌細(xì)胞S期和G2期細(xì)胞比例并減少成肌細(xì)胞的凋亡。在細(xì)胞分化試驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)miR-127顯著增加了成肌細(xì)胞分化相關(guān)基因MYOD1和MYHC mRNA的表達(dá)水平（Plt;0.05），顯著增加了MYHC的陽(yáng)性肌管面積（Plt;0.05）。抑制miR-127表達(dá)則出現(xiàn)與上述相反的結(jié)果。這些結(jié)果表明，miR-127顯著促進(jìn)了綿羊成肌細(xì)胞增殖、分化，并抑制其凋亡。為進(jìn)一步揭示調(diào)控miR-127表達(dá)的調(diào)控因子，雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-127上游1 500～1 800 bp（miR-127-P6）區(qū)段活性最高，推斷其為miR-127的核心啟動(dòng)子區(qū)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，在miR-127核心啟動(dòng)子區(qū)存在一個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子PAX3的結(jié)合位點(diǎn)。在綿羊成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子PAX3后，miR-127啟動(dòng)子活性和miR-127的表達(dá)均極顯著增加（Plt;0.01）。本研究表明，綿羊miR-127顯著促進(jìn)綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞增殖分化，減少了成肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而參與骨骼肌成肌細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，綿羊miR-127上游的1 500～1 800 bp是其核心啟動(dòng)子區(qū)，轉(zhuǎn)錄因子PAX3正向調(diào)節(jié)miR-127的轉(zhuǎn)錄。本研究為進(jìn)一步探究綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育性狀的分子機(jī)制提供了理論參考。

關(guān)鍵詞： 綿羊；成肌細(xì)胞增殖分化；miR-127；轉(zhuǎn)錄因子PAX3

中圖分類號(hào)：S826.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-3864-12

miR-127 Regulated the Proliferation and Differentiation of Sheep Skeletal Myoblasts

and Its Transcription Factor PAX3 Screening

JIA" Yuhang" GUO" Liangfu3， ZHANG" Runan1， ZHAO" Ayong2， LIU" Yufang1*， CHU" Mingxing1*

（1.State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding， Institute of Animal Science，

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China;

2.College of Animal

Science and Technology· College of Veterinary Medicine， Zhejiang Agriculture and

Forestry University， Hangzhou 311300，" China; 3.Yuncheng County Animal Husbandry

Service Center， Yuncheng 274700，" China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the effects of miR-127 on the skeletal myoblast proliferation and differentiation in sheep， and to screen for transcription factors that regulate the expression of miR-127 by identifying its upstream core promoter region. In this study， primary skeletal muscle myoblasts of small-tailed Han fetal sheep were used as experimental materials. After overexpression or inhibition of miR-127， the RT-qPCR， EdU staining， flow cytometry analysis， and immunofluorescence staining were used to detect the effects of miR-127 on the proliferation， apoptosis and differentiation of sheep myoblasts. The bioinformatics analysis and dual luciferase reporting assay were used to predict and identify the sheep miR-127 core promoter region and its transcription factors. The results showed that overexpression of miR-127 in sheep myoblasts promoted the expression of cell proliferation related genes PCNA and CDK4 （Plt;0.01）， and inhibited the expressions of cell apoptosis related genes Caspase3 and BAX （Plt;0.05）. EdU results showed that the positive rate of sheep myoblasts was significantly increased after miR-127 overexpression （Plt;0.05）. Flow cytometry analysis showed that overexpression of miR-127 significantly increased the proportion of S and G2 phase myoblasts and decreased the apoptosis of myoblasts. In the cell differentiation assay， overexpression of miR-127 significantly increased the mRNA expression levels of myoblast differentiation related genes MYOD1 and MYHC （Plt;0.05）， and significantly increased the MYHC positive myotube area （Plt;0.05）. The opposite result was found after miR-127 inhibition. In order to further reveal the regulatory factors regulating the expression of miR-127， the dual luciferase activity assay showed that the 1 500-1 800 bp （miR-127-P6） region upstream of miR-127 had the highest activity， which was inferred to be the core promoter region of miR-127. Bioinformatics predictions revealed a site in the core promoter region of miR-127 that bound to the transcription factor PAX3. Overexpression of the transcription factor PAX3 in sheep myoblasts significantly increased the promoter activity and the expression of miR-127 （Plt;0.01）. This study showed that sheep miR-127 significantly promoted the proliferation and differentiation of skeletal muscle myoblasts and reduced their apoptosis， which participated in their development process. Further studies showed that 1 500-1 800 bp upstream was the core promoter region of sheep miR-127， and the transcription factor PAX3 positively regulated the transcription of miR-127. This study provided a theoretical reference for further exploring the molecular mechanism of sheep muscle growth and development.

Key words： sheep; myoblast proliferation and differentiation; miR-127; transcription factor PAX3

*Corresponding authors：LIU Yufang， E-mail： aigaiy@126.com; CHU Mingxing， E-mail：mxchu@263.net

骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化對(duì)于畜禽生產(chǎn)具有重要意義［1-2］。在畜禽生產(chǎn)中，肌肉生長(zhǎng)和發(fā)育直接影響著肉類的產(chǎn)量和質(zhì)量。了解成肌細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制可以幫助人們控制肌肉生長(zhǎng)速度，提高肉類產(chǎn)量，同時(shí)改善肌肉質(zhì)量，提高肉類的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和口感。肌肉細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育受眾多基因、轉(zhuǎn)錄因子及短鏈非編碼RNA的調(diào)控［3-5］。microRNA（miRNA）是一種細(xì)胞內(nèi)源性長(zhǎng)度約18～24 bp的非編碼且高度保守的RNA［6］，已被發(fā)現(xiàn)參與動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)環(huán)節(jié)。大量研究表明，miRNA作為反式作用因子，通過(guò)靶向靶基因的3′UTR區(qū)域在不同物種的骨骼肌細(xì)胞增殖分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在小鼠這類模式動(dòng)物中，miRNA調(diào)控肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的研究開(kāi)展較為廣泛，研究人員利用分子生物學(xué)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-143通過(guò)負(fù)向調(diào)控IGFBP5（insulin like growth factor binding protein 5）基因的表達(dá)在小鼠肌肉發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用［7］。在家禽的研究中發(fā)現(xiàn)，雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化受到miR-21-5p轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)KLF3（KLF transcription factor 3）表達(dá)的影響，而成肌細(xì)胞的增殖和分化則與miR-320-3p靶向CFL2（cofilin 2）調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白重塑有關(guān)［8-9］。在反芻動(dòng)物中，miR-377負(fù)調(diào)控 FHL2（four and a half LIM domains 2）抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化［10］，而miR-27b則通過(guò)靶向MSTN（myostatin）促進(jìn)了綿羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖［11］。以上這些研究均表明miRNA在畜禽肌肉生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

miRNA是在mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中伴隨產(chǎn)生的，針對(duì)miRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程及其轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了大量的研究。在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中，胚胎干細(xì)胞中Cyclin E的高水平表達(dá)可歸因于轉(zhuǎn)錄因子Esrrb（estrogen related receptor beta）的轉(zhuǎn)錄激活以及與其負(fù)調(diào)控子miR-15a的協(xié)同作用［12］。在小鼠C1C12細(xì)胞中，miR-1a-3p、miR-206-3p、miR-24-3p和miR-486-5p可通過(guò)靶向轉(zhuǎn)錄因子MRTF-A（myocardin related transcription factor A）的3′UTR區(qū)域調(diào)控小鼠成肌細(xì)胞的分化［13］。在肌肉細(xì)胞分化過(guò)程中，成肌轉(zhuǎn)錄因子MyoD（myogenic differentiation）通過(guò)與miR-206啟動(dòng)子結(jié)合誘導(dǎo)miR-206表達(dá)上調(diào)來(lái)增加肌肉細(xì)胞分化［14］。本課題組前期綿羊肌肉全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，在相同飼養(yǎng)條件下，miR-127在產(chǎn)肉率高的蘇尼特羊背最長(zhǎng)肌組織中的表達(dá)水平顯著高于產(chǎn)肉率低的小尾寒羊，推測(cè)其在綿羊成肌細(xì)胞增殖分化過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用。因此，本試驗(yàn)分離了綿羊原代成肌細(xì)胞，通過(guò)干擾/過(guò)表達(dá)調(diào)控成肌細(xì)胞中miR-127的表達(dá)水平，探究了miR-127對(duì)體外綿羊成肌細(xì)胞增殖分化的作用以及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的上游通路，為進(jìn)一步揭示miRNA在綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育性狀中的分子機(jī)制及高產(chǎn)肉量綿羊培育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM減血清培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）、PBS磷酸緩沖液、0.25％胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司；LipofectamineTM 2000購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；全RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PBST、DAPI、多聚甲醛、DNA 含量檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期）購(gòu)自Solarbio 公司；BeyoClick EdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Dual Luciferase Reporter Assay Kit、HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR、Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 綿羊成肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定

綿羊胚胎試驗(yàn)樣品來(lái)自天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基地，將10只生長(zhǎng)時(shí)期一致的新鮮小尾寒羊胚胎經(jīng)生理鹽水（0.9％）沖洗后低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，采集胎羊背最長(zhǎng)肌，在PBS濕潤(rùn)環(huán)境下使用無(wú)菌剪刀剔除血管及結(jié)締組織，將剩余的肌肉組織剪成肉糜狀，加入適量胰蛋白酶放入搖床4 ℃消化過(guò)夜，消化結(jié)束后依次過(guò)70 μm和40 μm細(xì)胞篩，過(guò)濾液1 000 r·min-1離心10 min，取適量完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀后轉(zhuǎn)移至10 cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿，放置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用免疫熒光法鑒定成肌細(xì)胞純度，將細(xì)胞懸液接種在內(nèi)置細(xì)胞爬片的6孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，加入4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌5 min×3次，采用0.1%（TritonX-100）4 ℃通透15 min，PBS 洗滌5 min×3次；5%羊血清室溫封閉30 min，除去封閉液滴加一抗Desmin，4 ℃孵育過(guò)夜；次日PBST洗滌5 min×3次，避光滴加二抗（goat anti-rabbit IgG），室溫孵育2 h，PBST洗滌5 min×3次；DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，用PBS洗滌5 min×3次，滴加抗熒光猝滅劑封片，鏡檢，采集圖像。

1.3 綿羊成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化

取正常培養(yǎng)的綿羊成肌細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度達(dá)到90%，更換為分化培養(yǎng)基（含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基），誘導(dǎo)分化7 d，觀察綿羊成肌細(xì)胞的分化情況。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)PAX3（Paired Box 3）的CDS區(qū)序列設(shè)計(jì)合成pcDNA3.1-PAX3過(guò)表達(dá)載體；根據(jù)oar-miR-127的序列設(shè)計(jì)合成oar-miR-127的模擬物（mimics）和抑制劑（inhibitor），載體序列信息見(jiàn)表1，載體均在上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.5 基因表達(dá)水平檢測(cè)

將成肌細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度生長(zhǎng)到70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-127 mimics和mimics NC、miR-127 inhibitor、inhibitor NC至成肌細(xì)胞中，每組試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，6 h后更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)天根總RNA提取試劑盒說(shuō)明（天根，北京）提取細(xì)胞總RNA，用HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后利用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR，檢測(cè)成肌細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA（proliferating cell nuclear antigen）和CDK4（cyclin dependent kinase 4）的表達(dá)水平、成肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因BAX（BCL2 associated X， apoptosis regulator）和caspase3（CASP3）的表達(dá)水平、成肌細(xì)胞分化相關(guān)基因MYOD1（myogenic differentiation）和MYHC表達(dá)水平，分別以U6和β-actin（actin beta）作為miR-127及目的基因內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列信息見(jiàn)表2。

1.6 EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖

將成肌細(xì)胞接種于6孔板中，待其密度生長(zhǎng)到70%，轉(zhuǎn)染miR-127 mimics、mimics NC、miR-127 inhibitor、inhibitor NC質(zhì)粒，每組試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，48 h后按照BeyoClickTMEdU-594細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理，染色完成后每個(gè)樣品隨機(jī)選擇3個(gè)視野，在熒光顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算增殖率。

增殖率=（新增殖的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡

在6孔板中接種成肌細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)分別轉(zhuǎn)染miR-127 mimics、mimics NC、miR-127 inhibitor、inhibitor NC，每組試驗(yàn)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，48 h收集細(xì)胞，采用DNA 含量檢測(cè)試劑盒（細(xì)胞周期）檢測(cè)各組細(xì)胞周期情況。利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。使用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果使用BD FlowJoTM軟件進(jìn)行分析。

1.8 綿羊miR-127啟動(dòng)子區(qū)域克隆

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載綿羊miR-127（ENSOARG00020018632，chromosome 18， NC_056071.1∶63420419-63422419）基因組序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)綿羊miR-127啟動(dòng)子的上、下游引物（表3），并以小尾寒羊成肌細(xì)胞基因組DNA為模板擴(kuò)增miR-127啟動(dòng)子片段。PCR產(chǎn)物送生工生物工程上海股份有限公司測(cè)序。

1.9 熒光素酶載體構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增得到的miR-127啟動(dòng)子序列分別截短，交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。在截短片段上、下游分別引入限制性內(nèi)切酶Mlu I和Xho I酶切位點(diǎn)，將不同長(zhǎng)度的片段序列連接至pGL3-Basic載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆先進(jìn)行酶切鑒定，證明目的基因已經(jīng)定向連入目的載體。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和分析比對(duì)，比對(duì)正確的即為構(gòu)建成功的目的基因表達(dá)質(zhì)粒載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。抽提后的質(zhì)粒用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染，測(cè)定濃度后于-20 ℃保存。

1.10 熒光素酶活性檢測(cè)

將分離獲得的綿羊成肌細(xì)胞接種到24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%，共轉(zhuǎn)染pGL3-Basic和miR-127啟動(dòng)子重組質(zhì)粒，使用 Dual Luciferase Reporter Assay Kit試劑盒，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。每組3個(gè)重復(fù)，轉(zhuǎn)染48 h后用PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入1×Cell Lysis Buffer，振搖裂解5 min，吹打并吸取細(xì)胞裂解產(chǎn)物至1.5 mL離心管中，11 200 r·min-1 （12 000×g）常溫離心2 min，取上清用于后續(xù)檢測(cè)。取100 μL平衡至室溫的Luciferase Substrate加入酶標(biāo)板中，小心吸取20 μL細(xì)胞裂解上清至酶標(biāo)板孔中，迅速混勻后立即于酶標(biāo)儀中檢測(cè) Firefly luciferase報(bào)告基因活性，在以上反應(yīng)液中加入100 μL新鮮配制的Renilla substrate工作液，迅速混勻后立即于酶標(biāo)儀中檢測(cè)Renilla luciferase報(bào)告基因活性，計(jì)算各孔的螢火蟲(chóng)發(fā)光與Renilla發(fā)光比值，將樣品孔比值與對(duì)照組比值進(jìn)行歸一化處理。

1.11 miR-127核心啟動(dòng)子區(qū)域轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)

使用AnimalTFDB v4.0（http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB4/#/）預(yù)測(cè)與綿羊miR-127核心啟動(dòng)子區(qū)域可能結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)。

1.12 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)結(jié)果利用SPSS 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并使用軟件GraphPad Prism 9.0做柱狀圖，熒光定量PCR結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參使用2-ΔΔct計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量；利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；利用單因素方差分析對(duì)多組試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，所有結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，Plt;0.05和Plt;0.01表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定

分離得到的原代成肌細(xì)胞呈紡錘形，形態(tài)均一（圖1A）。對(duì)培養(yǎng)的成肌細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，結(jié)果顯示誘導(dǎo)分化7 d后，細(xì)胞開(kāi)始融合產(chǎn)生大量肌管（圖1B）。對(duì)分離得到的原代成肌細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示成肌細(xì)胞標(biāo)志基因Desmin在細(xì)胞中大量表達(dá)（圖1C）。由此說(shuō)明，本研究所分離獲得的是高純度的綿羊成肌細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2 miR-127對(duì)綿羊成肌細(xì)胞增殖的影響

為了研究miR-127對(duì)綿羊成肌細(xì)胞增殖的影響，將構(gòu)建的miR-127 mimics、mimics NC、miR-127 inhibitor、inhibitor NC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至綿羊成肌細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞總RNA，利用RT-qPCR檢測(cè)miR-127表達(dá)水平，結(jié)果顯示構(gòu)建的miR-127 mimics、miR-127 inhibitor質(zhì)粒分別過(guò)表達(dá)和抑制了miR-127的表達(dá)（Plt;0.01，圖2A）。EdU結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-127顯著促進(jìn)了成肌細(xì)胞增殖，抑制其表達(dá)后則相反（Plt;0.05，圖2B）。RT-qPCR結(jié)果顯示，在綿羊成肌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-127后，細(xì)胞增殖標(biāo)志基因PCNA和CDK4的表達(dá)水平顯著增加（Plt;0.01，圖2C），S期和G2期細(xì)胞數(shù)量增加，G1期細(xì)胞數(shù)量減少（圖2D），抑制其表達(dá)后則相反。

2.3 miR-127對(duì)綿羊成肌細(xì)胞凋亡的影響

過(guò)表達(dá)miR-127顯著降低了綿羊成肌細(xì)胞中BAX和caspase3的表達(dá)水平（Plt;0.05，圖3A），抑制其表達(dá)后則相反。此外，通過(guò)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)一步評(píng)估了miR-127對(duì)綿羊成肌細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，miR-127 mimics組凋亡率（9.2%）明顯低于mimics NC組（12.5%），而miR-127 inhibitor組凋亡率（13.3.%）明顯高于inhibitor NC組（10.9%）（圖3B）。

2.4 miR-127對(duì)成肌細(xì)胞分化的影響

不同處理組綿羊成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-127后明顯促進(jìn)了綿羊成肌細(xì)胞肌管的形成，肌管數(shù)量及大小明顯提升（圖4A），成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MYHC（myosin heavy chain）的熒光強(qiáng)度顯著增加（Plt;0.05，圖4B），成肌細(xì)胞分化標(biāo)志基因MYOD1和MYHC的表達(dá)水平顯著升高（Plt;0.05，圖4C）。抑制 miR-127表達(dá)后則相反。

2.5 綿羊miR-127核心啟動(dòng)子區(qū)鑒定

根據(jù)擴(kuò)增的miR-127啟動(dòng)子序列，利用pGL3-Basic質(zhì)粒構(gòu)建miR-127上游啟動(dòng)子區(qū)不同長(zhǎng)度片段的熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，分別為miR-127-P1（0/+300 bp）、miR-127-P2（0/+600 bp）、miR-127-P3（0/+900 bp）、miR-127-P4（0/+1 200 bp）、miR-127-P5（0/+1 500 bp）、miR-127-P6（0/+1 800 bp）和miR-127-P7（0/+2 000 bp）。將不同長(zhǎng)度片段的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至綿羊成肌細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞，檢測(cè)雙熒光素酶活性。結(jié)果顯示，miR-127-P6的熒光素酶活性極顯著高于空載體pGL3-Basic和其他片段，表明該片段為綿羊miR-127上游的核心啟動(dòng)子（Plt;0.01，圖5A）。利用在線軟件AnimalTFDB v4.0預(yù)測(cè)了綿羊miR-127-P6序列中有轉(zhuǎn)錄因子PAX3的結(jié)合位點(diǎn)（圖5B）。

2.6 轉(zhuǎn)錄因子PAX3促進(jìn)綿羊miR-127在成肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄

將構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄因子PAX3過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與miR-127-P6質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至綿羊成肌細(xì)胞中，48 h后收集細(xì)胞檢測(cè)雙熒光素酶活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)錄因子PAX3過(guò)表達(dá)后綿羊成肌細(xì)胞中miR-127-P6啟動(dòng)子活性顯著升高（Plt;0.01，圖6A），同時(shí)檢測(cè)到miR-127的表達(dá)水平也極顯著上調(diào)（Plt;0.01，圖6B）。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子PAX3可促進(jìn)綿羊成肌細(xì)胞中miR-217轉(zhuǎn)錄。

3 討 論

miRNA在骨骼肌的肌源性分化和肌肉再生中發(fā)揮作用，如miR-133介導(dǎo)的Hedgehog通路調(diào)控協(xié)調(diào)胚胎肌生成［15］；miR-217-5p可直接與FGFR2（fibroblast growth factor receptor 2）的3′-非翻譯區(qū)結(jié)合，充當(dāng)骨骼肌干細(xì)胞中的肌生成啟動(dòng)子，并可能調(diào)節(jié)骨骼肌干細(xì)胞的肌生成［16］。在肌營(yíng)養(yǎng)不良小鼠模型中，miR-378的缺乏使肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白缺陷型肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（mSCs）的融合加?。?7］。miR-100-5p通過(guò)Trib2/mTOR/S6K信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨骼肌肌生成［18］。miRNA-127通過(guò)靶向S1PR3（sphingosine-1-phosphate receptor 3）增強(qiáng)成肌細(xì)胞增殖分化［19］。這些研究結(jié)果表明，miRNA在肌肉生長(zhǎng)、肌細(xì)胞增殖發(fā)育中發(fā)揮重要作用。本研究證實(shí)，miR-127過(guò)表達(dá)可顯著增加與細(xì)胞增殖相關(guān)基因PCNA和CDK4的表達(dá)，抑制了凋亡相關(guān)基因Caspase3和BAX的表達(dá)。此外，miR-127過(guò)表達(dá)還提高了細(xì)胞的DNA合成率，增加了S期和G2期細(xì)胞的比例，進(jìn)一步證實(shí)了其促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。在細(xì)胞分化方面，miR-127過(guò)表達(dá)顯著增加了成肌細(xì)胞分化相關(guān)基因MYOD1和MYHC的表達(dá)水平，同時(shí)增加了肌管形成的陽(yáng)性肌管面積，表明miR-127對(duì)綿羊骨骼肌成肌細(xì)胞的分化也具有促進(jìn)作用。miR-127過(guò)表達(dá)顯著促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖、分化，并抑制了成肌細(xì)胞凋亡。這一發(fā)現(xiàn)與前人的研究相一致，說(shuō)明miR-127在調(diào)控綿羊骨骼肌發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

miRNA是一類短鏈非編碼RNA分子，可通過(guò)調(diào)控下游基因的表達(dá)在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［20-22］。目前對(duì)于miRNA的研究主要集中在其對(duì)下游靶基因的調(diào)控關(guān)系上，然而已有研究人員注意到解析調(diào)控miRNA轉(zhuǎn)錄的上游調(diào)控機(jī)制也同樣十分重要。轉(zhuǎn)錄因子是一類能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)［23-26］。miRNA與轉(zhuǎn)錄因子之間存在著復(fù)雜的相互作用關(guān)系。許多轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控miRNA的轉(zhuǎn)錄［27-28］。近期研究揭示了轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控miRNA表達(dá)及細(xì)胞功能中的重要作用。例如，轉(zhuǎn)錄因子MYOD已被發(fā)現(xiàn)能夠直接與miR-182的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而增強(qiáng)miR-182的表達(dá)水平，這一過(guò)程在小鼠肉瘤組織轉(zhuǎn)移中起到促進(jìn)作用［29］。此外，研究還指出轉(zhuǎn)錄因子AP-2α（adaptor protein complex 2）能夠特異性結(jié)合小鼠miR-25-3p的核心啟動(dòng)子區(qū)域，激活miR-25的成熟表達(dá)，進(jìn)而對(duì)小鼠C2C12細(xì)胞的代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)［30］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SNAIL（snail zinc finger protein）與miR-28-3p和miR-193a-5p相互作用，在人成肌細(xì)胞的肌源性分化中發(fā)揮作用［31］。在血管平滑肌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子c-Myb（MYB proto-oncogene）通過(guò)miR-143/145的轉(zhuǎn)錄激活，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化過(guò)程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控［32］。這些發(fā)現(xiàn)突顯了轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中的關(guān)鍵角色，以及它們通過(guò)miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在疾病發(fā)生發(fā)展中的重要性，而且轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因序列的不同位置，發(fā)揮著不同的調(diào)控作用，進(jìn)而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性及其表達(dá)［33］。

PAX轉(zhuǎn)錄因子家族是一個(gè)與發(fā)育相關(guān)的重要家族，主要包括PAX3、PAX4、PAX6、PAX7［34］。其中轉(zhuǎn)錄因子PAX3對(duì)于肌肉細(xì)胞的增殖和分化起著關(guān)鍵作用。PAX3在胚胎期間參與了肌肉細(xì)胞的形成和發(fā)育過(guò)程，轉(zhuǎn)錄因子PAX3在體外和體內(nèi)引導(dǎo)小鼠胚胎成血管細(xì)胞向骨骼肌發(fā)生過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［35-37］。同時(shí)在成體肌肉組織中也發(fā)揮著重要作用。研究表明，PAX3和PAX7作為轉(zhuǎn)錄因子在肌肉損傷中通過(guò)H3K4甲基化機(jī)制和刺激基因激活的染色質(zhì)修飾誘導(dǎo)細(xì)胞分裂，這種調(diào)節(jié)可以加速骨骼肌損傷的愈合修復(fù)，尤其是骨骼肌的損傷［38］。PAX3和miR-127在功能上都能夠促進(jìn)肌生成及誘導(dǎo)分化，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子PAX3能夠調(diào)控miR-127的轉(zhuǎn)錄。在本研究鑒定出miR-127的核心啟動(dòng)子區(qū)域（上游1 500～1 800 bp）存在轉(zhuǎn)錄因子PAX3結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)轉(zhuǎn)錄因子PAX3是調(diào)控綿羊成肌細(xì)胞中miR-127表達(dá)的重要調(diào)控元件，雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果也表明PAX3可有效促進(jìn)miR-127轉(zhuǎn)錄活性，顯著上調(diào)miR-127的表達(dá)水平。本結(jié)果證實(shí)了轉(zhuǎn)錄因子PAX3調(diào)控miR-127在綿羊成肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的假設(shè)。

4 結(jié) 論

本研究表明，miR-127能夠促進(jìn)綿羊成肌細(xì)胞增殖和分化，減少成肌細(xì)胞凋亡，對(duì)綿羊成肌細(xì)胞發(fā)育具有積極作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-127的核心啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?1 500/+1 800 bp，在綿羊成肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子PAX3可與該片段結(jié)合并能夠正向調(diào)節(jié)miR-127的轉(zhuǎn)錄。本研究為探索miRNA在綿羊肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控以及綿羊育種中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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（編輯 郭云雁）