摘 要： 旨在利用活體與細(xì)胞模型探究高密度脂蛋白結(jié)合蛋白（HDLBP）的亞細(xì)胞分布、基因功能及其與鵝肥肝形成的關(guān)系。本研究選取70日齡健康朗德鵝公鵝14只，單籠飼養(yǎng)，隨機(jī)均分為對照組（平均體重為3.71 kg，自由采食）和試驗組（平均體重為3.72 kg，填飼20 d）進(jìn)行活體模型試驗。從23日齡朗德鵝胚胎中分離肝細(xì)胞并過表達(dá)HDLBP基因進(jìn)行細(xì)胞模型試驗。首先采用免疫印跡法、免疫熒光技術(shù)對鵝原代肝細(xì)胞中HDLBP蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，其次采用免疫印跡法檢測填飼鵝和對照鵝肝臟全細(xì)胞HDLBP（wHDLBP）及線粒體中HDLBP（mHDLBP）的蛋白質(zhì)豐度，然后在鵝原代肝細(xì)胞中過表達(dá)HDLBP，檢測其對細(xì)胞中mHDLBP蛋白質(zhì)豐度、丙二醛（MDA）含量、總超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）活性、活性氧類物質(zhì)（ROS）和線粒體膜電位水平的影響，最后通過轉(zhuǎn)錄組測序分析篩選HDLBP過表達(dá)影響的差異表達(dá)基因與相關(guān)信號通路，并在活體模型中對部分差異表達(dá)基因進(jìn)行定量PCR驗證。結(jié)果表明：HDLBP可結(jié)合到線粒體中；填飼組wHDLBP和mHDLBP蛋白質(zhì)豐度均顯著低于對照組（Plt;0.01）；在鵝原代肝細(xì)胞中過表達(dá)HDLBP顯著增加mHDLBP的蛋白質(zhì)豐度（Plt;0.05），增加MDA（Plt;0.01）和ROS（Plt;0.05）含量，降低線粒體膜電位（Plt;0.05）及T-SOD（Plt;0.05）和GSH-PX（Plt;0.05）活性；HDLBP過表達(dá)所影響的上調(diào)差異表達(dá)基因主要富集于免疫/炎癥相關(guān)通路。此外，相對于對照組，填飼組中炎癥相關(guān)基因IL1R1、TNFSF10、LTC4S、NCF1、SFTPA1及KDR的表達(dá)可能受到HDLBP的調(diào)控而顯著減少（Plt;0.05，0.01或0.001）。HDLBP能夠與線粒體結(jié)合，填飼顯著降低鵝肝全細(xì)胞和線粒體樣中HDLBP的蛋白水平，過表達(dá)HDLBP導(dǎo)致線粒體功能損傷、氧化應(yīng)激和炎性因子的表達(dá)增強(qiáng)，因此HDLBP可能通過影響線粒體功能、調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為鵝肥肝提供保護(hù)。

關(guān)鍵詞： 鵝；肥肝；HDLBP；線粒體；氧化應(yīng)激；炎癥

中圖分類號： S835.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0366-6964（2024）09-3897-17

HDLBP Is Involved in Goose Fatty Liver Formation by Regulating the Level of Oxidative

Stress and the Expression of Inflammatory Factors

YUAN" Zijin， WANG" Wanxin， XING" Ya， LI" Jiahui， XUE" Ying， GE" Jing， ZHAO" Minmeng，

LIU" Long， GONG" Daoqing， GENG" Tuoyu*

（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University， Yangzhou 225009， China）

Abstract：" The aim of this study was to investigate the subcellular localization and function of high density lipoprotein binding protein （HDLBP）， and its relationship with the formation of goose fatty liver using in vivo and cellular models. Fourteen 70-day-old healthy Landes male geese were selected and raised in single cages. They were randomly divided into the control group （average weight 3.72 kg， ad libitum feeding） and the treating group （average weight 3.71 kg， overfed for 20 d） for in vivo experiment. Hepatocytes were isolated from 23-day-old Landes goose embryos and overexpressed with HDLBP gene for cellular experiment. Firstly， the subcellular localization of HDLBP protein in goose primary hepatocytes was determined by immunoblotting and immunofluorescence analyses. Secondly， the protein abundance of total HDLBP （wHDLBP） and mitochondrial HDLBP （mHDLBP） in the liver of the overfed geese and the control geese was determined by immunoblotting analysis. Then， HDLBP was overexpressed in goose primary hepatocytes， which was followed by determining the effects of HDLBP overexpression on the protein abundance of mHDLBP， the content of malondialdehyde （MDA）， the activities of total superoxide dismutase （T-SOD） and glutathione peroxidase （GSH-PX）， the level of reactive oxygen species （ROS）， and mitochondrial membrane potential. Finally， the differentially expressed genes （DEGs） and related signaling pathways affected by HDLBP overexpression were identified by transcriptome sequencing analysis， and some DEGs were verified in the in vivo model by quantitative polymerase chain reaction （PCR）. The results showed that HDLBP could bind to mitochondria; the protein abundance of wHDLBP and mHDLBP in the overfeeding group was significantly lower than that in the control group （Plt;0.01）; overexpression of HDLBP in goose primary hepatocytes significantly increased the protein abundance of mHDLBP （Plt;0.05）， increased the levels of MDA （Plt;0.01） and ROS （Plt;0.05）， and decreased the mitochondrial membrane potential （Plt;0.05） and the activities of T-SOD （Plt;0.05） and GSH-PX （Plt;0.05）. The up-regulated DEGs affected by HDLBP overexpression were mainly enriched in immune/inflammation-related pathways. In addition， compared with the control group， the expression of inflammation-related genes including IL1R1， TNFSF10， LTC4S， NCF1， SFTPA1， and KDR in the overfeeding group might be significantly reduced via HDLBP regulation （Plt;0.05， 0.01 or 0.001）. HDLBP can bind to mitochondria， and overfeeding significantly reduced the protein levels of wHDLBP and mHDLBP in goose liver. Overexpression of HDLBP leads to mitochondrial dysfunction， oxidative stress and increased expression of inflammatory factors. Therefore， HDLBP may provide protection for goose fatty liver by affecting mitochondrial function， regulating oxidative stress and inflammatory response.

Key words： goose; fatty liver; HDLBP; mitochondria; oxidative stress; inflammation

*Corresponding author：GENG Tuoyu， E-mail：tygeng@yzu.edu.cn

鵝脂肪肝（俗稱鵝肥肝）是利用富含碳水化合物的玉米對70日齡左右的仔鵝進(jìn)行短期人工填飼而形成的［1-2］。不同于人類和嚙齒動物的非酒精性脂肪肝?。∟AFLD），鵝肥肝屬于生理性脂肪肝，在高度脂肪變性的情況下并不發(fā)生炎癥等病變，提示鵝肝具有某種獨特的保護(hù)機(jī)制［3-4］。以往的研究表明，填飼后炎癥相關(guān)基因（如TNF-α）、補(bǔ)體標(biāo)記基因（如C3、C4）的mRNA表達(dá)水平顯著減少，脂聯(lián)素受體1/2的mRNA表達(dá)水平顯著上升，這些變化均有利于鵝肥肝避免炎癥的發(fā)生［5-7］。

線粒體不僅是細(xì)胞的“能量工廠”，而且在信號傳導(dǎo)、細(xì)胞分化、凋亡等方面發(fā)揮重要作用［8］。研究表明，線粒體的結(jié)構(gòu)和功能與NAFLD的形成與惡化密切相關(guān)。比如，當(dāng)小鼠攝入過多碳水化合物后，肝臟中脂肪大量沉積，使線粒體呼吸鏈功能受損，導(dǎo)致線粒體功能障礙，ROS生成增多，進(jìn)而誘導(dǎo)促炎因子的表達(dá)，形成非酒精性脂肪肝炎（NASH）［9-10］。另一方面，過量產(chǎn)生的ROS可攻擊線粒體，造成線粒體分裂融合障礙、線粒體DNA（mtDNA）序列突變、呼吸鏈復(fù)合物活性下降等［11-12］。因此，氧化應(yīng)激與線粒體損傷間可能形成一種惡性循環(huán)［13］，促使非酒精性脂肪肝病由單純的脂肪變性轉(zhuǎn)化為NASH。然而，Sun等［14］發(fā)現(xiàn)，鵝肥肝中丙二醛含量顯著降低，谷胱甘肽過氧化物酶活性、還原性谷胱甘肽含量及線粒體膜電位顯著升高。這種氧化應(yīng)激水平降低與線粒體功能增強(qiáng)間的關(guān)聯(lián)可能是鵝肥肝不發(fā)生炎癥的重要原因之一。

高密度脂蛋白結(jié)合蛋白（high density lipoprotein binding protein，HDLBP）屬于KH結(jié)構(gòu)域（K homology RNA binding domain）家族［15］，可通過與高密度脂蛋白（high density lipoprotein， HDL）結(jié)合而促進(jìn)膽固醇向肝臟轉(zhuǎn)運，從而影響膽固醇的代謝［16］。肝臟中膽固醇的過多積累而導(dǎo)致的膽固醇代謝紊亂，會引起線粒體膜流動性降低、通透性增加，影響線粒體的結(jié)構(gòu)和功能，誘發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而促使NAFLD向NASH過渡［17-19］。綜上所述，HDLBP可能通過影響線粒體功能在NAFLD/NASH的形成與發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究旨在通過檢測HDLBP在鵝肝細(xì)胞中的分布，朗德鵝肥肝和正常肝全細(xì)胞和線粒體中HDLBP的表達(dá)量，過表達(dá)HDLBP對氧化應(yīng)激、線粒體功能及炎癥相關(guān)基因的影響，闡明HDLBP在鵝肥肝形成中的作用及相關(guān)機(jī)制，為促進(jìn)鵝肥肝生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與樣本采集

選取70日齡健康的朗德鵝公鵝14只（江蘇淮安市笠誠畜禽公司），隨機(jī)分為填飼組（7只，平均體重為3.72 kg）和對照組（7只，平均體重為3.71 kg），單籠飼養(yǎng)。對照組自由采食和飲水，填飼組使用填飼槍進(jìn)行食管灌注，飼料主要成分為添加1%植物油、1%食鹽及其他營養(yǎng)添加劑的熟制玉米。對于填飼組，先進(jìn)行5 d的預(yù)填飼，期間，鵝的飼喂量從每天的100 g逐漸增加到300 g。隨后進(jìn)入為期20 d的正式填飼階段。填飼方案如下：前5 d，日飼喂量（每日3餐）為500 g；隨后7 d日飼喂量（每日4餐）達(dá)到800 g；最后8 d日飼喂量（每日5餐）增加到1 200 g。所有試驗鵝于填飼20 d后用二氧化碳進(jìn)行安樂死，隨后收集肝樣速凍于液氮，存于－80℃。

1.2 鵝原代肝細(xì)胞的分離培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

按照洪勝輝等［20］的方法從孵化23日齡的朗德鵝胚胎中分離和培養(yǎng)原代肝細(xì)胞（DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國GIBCO公司），肝細(xì)胞懸液制備好后按每孔1×106個·mL-1細(xì)胞鋪12孔/6孔培養(yǎng)板，再轉(zhuǎn)移至5% CO2、38℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長密度達(dá)到70%～90%時，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行過表達(dá)載體與空載體的轉(zhuǎn)染（HDLBP過表達(dá)質(zhì)粒由蘇州吉瑪基因公司合成、jetPRIME通用型DNA/RNA轉(zhuǎn)染試劑購自法國Polyplus公司），繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)試驗。

1.3 HDLBP在鵝肝細(xì)胞中的定位分析

用預(yù)熱的Phosphate Buffer Saline（PBS）洗滌細(xì)胞2次，輕輕刮下細(xì)胞，收集至1.5 mL EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加PBS重懸，再次離心，留細(xì)胞沉淀，然后使用細(xì)胞核/細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（購自上海翌圣生物科技有限公司），提取胞漿和胞核蛋白，進(jìn)行免疫印跡分析。

在12孔培養(yǎng)板中放入圓形爬片，將細(xì)胞加到培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光試驗。先用PBS洗滌3次（每次3 min），然后進(jìn)行固定、通透以及抗體孵育等步驟（一抗：1∶100；二抗：1∶200），具體方法參考Zeng等［21］的報道（HDLBP抗體購自美國Abcam公司、FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自杭州華安生物技術(shù)有限公司）。MitoTrackerTM Red染色：事先用二甲基亞砜（DMSO）將MitoTrackerTM Red溶解成1 mmol·L-1的儲存液，－20℃保存（MitoTrackerTM Red FM購自美國Invitrogen公司）。用帶FITC綠色熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗覆蓋細(xì)胞，室溫孵育1 h后，PBS洗滌3次，5 min·次-1，每孔加入500 μL配制好的150 nmol·L-1的MitoTrackerTM Red染色液（PBS稀釋），37℃避光染色30 min，PBS洗滌3次，5 min·次-1。上述步驟結(jié)束后，取出爬片，濾紙吸干水分，反扣在滴有防熒光淬滅劑的載玻片上，用無色透明指甲油輕刷片子四周，晾干后在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

按照線粒體提取試劑盒說明書得到線粒體沉淀后（線粒體提取試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司），加入500 μL配制好的IB緩沖液，輕柔吹打線粒體沉淀，然后將懸液緩慢加到含有500 μL Percoll工作液（10% 0.25 mol·L-1蔗糖+75% IB+15% Percoll細(xì)胞分離液）的1.5 mL EP管中，靜置分層，在4℃下21 000 g離心8 min，棄上清，接著加入800 μL IB緩沖液，再次吹打混勻，在4℃下15 000 g離心5 min，棄上清，獲得線粒體沉淀，進(jìn)行免疫印跡分析。

1.4 線粒體功能相關(guān)指標(biāo)的檢測

將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌2次，用0.25%的胰酶消化2 min，加完全培養(yǎng)基終止消化，反復(fù)輕柔吹打數(shù)次，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加PBS重懸，再次離心，棄上清，每管加入1 mL稀釋好的染色工作液（配比為染色液：無血清培養(yǎng)基=1∶1 000），37℃孵育20 min后，在500 g下離心5 min，去除染色液，用PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測ROS水平?；钚匝鯔z測試劑盒購自北京Solarbio公司。

在收集的細(xì)胞中加入1 mL配制好的1×TMRE染色工作液（配比為1 000×TMRE：檢測緩沖液=1∶1 000），37℃孵育20 min后，在600 g下室溫離心5 min，棄上清，用37℃預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌2次，再用適量的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，根據(jù)熒光強(qiáng)度衡量線粒體膜電位的變化。線粒體膜電位檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所。

收集各組細(xì)胞，在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS緩沖液重懸，冰浴超聲破碎（功率300 w，超聲5 s，間隔10 s，總時間3 min），然后嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，分別采用硫代巴比妥酸法、2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2，4-二磺基苯）-2H-四氮唑鈉鹽法及5，5′-二硫代雙-2-硝基苯甲酸法檢測細(xì)胞中丙二醛（MDA）、總超氧化物岐化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）水平。MDA、T-SOD、GSH-PX試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 免疫印跡分析

向勻漿的組織或細(xì)胞中加入適量的Radio-Immunoprecipitation Assay裂解液，并按100∶1的比例加入苯甲基磺酰氟，冰上裂解15 min，12 000 g 4℃離心15 min，收集上清，使用BCA法測定濃度并定量后，加入5× SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（還原性），100℃煮沸10 min，冷卻后上樣。用10% SDS-PAGE對蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，具體方法參考Mobin等［22］的報道。在蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，用免疫印跡洗滌緩沖液（TBST）洗膜3次（每次5 min）。接著加入一抗HDLBP（1∶10 000）、VDAC1/2（1∶1 000）、β-Actin（1∶5 000）、GAPDH（1：10 000）或LaminB1（1∶500），4℃孵育過夜，然后再用TBST洗膜3次（每次10 min），加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST洗3次（每次10 min），Enhanced Chemo-Luminescence（ECL）曝光顯影，用凝膠成像系統(tǒng)成像。HDLBP和LaminB1抗體購自美國Abcam公司；β-actin抗體購自武漢ABclonal生物技術(shù)公司；GAPDH、VDAC1/2抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP偶聯(lián)的山羊抗鼠二抗/山羊抗兔二抗購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.6 轉(zhuǎn)錄組分析

高通量轉(zhuǎn)錄組測序分析和數(shù)據(jù)分析由北京諾禾致源科技公司完成。分析步驟簡述如下：總RNA提取后，將Oligo（dT）磁珠吸附帶polyA的mRNA用于cDNA合成。在檢測cDNA質(zhì)量和含量后構(gòu)建cDNA文庫。在Illumina平臺上使用PE150測序策略進(jìn)行測序分析。從原始數(shù)據(jù)中去除接頭和低質(zhì)量Reads。對Clean Data進(jìn)行Q20和Q30計算以檢測測序錯誤率。采用HISAT2軟件對Clean Reads進(jìn)行從頭組裝，用FPKM（Fragments Per Kilobase Per Million Fragments）法進(jìn)行基因表達(dá)分析。隨后，用DESeq2方法進(jìn)行組間差異表達(dá)分析，再用Benjamini和Hochberg方法校正P值，獲得校正后的P值（Padj）。Padjlt;0.05，log2（Fold Change）＞0.585作為篩選差異表達(dá)基因（DEG）的標(biāo)準(zhǔn)，最后通過GO（Gene Ontology）分析進(jìn)行DEGs功能注釋，以及KEGG（Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes）分析篩選DEGs富集的通路。

1.7 RNA提取、cDNA合成及qPCR檢測

按照說明書用TRNzol試劑提取細(xì)胞樣品的總RNA（TRNzol Universal總RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技公司），然后測定RNA濃度及純度，再按說明書使用HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒合成cDNA供qPCR分析（HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+ gDNA wiper）試劑盒購自翌圣生物科技有限公司）。qPCR體系為20 μL，包括2 μL cDNA、7.2 μL ddH2O、10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL上游引物（10 μmol·L-1）、0.4 μL下游引物（10 μmol·L-1）。反應(yīng)程序按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說明書設(shè)置（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒購自翌圣生物科技有限公司），采用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達(dá)量，內(nèi)參基因為GAPDH和UBC。引物序列見表 1（引物合成由蘇州金唯智生物科技公司完成）。

1.8 統(tǒng)計分析

將獲得的數(shù)據(jù)以對照組為參照進(jìn)行歸一化處理，然后用SPSS 16.0軟件對歸一化數(shù)據(jù)進(jìn)行獨立樣本t檢驗（雙尾法），分析對照組和處理組間均值差異的統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，Plt;0.05表示差異顯著，Plt;0.01表示差異極顯著，0.05lt;Plt;0.1表示有差異趨勢。圖片用GraphPad Prism 9.0軟件制作。

2 結(jié) 果

2.1 HDLBP蛋白的亞細(xì)胞定位

免疫印跡和免疫熒光分析表明HDLBP主要分布于細(xì)胞質(zhì)中（圖1A、1B），且在熒光倒置顯微鏡下可觀察到HDLBP蛋白質(zhì)與線粒體共定位（圖2A）。HDLBP基因過表達(dá)后的免疫印跡分析表明，相對于對照組，過表達(dá)組線粒體上HDLBP的蛋白質(zhì)含量明顯增多（圖2B、2C）。

2.2 填飼對朗德鵝肝臟全細(xì)胞和線粒體中HDLBP蛋白含量的影響

對照組和填飼組肝臟全細(xì)胞樣和線粒體樣的免疫印跡分析表明，填飼組的HDLBP蛋白質(zhì)含量顯著低于對照組（Plt;0.01，圖3）。

2.3 HDLBP過表達(dá)對線粒體功能相關(guān)指標(biāo)的影響

熒光定量PCR和免疫印跡分析表明，HDLBP基因過表達(dá)極顯著地增加其在鵝原代肝細(xì)胞中的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量（Plt;0.01，Plt;0.001，圖4）。HDLBP過表達(dá)顯著增加細(xì)胞的ROS含量（Plt;0.05，圖5A、5B），降低線粒體的膜電位（Plt;0.05，圖5C、5D），增加全細(xì)胞的MDA含量（Plt;0.01，圖5E），降低T-SOD和GSH-PX的活性（Plt;0.05，圖5F、5G）。

2.4 鵝原代肝細(xì)胞HDLBP過表達(dá)所影響的基因及通路

為進(jìn)一步明晰HDLBP在鵝肥肝形成中的作用，對轉(zhuǎn)染HDLBP過表達(dá)載體或空載體的鵝原代肝細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析共篩選到859個差異表達(dá)基因（DEGs），包括531個上調(diào)基因，328個下調(diào)基因。這些基因的聚類熱圖表明同一組中的DEGs表達(dá)趨勢相似，而不同組間中的DEGs表達(dá)趨勢不同（圖6）。根據(jù)P值大小，將表達(dá)差異最顯著的部分上調(diào)基因和下調(diào)基因列于表2。GO富集分析表明，DEGs主要集中在520個GO條目，其中211個屬于生物過程（BP），82個屬于細(xì)胞組成（CC），227個通路屬于分子功能（MF）。圖7列出了不同GO類別中最顯著富集的10個條目。KEGG通路富集分析顯示，上調(diào)DEGs主要富集在Toll-like receptor signaling pathway、Influenza A、Cytosolic DNA-sensing pathway、NOD-like receptor signaling pathway、RIG-I-like receptor signaling pathway等與免疫/炎癥相關(guān)的通路，下調(diào)DEGs主要富集在Steroid hormone biosynthesis、Ascorbate and aldarate metabolism、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Retinol metabolism、Pentose and glucuronate interconversions等通路（圖8）。為驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果的可靠性，隨機(jī)選取12個DEGs進(jìn)行熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示在隨機(jī)挑選的12個基因中除SIGLEC1外，其余基因的表達(dá)趨勢均與轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果相一致（圖9A、9B），這表明轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果是可靠的。

2.5 HDLBP過表達(dá)對免疫/炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果顯示，HDLBP過表達(dá)顯著誘導(dǎo)LTC4S、IL1R1、TNFSF10、NCF1、PPAP2B、KDR、SFTPA1、CCL20基因在鵝原代肝細(xì)胞中的表達(dá)（Plt;0.05、Plt;0.01，Plt;0.001，圖10A）。與此一致，熒光定量PCR分析結(jié)果表明，HDLBP過表達(dá)也顯著誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)（Plt;0.01，Plt;0.001，圖10B）。

2.6 填飼對鵝肝臟中免疫/炎癥反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)的影響

熒光定量PCR結(jié)果顯示，除CCL20基因外，LTC4S、IL1R1、TNFSF10、NCF1、PPAP2B、KDR、SFTPA1、CCL20基因的mRNA表達(dá)量在填飼后顯著降低，這與HDLBP在鵝肥肝中的蛋白質(zhì)含量下降相關(guān)聯(lián)（Plt;0.05，Plt;0.01，Plt;0.001，圖11）。

3 討 論

人類和嚙齒動物的脂肪肝常伴有線粒體損傷與減少、氧化應(yīng)激水平的升高以及炎癥的發(fā)生［23］，而鵝肥肝卻相反［24］。在前期工作中，通過質(zhì)譜分析檢測到3只90日齡自由采食的鵝肝線粒體樣中含有HDLBP蛋白（讀數(shù)分別為6 890.8、6 913.7、5 748.1）。本研究旨在進(jìn)一步明確HDLBP在鵝肝細(xì)胞中的分布，并探究其在鵝肥肝形成中的潛在作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，HDLBP可與線粒體結(jié)合。與正常肝相比，鵝肥肝全細(xì)胞和線粒體中HDLBP蛋白質(zhì)含量均顯著減少。過表達(dá)HDLBP會降低線粒體膜電位及T-SOD和GSH-PX活性，提高M(jìn)DA和ROS含量，誘導(dǎo)與免疫/炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，且大多數(shù)基因的表達(dá)量與鵝肥肝中的情形相反。這些發(fā)現(xiàn)提示，鵝肥肝全細(xì)胞和線粒體的HDLBP蛋白含量降低有助于維持線粒體功能，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而使鵝肥肝免于炎癥反應(yīng)，避免鵝肥肝從單純的脂肪變性演變?yōu)镹ASH。

HDLBP定位于線粒體在以往的研究中未見報道。本研究通過免疫印跡分析和免疫熒光分析對這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了驗證。近年來，有一些研究發(fā)現(xiàn)某些蛋白質(zhì)并非典型的線粒體蛋白質(zhì)，但可以與線粒體結(jié)合而發(fā)揮作用。比如線粒體結(jié)合的AMPK蛋白質(zhì)，可能在自噬、線粒體融合及分裂過程中發(fā)揮作用［25］。再者，有不少研究發(fā)現(xiàn)，亞細(xì)胞定位會影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，如位于細(xì)胞核的B-cell CLL/lymphoma 3（BCL3）蛋白可調(diào)控細(xì)胞的增殖、遷移以及炎癥反應(yīng)，而位于細(xì)胞質(zhì)的BCL3 蛋白，則通過與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體結(jié)合而影響自噬體膜的形成和線粒體的功能［26-27］。因此，對蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位將有助于進(jìn)一步揭示其潛在功能。本研究發(fā)現(xiàn)的HDLBP蛋白在線粒體上的定位，對于闡明其功能至關(guān)重要。然而，HDLBP蛋白質(zhì)如何結(jié)合到線粒體上，仍有待進(jìn)一步研究。

已知HDLBP可以通過與HDL結(jié)合幫助組織中的膽固醇經(jīng)血液逆向轉(zhuǎn)運至肝臟，并在CYP7A1和CYP27A1作用下轉(zhuǎn)化為膽汁酸［28］。由于CYP27A1位于線粒體上，因此其可能參與線粒體的膽固醇代謝，不過這一推測仍有待驗證。過多膽固醇逆向轉(zhuǎn)運至肝細(xì)胞并在細(xì)胞中大量生成膽汁酸，可能會引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激與損傷，導(dǎo)致炎癥發(fā)生［29］。這與小鼠脂肪肝炎模型中，HDLBP含量升高伴有氧化應(yīng)激水平升高，線粒體結(jié)構(gòu)功能異常，以及發(fā)生炎癥相一致［21，23］。相反，鵝肥肝中HDLBP的蛋白質(zhì)含量在全細(xì)胞和線粒體中均顯著低于正常肝，這可能意味著膽固醇通過逆轉(zhuǎn)運途徑進(jìn)入肝臟的數(shù)量不會隨著血液中膽固醇含量的升高而升高。鵝肝細(xì)胞中過表達(dá)HDLBP引起線粒體膜電位降低、氧化應(yīng)激水平升高以及免疫/炎癥相關(guān)基因的表達(dá)增加，這些效應(yīng)可能與HDLBP增加膽固醇進(jìn)入肝細(xì)胞，促進(jìn)膽汁酸合成有關(guān)?？傊?，HDLBP蛋白質(zhì)含量升高會誘發(fā)氧化應(yīng)激、線粒體損傷，進(jìn)而引起炎癥的發(fā)生；鵝肥肝HDLBP蛋白質(zhì)含量的降低對這些生物學(xué)過程起到了抑制作用，與鵝肥肝氧化應(yīng)激水平不升高、線粒體生物合成增強(qiáng)以及無炎癥發(fā)生相關(guān)聯(lián)。

再者，膽固醇是線粒體膜的重要組成成分，線粒體結(jié)構(gòu)和正常生理功能的維持需要一定數(shù)量的膽固醇參與［30］。HDLBP蛋白質(zhì)含量的變化，尤其是線粒體上HDLBP蛋白的含量變化，可能通過改變線粒體膜中的膽固醇含量導(dǎo)致線粒體功能障礙，引起氧化應(yīng)激，并促使炎癥的發(fā)生。的確，有報道稱線粒體膽固醇水平升高會引起線粒體膜流動性降低、通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體去極化、膨脹和線粒體外膜破裂，使線粒體功能受損，ROS生成增多，且線粒體中的膽固醇負(fù)荷會導(dǎo)致線粒體GSH水平減少，降低GSH的防御能力，引起脂質(zhì)過氧化和對炎癥細(xì)胞因子的敏感性增加，進(jìn)而加快NAFLD發(fā)展為NASH［17，31］。由此看來，肝細(xì)胞中HDLBP含量的變化可通過影響線粒體膜中膽固醇的含量而影響氧化應(yīng)激和炎癥的發(fā)生，這可能是鵝肥肝避免氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)生的另一種途徑。

最后，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)HDLBP可誘導(dǎo)鵝原代肝細(xì)胞中與免疫炎癥反應(yīng)相關(guān)基因（LTC4S、IL1R1、TNFSF10、NCF1、PPAP2B、KDR、SFTPA1）的表達(dá)。以往的研究表明，LTC4S可催化LTA4與還原型谷胱甘肽結(jié)合，形成促炎脂質(zhì)介質(zhì)LTC4參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)［32］；IL1R1和TNFSF10可通過激活NF-κB信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答［33-34］；磷酸化的NCF1與NCF2、NCF4形成復(fù)合體后，與細(xì)胞色素復(fù)合體一起粘附在細(xì)胞膜上形成NADPH氧化酶2復(fù)合物，誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生，參與調(diào)節(jié)多種慢性炎癥性疾?。?5］；PPAP2B與白細(xì)胞粘附和炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)有關(guān)［36］；KDR的激活與免疫抑制微環(huán)境有關(guān)，突變型KDR可作為免疫治療的生物標(biāo)志物［37］；SFTPA1屬于宿主防御成分，參與先天性免疫［38］。本研究中，過表達(dá)HDLBP可誘導(dǎo)這些基因的表達(dá)，而在鵝肥肝中這些基因的表達(dá)受到抑制，由此推測HDLBP通過調(diào)控以上這些基因的表達(dá)來參與鵝肥肝的抗炎機(jī)制。

總之，鵝肥肝中HDLBP蛋白質(zhì)含量的降低可能通過多種機(jī)制促進(jìn)鵝肥肝的形成，這些機(jī)制包括HDLBP通過影響膽汁酸的形成而減少膽汁酸對線粒體及細(xì)胞的毒性作用，通過影響膽固醇在線粒體雙層脂質(zhì)膜中的過多沉積而避免線粒體出現(xiàn)功能障礙和氧化應(yīng)激。換句話說，鵝肥肝中HDLBP蛋白含量的降低對鵝肝有保護(hù)作用。此外，線粒體中HDLBP蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)意味著HDLBP蛋白質(zhì)可能通過某種途徑直接影響線粒體的結(jié)構(gòu)與功能，從而參與鵝肥肝的形成。

4 結(jié) 論

綜上所述，HDLBP與線粒體共定位；填飼組wHDLBP和mHDLBP蛋白質(zhì)豐度均顯著低于對照組；過表達(dá)HDLBP后導(dǎo)致線粒體功能損傷、氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)基因LTC4S、IL1R1、TNFSF10、NCF1、PPAP2B、KDR、SFTPA1、CCL20表達(dá)增強(qiáng)，且填飼組中HDLBP表達(dá)的降低伴有炎癥相關(guān)基因LTC4S、IL1R1、TNFSF10、NCF1、PPAP2B、KDR、SFTPA1表達(dá)的降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，HDLBP可通過影響線粒體功能和氧化應(yīng)激水平使鵝肥肝免于炎癥反應(yīng)。

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（編輯 編輯郭云雁）