摘 要： 旨在利用全基因重測序技術(shù)獲得的SNP位點為吉林梅花鹿保種群構(gòu)建分子系譜，并對其遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。本研究在鋸茸期采集保種群的吉林梅花鹿血液10 mL（n=425），其中成年公鹿132只、成年母鹿208只、仔鹿85只，提取DNA后進行全基因重測序。通過計算血源同源系數(shù)（IBD）分析吉林梅花鹿親緣關(guān)系；基于觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、系統(tǒng)發(fā)育樹和群體分化指數(shù)（Fst）等對吉林梅花鹿保種群遺傳結(jié)構(gòu)進行分析。通過全基因重測序篩選出25 548 601個高質(zhì)量SNPs，425個樣本共組成了90 100對親緣關(guān)系，平均親緣系數(shù)為0.435 1，得出195對父子關(guān)系與143對母子關(guān)系，占到采樣群體原始系譜記錄的92%，檢出原始系譜錯誤率為2.2%，糾正了原始記錄錯誤8處，具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性；分析群體分化指數(shù)（Fst），東豐型吉林梅花鹿與伊通型距離較遠；繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，將吉林梅花鹿保種群劃分為17個家系；采用的SNP標(biāo)記平均觀測雜合度為0.456，平均期望雜合度為0.277，平均多態(tài)信息含量為0.627，吉林梅花鹿保種群平均近交系數(shù)為0.078，存在較弱的近交。本研究建立了吉林梅花鹿保種群的分子系譜并對其群體遺傳結(jié)構(gòu)進行了分析，這對于保護吉林梅花鹿遺傳多樣性和規(guī)劃保種群后續(xù)選育計劃至關(guān)重要。

關(guān)鍵詞： 吉林梅花鹿；SNP；分子系譜

中圖分類號：S829.9

文獻標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-3925-11

Molecular Genealogy Construction and Population Genetic Structure Analysis of Jilin

Sika Deer Based on SNP Loci

FAN" Guangxuan1， WANG" Tianjiao1， DONG" Yimeng1， WANG" Hongliang1， DING" Ning2， WANG" Xinhao3， XING" Xiumei1*

（1.Key Laboratory of Genetics， Breeding and Reproduction of Special Economic Animals of

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Special Animal and Plant Sciences of

Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changchun 130112，" China;

2.College of

Wildlife and Protected Area，

Northeast Forestry University， Harbin 150006，" China;

3.Guangdong Chimelong Group， Zhuhai 519000，" China）

Abstract：" The aim of this study was to construct a molecular pedigree for the Jilin sika deer conservation herd using SNP loci obtained by genome resequencing technology， and to analyse the genetic structure of the population. The 10 mL of blood from Jilin sika deer of the conservation herd （n=425） during the antler-sawing period was collected， including 132 adult bucks， 208 adult does and 85 fawns， and extracted the DNA for whole genome resequencing. The kinship relationship of Jilin sika deer was analysed by calculating the blood homology coefficient （IBD）， and the genetic structure of the Jilin sika deer conservation population was analysed based on the observed heterozygosity （Ho）， the expected heterozygosity （He）， the polymorphic information content （PIC）， the phylogenetic tree and the population differentiation index （Fst）. The 25 548 601 high-quality SNPs were screened by whole genome resequencing， and 425 samples comprised a total of 90 100 pairs of kinship relationships， with an average kinship coefficient of 0.435 1. A total of 195 pairs of paternity and 143 pairs of maternity were derived， which accounted for 92% of the original genealogical records of the sampled populations， and the error rate of the original genealogical records was detected to be 2.2%， and the errors of the original records were corrected to be 8， with a high accuracy and reliability. The group differentiation index （Fst） was calculated， and the Dongfeng-type Jilin sika deer was farther away from the Yitong-type; the phylogenetic tree was drawn， and the Jilin sika deer population was divided into 17 families; the average observed heterozygosity of the SNP markers was 0.456， the average expected heterozygosity was 0.277， and the average polymorphic information content was 0.627. The average inbreeding coefficient was 0.098， and the average polymorphic information content was 0.627. The average inbreeding coefficient was 0.078， and there was weak inbreeding. The present study established the molecular genealogy and analysed the population genetic structure of the Jilin sika deer conservation herd， which is crucial for the conservation of genetic diversity of the Jilin sika deer and for the planning of the subsequent selection and breeding programme of the conservation herd.

Key words： Jilin sika deer; SNP; molecular genealogy

*Corresponding author：XING Xiumei， E-mail：xingxiumei2004@126.com

吉林梅花鹿來源于東北梅花鹿家養(yǎng)后裔，是經(jīng)過長期自然和人工選擇形成的以茸用為主的梅花鹿品種，也是我國唯一的梅花鹿地方品種。1978年吉林省12家鹿場對全省梅花鹿的茸型、體重體尺等8項指標(biāo)進行測定，確定了吉林梅花鹿包括雙陽型、撫松型、伊通型、東豐型和龍?zhí)渡叫?個類型。在這些類型的基礎(chǔ)上先后培育出雙陽、東豐、敖東、四平、東大5個梅花鹿新品種和長白山梅花鹿1個新品系。進入二十一世紀(jì)后，國外鹿產(chǎn)品大量涌入中國市場，導(dǎo)致國內(nèi)養(yǎng)殖者為了生存，利用梅花鹿和馬鹿產(chǎn)茸量的差異性進行雜交，雜交的盛行使得吉林梅花鹿數(shù)量持續(xù)減少［1］，據(jù)《中國畜禽遺傳資源志—特種畜禽志》統(tǒng)計，2008年全國存欄數(shù)約6.2萬只。目前5個類型中的龍?zhí)渡叫兔坊挂呀?jīng)非常稀少，雙陽型、伊通型、東豐型和撫松型的數(shù)量也不容樂觀，種群數(shù)量還在下滑，保種形勢嚴(yán)峻。

建立完整的系譜，對吉林梅花鹿保種工作有著十分重要的意義。查閱系譜記錄中個體的血緣關(guān)系、生產(chǎn)情況，不僅能避免近親交配造成群體遺傳多樣性的降低，還能夠根據(jù)親本信息與個體生產(chǎn)記錄估計遺傳參數(shù)，制定選配計劃。然而國內(nèi)梅花鹿的育種大多處于表型選種階段，系譜混亂，現(xiàn)有系譜錯誤率高，不利于科學(xué)的選種選配，嚴(yán)重影響吉林梅花鹿系統(tǒng)保護。繼形態(tài)標(biāo)記、細胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后，以分子突變?yōu)榛A(chǔ)的分子標(biāo)記應(yīng)運而生［2］，其標(biāo)記數(shù)量豐富，部分標(biāo)記表現(xiàn)為共顯性［3］，能夠?qū)蛐偷募兒吓c否進行鑒別，為我們提供完整的遺傳信息，是較為理想的遺傳標(biāo)記［4-5］。利用分子標(biāo)記技術(shù)對吉林梅花鹿進行親緣關(guān)系分析和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，以此構(gòu)建的分子系譜既解決了原始系譜錯誤率高、記錄不完全的問題，又能在此基礎(chǔ)之上準(zhǔn)確記錄更多世代，有助于管理者對養(yǎng)殖場進行更全面的規(guī)劃與管理。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展以及第二代測序技術(shù)費用的降低［6-7］，單核甘酸多態(tài)性（simple nucleotide polymorphisms，SNP）分子標(biāo)記易于規(guī)?；?、自動化檢測［8-10］的優(yōu)勢在親緣關(guān)系鑒定領(lǐng)域得到了體現(xiàn)。SNP呈二態(tài)性［11］，這種二等位基因分子標(biāo)記雖然沒有多等位基因標(biāo)記提供的信息多，但是位點豐富加上檢測便利的優(yōu)勢使SNP標(biāo)記可以提供更大的信息量，可用于解決更復(fù)雜的遺傳問題［12-15］。本研究利用全基因重測序技術(shù)，基于SNP標(biāo)記構(gòu)建基因組覆蓋率高、分型準(zhǔn)確率高的吉林梅花鹿分子系譜，以期改善吉林梅花鹿保種群系譜混亂的問題，對吉林梅花鹿的科學(xué)保護具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 梅花鹿基因組數(shù)據(jù)

梅花鹿基因組由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所測序得到，并使用Hi-C技術(shù)組裝至33條染色體上，大小為2 500 501 634 bp，基因組數(shù)據(jù)已上傳GSA數(shù)據(jù)庫［16］，詳見https：//ngdc.cncb.ac.cn/gwh.。

1.2 試驗樣本

本試驗所用樣本均采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林梅花鹿保種場，樣品信息見表1，共采集3個類型的425只吉林梅花鹿，其中成年公鹿132只，成年母鹿208只，仔鹿85只（2022年出生），枸櫞酸納抗凝管采集頸靜脈血10 mL，冷藏暫存，帶回實驗室后-20 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗方法

利用血液基因組DNA提取試劑盒（GO-BTCD）提取基因組DNA，使用Nanodrop1000（Thermo Fisher Scientific， DE）進行基因組DNA的質(zhì)量和濃度檢測［17］，質(zhì)檢合格后交由北京諾禾致源科技股份有限公司進行5×WGS測序［18］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用fastqc對全基因組重測序原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控，得到clean data。使用BWA軟件將重測序數(shù)據(jù)比對到參考基因組，使用GATK4.0.2.1軟件進行變異檢測。按照（-filter \"QDlt;2.0\"--filter-name \"QD2\"、-filter \"QUALlt;30.0\"--filter-name \"QUAL30\"、-filter \"SORgt;3.0\"--filter-name \"SOR3\"、-filter \"FSgt;60.0\"--filter-name \"FS60\"、-filter \"MQlt;40.0\"--filter-name \"MQ40\"、-filter \"MQRankSumlt;-12.5\"--filter-name \"MQRankSum-12.5\"、-filter \"ReadPosRankSumlt;-8.0\"--filter-name \"ReadPosRankSum-8\"）過濾條件執(zhí)行過濾，利用vcftools淘汰檢出缺失率大于0.1的位點、覆蓋深度低于5×位點、質(zhì)量低于30位點、最小等位基因頻率（MAF）小于0.05的位點。

1.4.1 吉林梅花鹿群體親緣關(guān)系分析

基于IBD（identity by descent，IBD）信息，利用PLINK v1.90 b4.6評估吉林梅花鹿親緣系數(shù)。PLINK中使用PI_HAT值來推定IBD的值，該方法基于隱馬爾科夫模型，通過矩估計來計算IBD=1、2或0的概率。采用Cervus 3.0.7軟件中的parentage analysis模塊對每只子代的最似父親和最似母親進行分析，并與保種場提供的原始系譜記錄進行比對，計算系譜錯誤率。采用zero軟件繪制已經(jīng)確定親緣關(guān)系的種公鹿系譜圖。

1.4.2 吉林梅花鹿群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用PLINK v1.90 b4.6對質(zhì)控后的SNPs進行遺傳結(jié)構(gòu)分析［19］。對吉林梅花鹿保種群的觀測雜合度（observed heterozygosity， Ho）、期望雜合度（expected heterozygosity， He）、近交系數(shù)（fixation index， Fis）和群體分化指數(shù)（Fst）等進行分析。利用treebest軟件，采用鄰接法（neighbour joining， NJ）繪制吉林梅花鹿保種群的系統(tǒng)發(fā)育樹，劃分吉林梅花鹿家系。

2 結(jié) 果

2.1 SNP檢測

在過濾之前，425個個體經(jīng)過WGS測序生成了約2.9 Tb的Raw Data，平均每個樣本7 Gb。對樣本進行SNP檢測后篩選出了25 548 601個高質(zhì)量SNPs，平均測序深度5×。

2.2 吉林梅花鹿保種群分子系譜構(gòu)建

2.2.1 親緣關(guān)系分析

利用IBD信息分析吉林梅花鹿保種群所有個體的親緣關(guān)系。當(dāng)兩只鹿之間的PI_HAT值為0～0.25時，表示兩只鹿之間無親緣關(guān)系；當(dāng)兩只鹿之間的PI_HAT值為0.25～0.5時，表示兩鹿之間是表兄弟關(guān)系；當(dāng)兩只鹿之間PI_HAT值為0.5以上時，表示兩鹿之間關(guān)系為親子或兄弟姐妹。

結(jié)果表明，425個樣本組成了90 100對親緣關(guān)系，平均親緣系數(shù)為0.435 1，其中96.1%為近親（0.25～0.5），3.9%為極近親（0.5以上）。結(jié)合保種場2016年至今的配種記錄，將參配種公鹿、參配母鹿與所有樣本根據(jù)IBD（子代中來源于同一祖先的共有等位基因）系數(shù)逐一比對，挑選出每個個體的候選父本與候選母本。425個個體共得出195對父子關(guān)系與143對母子關(guān)系，具體結(jié)果見表2。

2.2.2 吉林梅花鹿分子系譜構(gòu)建

根據(jù)親緣關(guān)系分析結(jié)果對吉林梅花鹿保種場的紙質(zhì)系譜進行校正。原始系譜共有產(chǎn)仔記錄368條，SNP親子鑒定結(jié)果共有338條，占到采樣群體原始系譜記錄的92%；系譜記錄與親子鑒定結(jié)果不符的有8處，個體20004、20002、20054、21048、18042、20007、20011、20025記錄錯誤，因為血樣的缺失無法判定親緣關(guān)系的個體22個，整體系譜錯誤率為2.2%。

基于親緣關(guān)系分析結(jié)果繪制吉林梅花鹿保種群系譜圖。以種公鹿SY504為例（圖1），F(xiàn)3代個體21038、21030、21036、21034、21039、21043均為種公鹿SY504子代，母本分別對應(yīng)為SY730、SY804、19028、SY832、SY770、SY822。

2.3 吉林梅花鹿群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 SNP標(biāo)記信息

通過共顯性遺傳標(biāo)記來估計和檢驗基因分化情況，雜合度和PIC值反映了群體的遺傳多樣性程度。Botstein等［20］認為，當(dāng)0.25lt;PIClt;0.5時，標(biāo)記為中度多態(tài)位點，PICgt;0.5時為高度多態(tài)位點，可提供足夠的信息量。由表3可知，所采用SNP標(biāo)記的平均觀測雜合度為0.456，平均期望雜合度為0.277，平均多態(tài)信息含量為0.627，說明群體具有較好的保種潛力。

2.3.2 類型間遺傳距離

基于Fst值探究不同類型的吉林梅花鹿分化程度。結(jié)果表明，東豐型吉林梅花鹿與伊通型吉林梅花鹿在遺傳距離上最遠，雙陽型吉林梅花鹿與其他兩個類型在分化程度上比較接近（表4）。

2.3.3 近交系數(shù)

吉林梅花鹿保種群近交系數(shù)在0.028 87至0.258 8之間，平均近交系數(shù)為0.078 4。我們基于近交系數(shù)分析不同家系的近交程度，其值在不同家系之間存在差異，介于0.057 4和0.111 1之間（表5）。

2.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹與家系劃分

為了探究吉林梅花鹿的家系組成，基于全染色體的SNP數(shù)據(jù)和4DTV（4倍簡并位點第三個核酸密碼子的替換率）位點對吉林梅花鹿群體進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

基于4DTV位點構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），探討低深度重測序能否區(qū)分吉林梅花鹿這一地方品種的類型。圖2中的分支較多，結(jié)合原始系譜記錄比對，根據(jù)4DTV位點構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹并沒有將親緣關(guān)系較近的個體分為一類。

基于全基因組SNP位點構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），吉林梅花鹿群體在分子水平上被聚類為數(shù)十個大的分支，并以此為基礎(chǔ)，結(jié)合群體中種鹿的分布情況，將吉林梅花鹿群體劃分為3個類型的17個家系并用不同顏色表示出來。17個家系的具體分布情況見表5。

通過Itol繪制基于全基因組SNPs位點的親緣關(guān)系系統(tǒng)發(fā)育樹，父子或母子之間用不同顏色的連線連接（圖4）。

3 討 論

3.1 吉林梅花鹿的類型區(qū)分

本研究在對吉林梅花鹿群體進行分子系譜構(gòu)建的同時嘗試使用橫跨整個基因組的標(biāo)記，對所有染色體的遺傳變異進行詳細比對［21］以找出吉林梅花鹿不同類型之間的分子依據(jù)。共線性區(qū)段中4DTV位點可反映物種在進化史中的相對分化事件以及全基因組復(fù)制事件，當(dāng)基因存在4DTV位點較多時，冗余基因較多，意味著可能發(fā)生了物種分化。Li等［22］對麥田河金線鲃和其他4種鯉科魚類進行了四倍退化第三密碼子轉(zhuǎn)換分析，估計出全基因組重復(fù)事件的發(fā)生時間在1 810萬年前；Cheng等［23］對鱘魚進行了全基因組測序和基因注釋，并對其進行4DTV分析，證實了鱘科和多吻鱘科各系特異性基因組復(fù)制的獨立性。

本研究對吉林梅花鹿群體進行4DTV分析，系統(tǒng)發(fā)育樹并未將不同類型的個體聚類，而在基于全基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，雙陽型吉林梅花鹿也經(jīng)常游離于聚類之外，這可能是長期的人工選育導(dǎo)致的。因此認為，吉林梅花鹿這一地方品種的不同類型無法通過低深度全基因重測序進行區(qū)分。

3.2 SNP分子標(biāo)記

SNP位點豐富［24］，在群體遺傳學(xué)、親子鑒定中能提供更多信息，是較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)。Yu等［25］在對20頭歐洲母豬和4頭歐洲公豬進行親緣關(guān)系鑒定時，對其中的5頭豬進行了SNP與SSR的雙重比較分析，發(fā)現(xiàn)12個SSRs的個體識別能力與30個SNPs位點的識別效果類似，且隨著位點數(shù)量的增加SNP在親緣鑒定方面也有一定的優(yōu)勢；Hauser等［26］證明了在親緣關(guān)系鑒定中SNP比SSR更敏捷；在Reverter等［27］的研究中，利用250個SNPs位點正確識別出了所有牛群體中的不同品種。在本研究中，基于SNP的親緣系數(shù)比對，一共得出338對父子或母子關(guān)系，占到原始記錄的92%，原因一方面是部分鹿個體的父本或母本已被淘汰或死亡，缺乏血樣，另一方面可能是由于保種場引進種鹿情況較多，存在周轉(zhuǎn)，導(dǎo)致子代的真實父母不在采樣群體內(nèi)。在成本方面，SNP分子標(biāo)記直接經(jīng)濟成本較高，但人工成本低且速度更快，要更適合現(xiàn)在動物群體的種群分析，越大的群體規(guī)模越能體現(xiàn)SNP的優(yōu)勢［28］，與Elblinger等［29］在分子標(biāo)記的成本描述上得出了類似的結(jié)論。

3.3 吉林梅花鹿保種群分子系譜與遺傳結(jié)構(gòu)分析

在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)較為發(fā)達的丹麥，Christensen等［30］對奶牛群體進行了系譜糾正，最終發(fā)現(xiàn)系譜錯誤率達到5%～15%。在中國，大部分鹿場同樣存在系譜記錄混亂的問題，且現(xiàn)存進行生產(chǎn)活動的種鹿缺乏父代血樣，無法對其進行單一的親子鑒定，在" 這種情況下，根據(jù)分子系譜對保種場的原始記錄進行校正至關(guān)重要［31-35］。Wang等［36］利用SNP對包括萊蕪豬在內(nèi)的42個歐亞豬種的1 116頭豬進行了種群遺傳學(xué)分析，根據(jù)NJ樹的聚類將其劃分不同的家系并提出了防止近交衰退的配種策略。Guerrero-C zar等［37］篩選了40個高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記位點，對塞內(nèi)加爾鰨目魚進行了血統(tǒng)分析，并成功構(gòu)建了一個新的綜合遺傳圖譜。本研究中，系譜記錄與親子鑒定結(jié)果不符的有8處，因為血樣的缺失無法判定親緣關(guān)系的個體22個，整體系譜錯誤率為2.2%。糾正父代記錄錯誤［38］（動物在生產(chǎn)過程中出現(xiàn)記錄錯誤，造成系譜記錄出錯）5處，糾正子代記錄錯誤（在動物進行分娩、生產(chǎn)過程中因為對環(huán)境或圈舍連續(xù)的調(diào)動造成的系譜錯誤）3處，為保種場后續(xù)的遺傳管理提供了分子水平的參考。

近交衰退是保種場可持續(xù)發(fā)展所面臨的關(guān)鍵問題，Machmoum等［39］測得沙漠種馬的近交系數(shù)為0.09，認為種群的雜合性較低，存在近交現(xiàn)象。King等［40］測得莫桑比克的本地牛群體近交系數(shù)在0.065左右，認為其近交現(xiàn)象較低。本研究測得保種場的吉林梅花鹿群體的近交系數(shù)為0.078左右，表明吉林梅花鹿群體出現(xiàn)了近交現(xiàn)象，由于隱性不良基因的純合性，這些親緣關(guān)系很近的個體之間的交配很可能導(dǎo)致近交衰退，因此在選配時應(yīng)格外注意避免這些親緣系數(shù)非常接近的個體配對，建議在后續(xù)育種工作中引入新的種公鹿，擴大群體含量，進行科學(xué)選配，避免近親繁殖。

4 結(jié) 論

本研究利用單核苷酸多態(tài)性位點在親緣關(guān)系鑒定方面的潛力通過低深度基因組重測序技術(shù)，將吉林梅花鹿保種場采集的梅花鹿樣本進行分子系譜構(gòu)建和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，糾正了保種場原始記錄錯誤的同時將吉林梅花鹿群體劃分為17個家系，這對于保護吉林梅花鹿的遺傳多樣性和規(guī)劃保種群后續(xù)選育計劃至關(guān)重要。

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（編輯 郭云雁）