摘 要： 旨在探討FKBP5在綿羊卵巢顆粒細胞（GCs）中的潛在功能。本研究從烏魯木齊市華凌屠宰場的20個2歲左右處于性成熟階段的阿勒泰羊卵巢中分離GCs。將試驗分為4組：GC（空白對照）、GC+NC（轉(zhuǎn)染siRNA-NC）、GC+ siFKBP5（轉(zhuǎn)染siRNA-FKBP5）、GC+ siFKBP5+LH（促黃體生成素處理轉(zhuǎn)染siRNA-FKBP5）。利用細胞免疫熒光檢測FKBP5蛋白在GCs中的定位。通過EdU、Tunel和Western blot檢測其對細胞增殖、凋亡的影響；通過Western blot檢測其對AKT和ERK信號通路的影響；通過ELISA檢測其對E2、P4水平的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)KBP5表達于GCs細胞質(zhì)中。FKBP5表達量隨著LH濃度不斷升高；5 IU·mL-1 LH作用4 h，F(xiàn)KBP5表達較高（Plt;0.001）。干擾FKBP5后顯著抑制了細胞增殖，并顯著降低PCNA蛋白表達量（Plt;0.001）；顯著促進了細胞凋亡，增加了BAX的表達并減少了Bcl-2的表達（Plt;0.001）；顯著抑制了GCs中AKT和ERK信號通路的激活以及E2和P4的分泌（Plt;0.001）。LH處理部分改善了干擾FKBP5對GCs的影響（Plt;0.05）。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)KBP5影響綿羊GCs的增殖、凋亡、AKT和ERK信號通路以及E2和P4的分泌，其功能受LH的影響。這些結(jié)果為進一步研究FKBP5在綿羊卵泡發(fā)育中的作用提供了理論依據(jù)。

關鍵詞： FKBP5；顆粒細胞；細胞增殖凋亡；AKT和ERK信號通路；類固醇

中圖分類號：S826.2

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-3947-10

Effects of FKBP5 on Function of Sheep Follicular Granulosa Cells

GULIMIRE·AbudureYimu "ZHANG" Xinru "WU" Yangsheng "CHEN" Ying

WANG" Liqin "XU" Xinming "HUANG" Juncheng "LIN" Jiapeng 3*

（1.Key Laboratory of Genetics Breeding and Reproduction of Grass Feeding Livestock of

Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Urumqi 830011，" China;

2.Key Laboratory of

Animal Biotechnology of Xinjiang， Urumqi 830011，" China;

3.Institute of Biotechnology， Xinjiang Academy of Animal

Sciences， Urumqi 830011，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate the potential function of FKBP5 in ovine ovarian granulosa cells （GCs）. GCs were isolated from the ovaries of twenty approximately 2-year-old sexually mature Altay sheep obtained from the Hualing slaughterhouse in Urumqi. The experiment was divided into 4 groups： GC （blank control）， GC+NC （transfected with siRNA-NC）， GC+siFKBP5 （transfected with siRNA-FKBP5）， and GC+siFKBP5+LH （treated with luteinizing hormone and transfected with siRNA-FKBP5）. Immunofluorescence was used to detect the localization of FKBP5 protein in GCs. Its effects on cell proliferation and apoptosis were examined using EdU， Tunel assays， and Western Blot analysis. Its impacts on the AKT and ERK signaling pathways were assessed by Western blot， while the levels of E2 and P4 were measured by ELISA. FKBP5 was found to be expressed in the cytoplasm of GCs. Its expression increased with the increasing concentration of LH， reaching a peak at 5 IU·mL-1 LH after 4 h of treatment （Plt;0.001）. Knockdown of FKBP5 significantly inhibited cell proliferation， as evidenced by a reduction in PCNA protein expression （Plt;0.001）. It also significantly promoted cell apoptosis， with an increase in BAX expression and a decrease in Bcl-2 expression （Plt;0.001）. Additionally， FKBP5 knockdown markedly suppressed the activation of the AKT and ERK signaling pathways and the secretion of E2 and P4 （Plt;0.001）. LH treatment partially mitigated the effects of FKBP5 knockdown on GCs （Plt;0.05）. The results indicate that FKBP5 influences the proliferation and apoptosis of ovine GCs， as well as the activation of the AKT and ERK signaling pathways and the secretion of E2 and P4. Its function is modulated by LH. These findings provide a theoretical basis for further research on the role of FKBP5 in ovine follicular development.

Key words： FKBP5; granulosa cells; cell proliferation and apoptosis; AKT and ERK signaling pathways; steroids

*Corresponding authors：LIN Jiapeng， E-mail：linjiapeng5188@163.com;HUANG" Juncheng，E-mail：h_jc@sina.com

哺乳動物的卵巢被單層扁平或長方體細胞覆蓋，卵巢間質(zhì)可細分為皮層和髓質(zhì)，卵泡位于皮層［1］。卵泡是卵巢的基本功能單位，由一層或幾層體細胞包圍的卵母細胞組成，包括顆粒細胞（GCs）和膜細胞（TCs），GCs在卵泡發(fā)育的每一階段都發(fā)揮了不同的功能［2］。

FK506結(jié)合蛋白5（FKBP5）是免疫親和蛋白家族的一員，參與多種生物過程，包括免疫調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)折疊和轉(zhuǎn)運［3-5］。FKBP5作為糖皮質(zhì)激素受體（GR）的共同伴侶，同時還與Hsp90一起參與GR功能的調(diào)節(jié)［6-8］，是一個調(diào)節(jié)類固醇激素的分子標記［9］。另外，人FKBP5基因的多個SNPs位點及其甲基化與應激反應、抑郁癥、焦慮癥和多囊卵巢綜合征均存在相關性，表明FKBP5可能是參與應激反應的一個關鍵基因［10-16］。此外，F(xiàn)KBP5在肌肉和脂肪組織中高表達，并且人FKBP5與2型糖尿病以及胰島素抵抗和肥胖的標志物相關［17-19］。Hu等［20］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5基因在不同天數(shù)番鴨的胚胎組織中高表達，而關聯(lián)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP5基因的3個SNPs位點與番鴨體重相關，說明FKBP5可作為番鴨早期標記輔助選擇肌肉發(fā)育性狀的分子標記。但FKBP5基因?qū)d羊GCs的增殖和凋亡、分子功能等生物學過程的調(diào)節(jié)機制還不清楚。

近年來，F(xiàn)KBP5基因在牛和羊等家畜中的研究逐漸引起關注。在牛中，研究表明FKBP5與類固醇激素的調(diào)節(jié)密切相關，這對牛的生殖健康有重要影響。具體而言，F(xiàn)KBP5在牛的生殖組織中表達，并可能通過調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體功能影響卵巢功能［21］。在一項FKBP5基因在牛不同生殖階段（如卵泡期和黃體期）中表達變化的研究中，進一步發(fā)現(xiàn)其在牛生殖中有著重要作用［22］。在羊中，F(xiàn)KBP5基因的研究同樣顯示出其在生殖健康中的潛在作用。研究表明，F(xiàn)KBP5基因在綿羊卵巢顆粒細胞中的表達受到促黃體生成素（LH）的調(diào)節(jié)，這表明FKBP5可能通過LH途徑參與調(diào)控卵巢功能［23-24］。此外，F(xiàn)KBP5還可能通過調(diào)控GCs的增殖和凋亡過程，對卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響［25］。在家畜中，F(xiàn)KBP5基因的研究不僅限于其在卵巢中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP5在牛和羊的其他組織（如肌肉和脂肪）中也有高表達，并與這些組織的生長和發(fā)育有關。例如，F(xiàn)KBP5在牛的肌肉組織中表達，與肌肉的生長和分化相關，可能成為提高肉牛生產(chǎn)性能的分子標記［26］。

本研究以體外培養(yǎng)的阿勒泰羊卵巢GCs為研究對象，檢測FKBP5在GCs中的表達及細胞定位情況，探討LH誘導綿羊GCs中FKBP5基因表達的分子調(diào)控機制，揭示FKBP5對GCs增殖、凋亡以及對其分子功能的影響，為進一步研究FKBP5在綿羊卵巢GCs中的功能作用奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用樣本采自烏魯木齊市華凌屠宰場的阿勒泰羊卵巢。試驗羊為健康成年母羊，年齡在2歲左右，處于性成熟階段，體重在45～50 kg之間。將采集的20個卵巢置于裝有37℃生理鹽水的保溫杯內(nèi)，確保在3 h內(nèi)送回實驗室，以保證卵巢樣本的新鮮度和活性。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑（Trizol）、反轉(zhuǎn)錄試劑（2×RT OR-EasyTM MIX）和定量試劑（SYBR Pre mix Ex TaTMII）均購自成都福際；黃體生成素（LH）購自三生制藥；FKBP5、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、PCNA、β-actin和特異性二抗購自武漢愛博泰克生物科技；EDU試劑盒、Tunel試劑盒和BCA試劑盒均購自碧云天生物技術；預染蛋白Marker和DNA Marker購自全式基因；E2和P4 ELISA試劑盒購自Bioswamp武漢貝茵萊生物科技；脂質(zhì)體2000購自Invitrogen。

1.3 GCs分離及培養(yǎng)

用小鑷子從綿羊卵巢中剝下完整卵泡，置于生理鹽水內(nèi)。用兩個干凈的小鑷子將卵泡撕開，釋放GCs，并在體視顯微鏡下?lián)斐雎亚?卵母細胞復合體，收集GCs。將細胞收集后保存于液氮中，用于細胞試驗。

當GCs達到60%～70%匯合度時，用無血清DMEM/F12替換培養(yǎng)基培養(yǎng)進行以下處理：1）添加不同濃度LH（0、1、5、10 IU·mL-1）培養(yǎng)24 h收集細胞。2）依據(jù)上一步驟結(jié)果，在添加LH（5" IU·mL-1）后不同培養(yǎng)時間（0 h、2 h、4 h、8 h、24 h）收集細胞。3）將si-NC、si-FKBP5轉(zhuǎn)染入GCs，添加/不添加LH后收集細胞。

1.4 免疫熒光檢測細胞的定位

GCs培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，4℃固定。加入0.25% TritonX-100，室溫封閉10 min。1×PBS清洗，加入封閉液封閉1 h。加入FKBP5抗體（1∶300），4℃過夜孵育，1×PBS清洗，加入二抗（1∶100），避光孵育1 h，加入DAPI溶液（1 μg·μL-1），室溫避光孵育3 min。使用熒光顯微鏡進行觀察。

1.5 FKBP5的siRNA的設計、合成與轉(zhuǎn)染

1.5.1 siRNA的設計、合成

根據(jù)FKBP5基因CDS區(qū)序列，由上海吉瑪公司設計并合成3個FKBP5干擾RNA；分別為si-416、si-1023、si-1523及對照si-NC，序列見表1。

1.5.2 siRNA的轉(zhuǎn)染

將siRNA-FKBP5（si-416、si-1023、si-1523）和siRNA-NC分別用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染到GCs中。將GCs置于6孔板中過夜培養(yǎng)（每孔0.5×106），并與LH孵育。

1.6 Real time-qPCR法

所用的定量引物見表2；以綿羊cDNA為模板，綿羊β-actin為內(nèi)參進行Real time-qPCR。反應體系（20 μL）：10 μL SYBR Pre mix Ex TaTMII、0.8 μL引物、2 μL cDNA和7.2 μL無RNase水。反應條件：95℃預變性10 min；然后95℃ 10 s，引物特異Tm 30 s，58℃ 30 s，循環(huán)40次。熔解曲線分析：95℃ 15 s，60℃ 1 min，然后從55℃緩慢遞增到95 ℃。根據(jù)閾值循環(huán)（CT）值計算各基因相對于內(nèi)參基因β-actin的表達量。每組重復3次。

1.7 Western blot（WB）檢測

細胞樣本中加入1 mL蛋白裂解液和1%蛋白酶抑制劑，充分勻漿后4℃離心。收集沉淀加入蛋白上樣Buffer，煮沸10min，收集總蛋白。用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將等量的蛋白質(zhì)于SDS-PAGE凝膠上分離，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含有5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h。洗脫封閉液，4℃下一抗孵育膜12 h，洗3次。室溫下二抗孵育2 h，洗3次。用ECL顯影液（A液∶B液=1∶1）顯影，通過GE6100系統(tǒng)檢測化學發(fā)光，利用ImageJ軟件分析蛋白灰度值。

1.8 細胞增殖（EdU）法檢測

將2×105個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)過夜，將37℃預熱的EdU工作液加入6孔板中孵育細胞2 h。EdU標記細胞完成后，去除培養(yǎng)液，并加入1 mL固定液，室溫固定15 min。去除固定液，洗滌液洗滌細胞3次，每孔加入通透液，室溫孵育10 min，去除通透液，洗滌液洗滌細胞。每孔加入0.5 mL Click反應液，輕輕搖晃培養(yǎng)板以確保反應混合物可以均勻覆蓋樣品。室溫避光孵育30 min。吸除Click反應液，用洗滌液洗滌。在熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.9 細胞凋亡（Tunel）法檢測

將固定的細胞取出，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5 min。加入100 μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。1×PBS清洗，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.10 ELISA檢測

將2×104個細胞接種于96孔板中培養(yǎng)過夜，ELISA檢測上清中E2和P4的含量。設置標準品孔、空白孔和樣品孔，標準品孔中加不同濃度的標準品。樣本孔中加待測樣本，辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體，用錫箔紙蓋住，37℃水浴鍋或恒溫培養(yǎng)箱中孵育60 min。每孔加滿洗滌液進行沖洗，拍干。每孔加底物A、B，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。每孔加入終止液終止反應。通過酶標儀450 nm波長檢測吸光度（OD）值。

1.11 統(tǒng)計分析

每個試驗均為3個獨立的樣本，并重復3次。組間差異通過T檢驗和ANOVA多重比較法進行檢驗，所有數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準差（mean±SD）”表示。用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)顯著性水平。Plt;0.05為統(tǒng)計學差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 綿羊卵巢GCs中FKBP5的亞細胞定位

通過免疫熒光染色鑒定卵巢GCs中FKBP5的亞細胞定位情況。免疫熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，大部分FKBP5在綿羊GCs的細胞質(zhì)中表達，如圖1所示。

2.2 干擾效率驗證

為了研究FKBP5的表達調(diào)控，轉(zhuǎn)染了不同的干擾FKBP5小分子，并分別采用RT-qPCR和WB技術檢測卵巢GCs中FKBP5的mRNA和蛋白水平。結(jié)果表明，與對照組相比，si-416顯著降低了卵巢GCs中FKBP5的mRNA（圖2A）和蛋白（圖2B）表達水平（Plt;0.01）。

2.3 LH對綿羊卵巢GCs中FKBP5表達調(diào)控

進一步的研究通過RT-qPCR和WB檢測了LH孵育卵巢GCs后FKBP5的mRNA和蛋白表達情況。結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP5的mRNA（圖3A）和蛋白（圖3B）水平隨著LH濃度的增加而逐漸增加。在不同時間（0、2、4、8和24 h）用5 IU·mL-1的LH孵育卵巢GCs，發(fā)現(xiàn)LH在作用4 h時顯著促進了FKBP5的mRNA（圖3C）和蛋白（圖3D）的表達（Plt;0.01）。

為了進一步驗證LH對FKBP5表達的影響，將si-NC和si-FKBP5轉(zhuǎn)染入卵巢GCs，并進行RT-qPCR和WB檢測。結(jié)果顯示，與單獨轉(zhuǎn)染卵巢GCs和GCs+si-FKBP5相比，GCs+si-FKBP5+LH組能夠顯著提高FKBP5的mRNA（圖3E）和蛋白（圖3F）表達（Plt;0.05）。

2.4 FKBP5對綿羊卵巢GCs功能的影響

通過EdU法檢測FKBP5對細胞增殖的影響，結(jié)果見圖4A，干擾FKBP5顯著抑制了GCs的增殖，而GCs+si-FKBP5+LH組的細胞增殖有所提高。WB檢測結(jié)果顯示，細胞增殖相關蛋白PCNA在干擾FKBP5后表達顯著降低，而GCs+si-FKBP5+LH組顯著提高了干擾FKBP5所抑制的細胞增殖水平（Plt;0.001），如圖4B所示。

用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，干擾FKBP5顯著促進了GCs的凋亡，而GCs+si-FKBP5+LH組的細胞凋亡減少（圖4C）。WB檢測結(jié)果顯示，干擾FKBP5顯著促進了凋亡相關蛋白BAX的表達，并顯著抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表達；而與GCs+si-FKBP5組相比，GCs+si-FKBP5+LH組顯著促進了Bcl-2的表達（Plt;0.01），如圖4D所示。

2.5 FKBP5對綿羊GCs分子功能的影響

通過WB檢測AKT和ERK信號通路的結(jié)果顯示，si-FKBP5轉(zhuǎn)染GCs顯著抑制了p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達，而LH刺激si-FKBP5轉(zhuǎn)染的GCs能夠部分恢復p-AKT和p-ERK1/2的蛋白表達（Plt;0.001），如圖5A所示。通過ELISA法檢測培養(yǎng)液中雌二醇（E2）和孕酮（P4）的蛋白濃度，結(jié)果顯示，干擾FKBP5顯著降低了E2和P4的水平，而LH刺激si-FKBP5轉(zhuǎn)染的GCs中E2和P4水平增加（Plt;0.05），如圖5B所示。

3 討 論

本研究在綿羊GCs中鑒定了FKBP5的亞細胞定位，并探討了LH對其表達的影響，以及FKBP5對GCs功能的作用。FKBP5在人類優(yōu)勢卵泡GCs中的表達，在排卵后期和排卵后卵泡中表達最強烈［27-29］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP5主要在綿羊GCs的細胞質(zhì)中表達。通過免疫熒光染色，確認了FKBP5在GCs中的特定定位，為進一步探索其在卵巢生理過程中的角色提供了基礎。

卵巢卵泡發(fā)育伴隨著顆粒細胞分化［30］。排卵前LH激增觸發(fā)多個細胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活，調(diào)節(jié)排卵所需基因的表達［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，LH能夠顯著提升FKBP5的mRNA和蛋白水平，表明LH通過調(diào)節(jié)FKBP5的表達參與GCs的功能調(diào)控。特別是在LH濃度為5 IU·mL-1時，對GCs孵育4 h后，F(xiàn)KBP5的表達水平顯著增加，提示FKBP5可能參與由LH引起的快速信號傳導過程。Ma等［32］通過meta分析發(fā)現(xiàn)，在FecB突變型綿羊的卵泡期，F(xiàn)KBP5基因在下丘腦中上調(diào)，可能直接或間接參與調(diào)節(jié)促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，而下丘腦分泌GnRH通常被認為是啟動和整合雌性生殖功能的主要途徑，暗示FKBP5基因可能與FecB突變引起的綿羊多排卵有關。

卵泡發(fā)育與GCs增殖和凋亡密切相關。EdU結(jié)果顯示，干擾FKBP5顯著降低了GCs增殖。同時，干擾FKBP5顯著降低了PCNA的表達。通過TUNEL法檢測了干擾FKBP5后綿羊GCs凋亡的情況，結(jié)果顯示，干擾FKBP5促進了細胞凋亡。另外，干擾FKBP5顯著提高了凋亡相關基因BAX的表達水平。通過以上結(jié)果，可初步推測FKBP5對于綿羊GCs的增殖具有促進作用，并受到LH的影響。

進一步分析表明，F(xiàn)KBP5干擾影響了AKT和ERK信號通路的活性。LH的刺激能夠部分恢復p-AKT和p-ERK1/2的表達水平，表明FKBP5可能通過這些信號通路參與LH調(diào)節(jié)的生物學過程。LH是卵母細胞成熟、排卵和黃體功能所必需的，在不同動物的GCs中已經(jīng)證實了對ERK信號通路的激活作用［33-34］。進一步的研究表明，依賴于LH的ERK信號通路激活發(fā)生在cAMP的下游，并依賴于PKA的激活［32］。ERK1/2活性信號級聯(lián)反應參與卵泡發(fā)育和排卵，與顆粒細胞功能（包括卵巢激素產(chǎn)生）密切相關，并影響GCs的增殖和存活［35-36］。AKT途徑的激活伴隨著GCs增殖的增加，并參與孕酮合成的調(diào)節(jié)［37-38］。上述結(jié)果提示，F(xiàn)KBP5可能通過AKT和ERK信號通路促進GCs增殖。

此外，還研究了FKBP5對卵巢激素合成的影響。干擾FKBP5顯著降低了培養(yǎng)液中的E2和P4水平，而LH刺激可以增加這些激素的水平，提示FKBP5可能通過影響激素合成的途徑參與GCs的功能調(diào)節(jié)。作為E2的主要來源，卵泡內(nèi)的GCs受到多種分子的復雜調(diào)控。在卵泡生長的早期階段，發(fā)育中的卵泡合成類固醇激素依賴于幾個關鍵蛋白質(zhì)的存在和活性，如類固醇生成因子1、類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白、細胞色素P450側(cè)鏈裂解酶、細胞色素P450羥化酶、3β-羥基固醇脫氫酶和細胞色素P450芳香化酶等［39-40］。在牛的研究中發(fā)現(xiàn)，排卵前LH/hCG的激增刺激了P4分泌，并促進FKBP5基因的表達，而LH/hCG激增后牛GCs中FKBP5表達的增加可能代表了一個短暫的負反饋環(huán)，參與了減弱GCs對孕酮的反應性［31］。這一結(jié)果與本研究結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，干擾FKBP5后，GCs分泌的P4水平顯著降低。

本研究揭示了FKBP5在綿羊卵巢GCs中的表達模式和功能，以及LH如何通過調(diào)節(jié)FKBP5的表達影響GCs的增殖、凋亡和激素合成。這些發(fā)現(xiàn)為理解卵巢生理學以及治療相關疾病提供了新的見解。未來的研究可以進一步探索FKBP5在其他生殖細胞類型中的作用，以及其在卵巢發(fā)育和功能障礙中的潛在作用。

4 結(jié) 論

綜上所述，F(xiàn)KBP5在綿羊卵巢顆粒細胞中具有重要的生理功能，其表達受LH調(diào)控，干擾FKBP5能夠抑制GCs的增殖，促進凋亡，并通過AKT和ERK信號通路及E2和P4的調(diào)控發(fā)揮作用。LH能夠部分逆轉(zhuǎn)干擾FKBP5的負面效應。這些發(fā)現(xiàn)為進一步理解FKBP5在卵巢功能中的作用提供了新的視角。

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（編輯 郭云雁）