摘 要： 旨在評(píng)估臨床分離的豬鏈球菌血清2、3、9型強(qiáng)毒株制備的三價(jià)滅活疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)效果。使用大蠟螟幼蟲感染模型和小鼠感染模型，從臨床分離的豬鏈球菌中篩選出血清2、3和9型強(qiáng)毒株各1株（SS1803、SS1803024、SS1696），檢測(cè)其生長(zhǎng)曲線和毒力因子。將菌株分別滅活及混合滅活后與佐劑混合，用4×107 CFU、8×107 CFU SS1803、2×108 CFU、5×108 CFU SS1803024、1×108 CFU、5×108 CFU SS1696及三價(jià)滅活苗（2×107 CFU SS1803+1.5×108 CFU SS1803024+3×107 CFU SS1696）分別對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行兩輪免疫，采集血清檢測(cè)特異性抗體水平，分別用3種菌株致死劑量攻毒后觀察小鼠免疫保護(hù)率，同時(shí)用亞致死劑量攻毒三價(jià)苗免疫組，測(cè)定小鼠血、腦、肺、脾的組織載菌量和細(xì)胞因子IL-6、IL-12水平，并觀察腦、肺、脾、腎中的組織病理變化。結(jié)果顯示：3株疫苗候選菌株的毒力基因鑒定分別為SS1803： gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf+， SS1803024： gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-， SS1696： gapdh+/sly-/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-。單價(jià)和三價(jià)疫苗免疫組均能產(chǎn)生對(duì)應(yīng)免疫血清型的IgG抗體，以產(chǎn)生IgG1型抗體為主。三價(jià)疫苗免疫組能對(duì)2、3、9型3個(gè)菌株攻毒分別提供83.3％、66.7％和66.7％的保護(hù)率，能顯著降低感染后小鼠組織中的載菌量，降低血清炎性因子水平和組織病變程度。本研究篩選臨床流行率高的2、3、9型強(qiáng)毒株，聯(lián)合制備三價(jià)滅活疫苗，能夠?qū)π∈筇峁┝己玫拿庖弑Ｗo(hù)力，為豬鏈球菌多價(jià)疫苗的研發(fā)提供新的材料。

關(guān)鍵詞： 豬鏈球菌；疫苗候選菌株；三價(jià)滅活疫苗；免疫保護(hù)效果

中圖分類號(hào)： S852.611

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4077-14

Screening of Trivalent Inactivated Vaccine Candidate Strains of Streptococcus suis

Serotype 2， 3 and 9 Using Galleria mellonella and Mice Infection Models

PENG" Lu， ZHANG" Heng， PANG" Siqi， QIAO" Zhulin， ZHANG" Xiaofen， TAN" Chen，

SONG" Yunfeng， ZHOU" Rui， LI" Lu*

（National Key Laboratory of Agricultural Microbiology，The Cooperative Innovation Center

for Sustainable Pig Production Co-sponsored by Province and Ministry，College of

Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：" The aim was to evaluate the immune protective effect of a trivalent inactivated vaccine prepared from virulent strains of clinically isolated Streptococcus suis serotype 2， 3 and 9 on mice. One virulent strain each of S. suis serotype 2， 3 and 9 were screened from clinical isolates using Galleria mellonella and mice infection models（SS1803， SS1803024， SS1696）， and the growth curves and virulence genes were tested. The strains were separately inactivated and mixed inactivated and mixed with adjuvants. 4×107 CFU， 8×107 CFU SS1803， 2×108 CFU， 5×108 CFU SS1803024， 1×108 CFU， 5×108 CFU SS1696， and trivalent inactivated vaccine （2×107 CFU SS1803+1.5×108 CFU SS1803024+3×107 CFU SS1696） were used to immune the BALB/c mice in two rounds， serum was collected to detect the levels of specific antibodies and the immune protection rates of the mice were observed after challenge with lethal doses of the three strains respectively. Then， a sub-lethal dose were used to challenge the trivalent immunized group， the bacterial loads in blood， brain， lung and spleen and the levels of cytokines IL-6 and IL-12 of mice were measured， and the histopathological changes in brain， lung， spleen and kidney were also observed. The virulence genes of the three vaccine candidate strains were identified as： SS1803： gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf+， SS1803024： gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-， SS1696： gapdh+/sly-/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-. Both monovalent and trivalent vaccine immune groups induced IgG antibodies corresponding to the immunized serotypes， with the production of IgG1 antibodies predominating. The trivalent group provided 83.3%， 66.7% and 66.7% protection against serotype 2， 3 and 9 strains， respectively. It also effectively reduced the bacterial loads in the tissues， and reduced the levels of serum inflammatory factors and the degree of tissue lesions of mice after infection. In this study， highly virulent strains of serotype 2， 3 and 9 with high clinical prevalence were screened. Trivalent inactivated vaccine were prepared， which provided good immune protection in mice challenge model. These studies provided new materials for the development of multivalent vaccine of Streptococcus suis.

Key words： Streptococcus suis; vaccine candidate strains; trivalent inactivated vaccine; immune protective effect

*Corresponding author：LI Lu， E-mail： lilu@mail.hzau.edu.cn

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種兼性厭氧性革蘭陽(yáng)性菌，屬于鏈球菌科，常呈鏈狀形態(tài)。該菌多含有莢膜，但無芽胞，無運(yùn)動(dòng)性，菌落呈透明色［1-2］。豬鏈球菌根據(jù)對(duì)莢膜多糖（CPS）的血清學(xué)反應(yīng)可分為29個(gè)血清型，同時(shí)存在較多的無法分型菌株［3-4］。不同地區(qū)的豬鏈球菌優(yōu)勢(shì)血清型存在差異，在南美洲和北美洲地區(qū)，主要存在的血清型中均包括1/2、2和3型，歐洲國(guó)家主要血清型分布為2、4、7、9型，在亞洲地區(qū)流行最廣的是2、3、4型［5-6］。國(guó)內(nèi)相關(guān)的流調(diào)結(jié)果顯示檢出率最高為血清2型、其次以血清3、7、9型為主［7-10］。而不同省份的檢出率也有所不同，例如王治方等［11］在河南地區(qū)分離到68株豬鏈球菌，其中2和9型占比最高，分別為70%和22%。劉琪等［12］發(fā)現(xiàn)廣東地區(qū)病豬上2和3型檢出率較高。在四川地區(qū)分離出的32株豬鏈球菌中，16型占比最高，其次為2和9型［13］。因此除2型外，3和9型在我國(guó)的豬鏈球菌檢出率中占有較高的比例。豬鏈球菌攜帶的毒力因子包括莢膜多糖（CPS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、豬鏈球菌溶血素（SLY）、纖連蛋白結(jié)合蛋白（FBP）、ORF2、溶菌酶釋放蛋白（MRP）、胞外蛋白因子（EPF）、89K毒力島、谷氨酸脫氫酶（GDH）等，不同血清型攜帶的毒力基因可能不同，這些毒力因子可能在豬鏈球菌感染的發(fā)病機(jī)制發(fā)揮著重要作用［14-17］。

滅活疫苗是指在物理、化學(xué)等方式下，對(duì)病原微生物進(jìn)行滅活脫毒，然后加入佐劑制成的疫苗。目前臨床上使用的滅活苗主要以商品化滅活苗為主，也有少數(shù)的豬場(chǎng)嘗試制備并使用自家苗［18］。段倩倩等［19］把分離到的兩株SS 2型強(qiáng)毒株分別制備成疫苗后與SS 2型商品化疫苗進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)均能為小鼠提供針對(duì)2型強(qiáng)毒株的100%保護(hù)率。李倩倩等［20］制備的3+9型二價(jià)苗免疫小鼠后能為小鼠分別提供針對(duì)SS 3型和SS 9型的80%和70%保護(hù)率，但對(duì)SS2提供的交叉保護(hù)力微弱。目前，國(guó)內(nèi)的商品化滅活疫苗針對(duì)SS的血清2和7型。我國(guó)豬鏈球菌流行率最高的仍然是血清2型，但除此之外3和9型也較為流行，致病性也較強(qiáng)，而尚未有能同時(shí)針對(duì)豬鏈球菌2、3、9型的商品化疫苗。

前期本實(shí)驗(yàn)室已從近年的臨床分離菌株中鑒定出了1株豬鏈球菌血清2型強(qiáng)毒株，本研究從臨床分離的豬鏈球菌3和9型菌株中，通過大蠟螟和小鼠模型各篩選出1株強(qiáng)毒株作為疫苗候選菌株，聯(lián)合制備成豬鏈球菌三價(jià)滅活疫苗，并利用BALB/c小鼠模型對(duì)該疫苗進(jìn)行了免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)，以期為豬鏈球菌多價(jià)疫苗的生產(chǎn)研發(fā)提供新的材料。

1 材料與方法

1. 1 菌株、引物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

豬鏈球菌臨床菌株由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存，包括2型臨床菌株1株，3型臨床菌株12株和9型臨床菌株16株；大蠟螟幼蟲購(gòu)自武漢維物起源生物科技有限公司；6周齡BALB/c雌鼠和4周齡KM雌鼠購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。試驗(yàn)使用的引物序列見表1。

1.2 試劑

THB培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司；2×Taq Mixture購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DL 5 000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；羊抗鼠IgG HRP酶標(biāo)二抗購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；小鼠IL-6、IL-12 ELISA Kit檢測(cè)試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。

1.3 臨床分離株血清型鑒定

豬鏈球菌2、3和9型分型檢測(cè)片段的靶基因分別是cps2I、cps3L和cps9J，PCR引物見表1，產(chǎn)物大小分別為363、210和409 bp。

1.4 強(qiáng)毒株篩選

將320只0.4～0.5 g大蠟螟幼蟲隨機(jī)分成32組，每組10只，其中12組注射血清3型臨床分離菌株，16組注射豬鏈球菌血清9型臨床分離菌株，并設(shè)置生理鹽水組和空白對(duì)照組，每次攻毒劑量為0.1×106～6.0×106 CFU·只-1，注射部位為大蠟螟尾足，每只注射25 μL，攻毒后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，24 h后記錄大蠟螟的死亡情況。該大蠟螟攻毒試驗(yàn)重復(fù)兩次。選取兩次死亡率都較高的菌株進(jìn)行復(fù)篩，將48只4周齡KM雌鼠隨機(jī)分成8組，每組6只，其中3組感染初篩的血清3型菌株，劑量為1.5×108 CFU·只-1；5組感染初篩的血清9型菌株，劑量為5×107 CFU·只-1，連續(xù)觀察7 d，觀察臨床癥狀并統(tǒng)計(jì)死亡率，選取小鼠致死率最高的菌株作為疫苗候選菌株。

1.5 生長(zhǎng)特性及毒力因子檢測(cè)

檢測(cè)篩選到的3種不同血清型高毒力菌株的生長(zhǎng)曲線，分別在0、2、4、6、8、10和12 h取出100 μL菌液測(cè)OD600 nm值，并進(jìn)行稀釋計(jì)數(shù)。利用表1中相對(duì)應(yīng)的引物，對(duì)epf、sly、mrp、fbps、gapdh、orf2、gdh和89K毒力島進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)這3株菌的毒力基因攜帶情況。

1.6 菌株LD50測(cè)定

將128只6周齡BALB/c雌鼠隨機(jī)分成16組，每組8只。2型菌SS1803選用2.0×108、1.0×108、5.0×107、2.5×107、和1.3×107 CFU 5個(gè)劑量感染；3型菌SS1803024選用3.0×108、1.5×108、7.5×107、3.8×107和1.9×107 CFU 5個(gè)劑量感染；9型菌SS1696選用1.0×108、5.0×107、2.5×107、1.3×107和6.5×106 CFU 5個(gè)劑量感染，同時(shí)設(shè)置生理鹽水對(duì)照組，采用腹腔注射，感染后觀察7 d，統(tǒng)計(jì)死亡率，根據(jù)改進(jìn)寇氏法計(jì)算LD50，計(jì)算公式為L(zhǎng)D50=lg－1［Xm－i（∑P－0.5）］（Xm—最大劑量的對(duì)數(shù)；i—組間距相鄰兩組對(duì)數(shù)劑量的差值；P—各組動(dòng)物的死亡率；∑P—各組動(dòng)物死亡率的總和）。

1.7 疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

1.7.1 動(dòng)物分組與免疫

將SS1803、SS1803024和SS1696培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，按總體積加入0.3%～0.4%的甲醛溶液，置于37 ℃，180 r·min-1搖床中充分滅活。每隔6 h取菌液進(jìn)行TSA平板劃線和THB液體培養(yǎng)，從而確定是否完全滅活。滅活后菌液在4 ℃，8 000 r·min-1離心10 min獲得菌體，并用PBS清洗5遍，以去除殘留的甲醛溶液，并根據(jù)試驗(yàn)設(shè)定的免疫劑量，用PBS調(diào)整濃度，與Summit Poly Solution佐劑4∶1配比，制成所需滅活疫苗。將72只6周齡BALB/c雌鼠隨機(jī)分組，具體分組見表2，每只小鼠注射200 μL，首免后14 d進(jìn)行二免，二免14 d后進(jìn)行攻毒，并分別在二免前和攻毒前一天采集小鼠血清備用，攻毒后計(jì)算各組小鼠的免疫保護(hù)率。

1.7.2 抗體水平檢測(cè)

制備SS1803、SS1803024和SS1696全菌蛋白并用抗原包被液稀釋至10 μg·mL-1進(jìn)行包被，每孔100 μL，4 ℃包被過夜，加200 μL PBST清洗3次；每孔加入300 μL 50g·L-1脫脂乳37 ℃封閉2 h，加200 μL PBST清洗3次；血清樣品用PBST稀釋160倍后每孔加入100 μL，37 ℃孵育1 h，加200 μL PBST清洗3次；用PBST按1∶3 000稀釋羊抗鼠酶標(biāo)二抗（IgG、IgG1、IgG2a），每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，加200 μL PBST清洗3次；每孔加入100 μL TMB底物顯色液，37 ℃避光顯色20 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630 nm處的吸光度。

1.7.3 組織載菌量檢測(cè)及病理組織切片觀察

使用亞致死劑量感染三價(jià)免疫組和陰性對(duì)照組，攻毒菌株和劑量分別為SS1803（2×107 CFU）、SS1803024（7×107 CFU）、SS1696（8.4×106 CFU），每只小鼠腹腔注射200 μL，在攻毒后12和24 h每組各取6只小鼠，采集血清，剖檢取腦、脾和肺研磨后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。在24 h每組各取6只小鼠，剖檢取腦、肺、脾和腎放入4%多聚甲醛組織固定液中，固定24 h后，制作組織切片并在顯微鏡下觀察。

1.7.4 感染后細(xì)胞因子檢測(cè)

根據(jù)細(xì)胞因子ELISA檢測(cè)試劑盒說明書，檢測(cè)感染后小鼠血清中的白細(xì)胞介素6（interleukin-6， IL-6）和白細(xì)胞介素12（interleukin-12， IL-12）的含量。

1.8 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于文中所有定量分析，均使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Plt;0.05的值為具有顯著差異（*.Plt;0.05；**.Plt;0.01；***.Plt;0.001），P＞0.05的值為不具有顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 菌株血清型鑒定

血清2型的臨床菌株SS1803為前期實(shí)驗(yàn)室研究鑒定。從臨床分離的豬鏈球菌中，利用血清3型特異性基因cps3L和9型特異性基因cps9J的引物共鑒定到豬鏈球菌血清3型菌株12株，9型菌株16株。

2.2 不同血清型菌株的毒力鑒定

小鼠毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，2型菌株SS1803不同劑量攻毒后，小鼠均在2 d內(nèi)死亡（圖1 A）。大蠟螟模型初篩選出兩輪毒力試驗(yàn)平均致死率為70%及以上的菌株，篩選出3株3型菌株（SS1761、SS1804125、SS1803024）和5株9型菌株（SS1807065、SS1805031、SS1804104、SS1696和SS1807035）（表3）。小鼠模型毒力鑒定結(jié)果顯示，3型菌株SS1803024和血清9型菌株SS1696致死率最高，因此選擇這兩株菌用于后續(xù)疫苗評(píng)價(jià)（圖1 B、C）。

2.3 3株候選菌株的生長(zhǎng)特性和毒力因子鑒定

3株菌均在2～4 h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在10～12 h左右進(jìn)入衰亡期。使用8種毒力基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖2，3株菌的毒力基因型不完全相同，SS1803毒力基因型為gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf+，SS1803024毒力基因型為gapdh+/sly+/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-，SS1696毒力基因型為gapdh+/sly-/fbps+/orf2+/mrp-/89K-/gdh+/epf-。

2.4 3株候選菌株的LD50檢測(cè)

利用改良寇氏計(jì)算法得出SS1803、SS10803024和SS1696對(duì)BALB/c小鼠的LD50分別為3.2×107 CFU、8.9×107 CFU和1.1×107 CFU。

2.5 疫苗免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

2.5.1 血清IgG、IgG1、IgG2a亞型抗體水平測(cè)定結(jié)果

二免后14 d，所有單價(jià)苗都誘導(dǎo)了針對(duì)各自免疫菌株的IgG抗體，且抗體水平都顯著性高于陰性對(duì)照組（Plt;0.000 1）。三價(jià)苗產(chǎn)生的針對(duì)SS1803、SS1803024和SS1696的IgG抗體水平都顯著高于陰性對(duì)照組（Plt;0.0001）（圖3）。同時(shí)檢測(cè)了二免后血清中的IgG1、IgG2a亞型抗體水平（圖4），除了2×108 CFU SS1803024免疫組IgG1和IgG2a比較結(jié)果不顯著外，其他免疫組的IgG1抗體水平均顯著高于IgG2a抗體水平（Plt;0.05），說明單價(jià)和三價(jià)滅活苗在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)均以體液免疫為主。

2.5.2 免疫保護(hù)率測(cè)定結(jié)果

二免后14 d進(jìn)行攻毒，結(jié)果顯示，4×107 CFU、8×107 CFU SS1803免疫組、三價(jià)苗免疫組和陰性對(duì)照組在用SS1803攻毒后存活率分別為83.3％、100.0％、83.3％和0.0；2×108 CFU、5×108 CFU SS1803024免疫組、三價(jià)苗免疫組和陰性對(duì)照組在用SS1803024攻毒后存活率分別為50.0％、50.0％、66.7％和0.0；1×108 CFU、5×108 CFU SS1696免疫組、三價(jià)苗免疫組和陰性對(duì)照組在用SS1696攻毒后存活率分別為66.7％、33.3％、66.7％和0.0（圖5）。綜上，三價(jià)苗針對(duì)SS1803、SS1803024和SS1696的攻毒為小鼠分別提供了83.3％、66.7％和66.7％的保護(hù)率，說明三價(jià)苗能夠能夠?qū)Ξ愒淳晏峁┝己玫慕徊姹Ｗo(hù)效果。

2.5.3 組織載菌量測(cè)定結(jié)果

分別用亞致死劑量的SS1803、SS1803024和SS1696感染三價(jià)苗免疫組和陰性對(duì)照組，在12和24 h每組各取6只小鼠剖檢分別對(duì)血、腦、脾、肺檢測(cè)組織載菌量。結(jié)果見圖6，接種三價(jià)滅活疫苗可以有效減少組織中細(xì)菌含量，并能夠加速細(xì)菌的清除。

2.5.4 攻毒后血清中炎性細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果

測(cè)定亞致死劑量感染后12和24 h三價(jià)疫苗免疫組和對(duì)照組血清中IL-6和IL-12水平。結(jié)果見圖7，除了SS1803攻毒后免疫組和對(duì)照組未檢測(cè)到IL-12，在12 h時(shí)，免疫組的IL-6和IL-12水平均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。

2.5.5 攻毒后病理組織變化結(jié)果

觀察亞致死劑量感染后24 h三價(jià)疫苗免疫組和對(duì)照組小鼠不同器官的病理變化（圖8）。SS1803、SS1803024、SS1696攻毒后24 h，對(duì)照組小鼠腦組織中可見海馬區(qū)局部神經(jīng)元細(xì)胞變性，細(xì)胞核固縮深染；脾組織紅髓內(nèi)可見少量鐵血黃素沉積，多核巨噬細(xì)胞增多；肺組織有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡上皮細(xì)胞增生；腎組織病變輕微，視野內(nèi)腎小球結(jié)構(gòu)異常，皮質(zhì)區(qū)域個(gè)別腎小球萎縮、丟失。免疫組小鼠腦組織中SS1803024、SS1696攻毒的三價(jià)疫苗免疫組可見部分神經(jīng)元細(xì)胞變性，細(xì)胞核固縮深染，其他組無病變；腎組織中SS1696攻毒的三價(jià)疫苗免疫組出現(xiàn)皮質(zhì)區(qū)域個(gè)別腎小球萎縮、丟失，其他組未見明顯病變；所有免疫組脾組織紅髓內(nèi)淋巴細(xì)胞稀少，部分肺泡上皮細(xì)胞輕度增生，肺泡萎縮程度變小。綜上，三價(jià)滅活疫苗接種小鼠后，能有效降低小鼠攻毒后的組織病變程度。

3 討 論

豬鏈球菌血清型多，在全球范圍內(nèi)，血清1、2、7和9型是豬的常見檢出類型，不同地區(qū)又存在一定差異，其中，2型是普遍檢出率最高的血清型。在一些歐洲國(guó)家，血清9型菌株檢出率變高［21］，亞洲地區(qū)2和3型是優(yōu)勢(shì)血清型［5］。豬鏈球菌2、3、7和9型為中國(guó)近年來流行的主要血清型［10，22］。現(xiàn)有的豬鏈球菌病商業(yè)化疫苗主要針對(duì)血清2和7型，且不同血清型直接的交叉免疫保護(hù)效果較差，例如利用2型菌制備的亞單位疫苗缺乏對(duì)血清9型菌株的預(yù)防能力［23］。滅活疫苗研究周期短，價(jià)格便宜，在臨床上有一定的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于目前國(guó)內(nèi)豬鏈球菌血清型流行情況而言，還沒有能同時(shí)針對(duì)血清2、3、9型菌株的疫苗。

本研究首先使用了大蠟螟模型初篩3、9型菌株，這種模型具有成本低，操作簡(jiǎn)單，引發(fā)的倫理問題更少等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在多種病原菌中成功應(yīng)用［24-25］。將篩選到毒力較強(qiáng)的血清2、3、9型的豬鏈球菌臨床菌株，分別制備了單價(jià)和三價(jià)疫苗并在小鼠模型上評(píng)價(jià)其免疫保護(hù)效果。疫苗免疫后IgG抗體水平可以反應(yīng)免疫效果，在抗菌感染方面發(fā)揮著重要作用。在本研究中，單價(jià)苗與多價(jià)苗均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生高于陰性對(duì)照組（Plt;0.000 1）的IgG抗體。IgG1介導(dǎo)Th2型體液免疫反應(yīng)，IgG2a介導(dǎo)Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)［26］。免疫組小鼠血清中IgG1抗體水平高于IgG2a，即2、3、9型單價(jià)疫苗和三價(jià)疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)以體液免疫為主。IL-6在小鼠模型中被確定為內(nèi)毒素激發(fā)后誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)和組織損傷擴(kuò)大的關(guān)鍵標(biāo)志物［27］。IL-12是一種異二聚體促炎細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)干擾素γ（interferon gamma， IFN-γ）的產(chǎn)生，有利于Th1的分化，并在先天抵抗和適應(yīng)性免疫之間形成聯(lián)系［28］。小鼠感染鏈球菌后24 h內(nèi)在體內(nèi)觀察到的高水平的細(xì)胞因子干擾素α（interferon alfa， TNF-α）、IL-6、IL-12和IFN-γ等被認(rèn)為是引起動(dòng)物急性死亡的原因［29］。在用亞致死劑量的SS1803、SS1803024和SS1696對(duì)三價(jià)苗免疫組小鼠和陰性對(duì)照組小鼠攻毒后發(fā)現(xiàn)，三價(jià)苗相比于陰性對(duì)照組，能不同程度地降低小鼠攻毒后的血、腦、肺、脾中的載菌量、血清炎性因子IL-6、IL-12水平和腦、脾、肺、腎組織的病變程度。說明三價(jià)滅活菌苗能夠有效預(yù)防小鼠感染血清2、3、9型的豬鏈球菌，并降低感染后引起的炎癥反應(yīng)。

常用的滅活疫苗有豬鏈球菌病三價(jià)疫苗（SEZ+SS2+SS7）和豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗（LT株+MD0322株+SH0165株）等，李倩倩等［20］制備的3+9型豬鏈球菌二價(jià)滅活疫苗免疫小鼠對(duì)2、3、9型菌株的保護(hù)率分別為30%、80%、70%，而商品化疫苗組（SEZ+SS2+SS7）的保護(hù)率為70%、0、10%，均無法同時(shí)對(duì)2、3、9型菌株的感染產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫保護(hù)效果。崔麗榮等［30］制備的2、3、4型三價(jià)滅活疫苗對(duì)2、3、4型菌株的保護(hù)率均為100%，而商品化疫苗（SEZ+SS2+SS7）的保護(hù)率分別為100%、60%、80%，表明商品化疫苗對(duì)異源菌株3型的保護(hù)效果較弱。用2、3、9型菌株致死劑量攻毒后，三價(jià)苗分別能為小鼠提供83.3％、66.7％和66.7％的保護(hù)率。三價(jià)苗中3型菌SS1803024抗原量低于SS1803024單價(jià)苗，但是三價(jià)苗免疫后小鼠血清中產(chǎn)生針對(duì)SS1803024的IgG抗體和對(duì)小鼠保護(hù)率均高于3型菌單價(jià)苗，可能是三價(jià)苗中的2、9型抗原提供了針對(duì)3型菌感染的交叉免疫保護(hù)力。另外，可以通過優(yōu)化3、9型的抗原劑量來進(jìn)一步提高三價(jià)苗的免疫保護(hù)效果。除部分血清型產(chǎn)生的一些交叉保護(hù)外，新型的載體疫苗在小鼠模型上能夠同時(shí)對(duì)抗多種血清型菌株的感染，如有研究者利用豬霍亂沙門菌作為載體，構(gòu)建了能夠表達(dá)SaoA和Eno的rSC0016（pS-SE），其可在淋巴系統(tǒng)中定殖，能針對(duì)豬鏈球菌血清2、9、7和1/2型菌株產(chǎn)生免疫保護(hù)［31］。也有研究者利用減毒的沙門菌作為載體，構(gòu)建了能夠表達(dá)異源抗原烯醇化酶的重組疫苗株 rSC0016，能同時(shí)對(duì)豬鏈球菌血清2、7、9型感染提供良好的保護(hù)率［32］。但這些疫苗的研究成本較高，研究周期也較長(zhǎng)，在臨床應(yīng)用上可能需要較長(zhǎng)的時(shí)間。疫苗的免疫效力與佐劑的選用也密切相關(guān)［33］，本研究中使用的Summit Poly Solution佐劑屬于水佐劑，有誘導(dǎo)期短和引起長(zhǎng)期的免疫反應(yīng)等優(yōu)勢(shì)，目前在養(yǎng)殖動(dòng)物疫苗中已經(jīng)開始應(yīng)用且商品化，后續(xù)還可通過應(yīng)用一些新型佐劑進(jìn)一步提高疫苗保護(hù)效果［20］。此外，本研究的不足是沒有與商業(yè)化的疫苗進(jìn)行保護(hù)率的比較，只在小鼠模型上進(jìn)行了初步的免疫效果評(píng)價(jià)，有待在豬模型以及臨床實(shí)際中去檢驗(yàn)該疫苗的有效性和安全性。

4 結(jié) 論

本研究利用篩選到的豬鏈球菌血清2、3和9型強(qiáng)毒菌株各1株，分別制備了單價(jià)滅活疫苗和三價(jià)滅活疫苗，免疫小鼠后均能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgG抗體，以IgG1亞型為主，即誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)。

用2、3、9型菌株攻毒后，三價(jià)滅活疫苗分別能為小鼠提供83.3％、66.7％和66.7％的保護(hù)率，還能有效降低感染后小鼠血、腦、肺、脾中的載菌量，降低血清炎性因子IL-6、IL-12水平和腦、脾、肺、腎組織的病變程度。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ OKURA M， OSAKI M， NOMOTO R， et al. Current taxonomical situation of Streptococcus suis［J］. Pathogens， 2016， 5（3）：45.

［2］ FENG Y J， ZHANG H M， WU Z W， et al. Streptococcus suis infection： an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases？［J］. Virulence， 2014， 5（4）：477-497.

［3］ HAAS B， GRENIER D. Understanding the virulence of Streptococcus suis：a veterinary， medical， and economic challenge［J］. Med Mal Infect， 2018， 48（3）：159-166.

［4］ ATHEY T B T， TEATERO S， LACOUTURE S， et al. Determining Streptococcus suis serotype from short-read whole-genome sequencing data［J］. BMC Microbiol， 2016， 16（1）：162.

［5］ GOYETTE-DESJARDINS G， AUGER J P， XU J G， et al. Streptococcus suis， an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing［J］. Emerg Microbes Infect， 2014， 3（6）：e45.

［6］ SEGURA M， ARAGON V， BROCKMEIER S L， et al. Update on Streptococcus suis research and prevention in the era of antimicrobial restriction：4th international workshop on S. suis［J］. Pathogens， 2020， 9（5）：374.

［7］ YANG H H， HUANG J J， HU X T， et al. Comparative genome analysis of Streptococcus suis serotype 9 isolates from China， The Netherland， and the U. K［J］. Life （Basel）， 2021， 11（12）：1324.

［8］ 黃曉慧， 韓雪姣， 劉雪蘭， 等. 199株豬鏈球菌臨床分離株血清型、毒力基因及多位點(diǎn)序列分型分析［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2022， 49（10）：4209-4223.

HUANG X H， HAN X J， LIU X L， et al. Serotypes， main virulence genes， and multilocus sequence typing of 199 clinical isolates of Streptococcus suis［J］. Microbiology China， 2022， 49（10）：4209-4223. （in Chinese）

［9］ 呂若一， 司曉慧， 孫志剛， 等. 豬鏈球菌耐藥現(xiàn)狀分析及感染防控措施［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（12）：4920-4933.

L R Y， SI X H， SUN Z G， et al. Drug resistance situation of Streptococcus suis and prevention measures of infections［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2023， 54（12）：4920-4933. （in Chinese）

［10］ LIU P， ZHANG Y， TANG H， et al. Prevalence of Streptococcus suis in pigs in China during 2000-2021： a systematic review and meta-analysis［J］. One Health， 2023， 16：100513.

［11］ 王治方， 白紅杰， 徐引弟， 等. 豬鏈球菌流行優(yōu)勢(shì)菌株的調(diào)查及耐藥性［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2020， 40（12）：2327-2332.

WANG Z F， BAI H J， XU Y D， et al. Prevalence and drug resistance of Streptococcus suis［J］. Chinese Journal of Veterinary Science， 2020， 40（12）：2327-2332. （in Chinese）

［12］ 劉 琪， 王 娟， 周如月， 等. 廣東地區(qū)健康豬群和發(fā)病豬群豬鏈球菌流行病學(xué)調(diào)查分析［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2017， 44（6）：1825-1831.

LIU Q， WANG J， ZHOU R Y， et al. The Streptococcus suis epidemiological analysis of healthy and infected swine in Guangdong province［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2017， 44（6）：1825-1831. （in Chinese）

［13］ 毛從劍， 曹 冶， 于吉鋒， 等. 四川部分地區(qū)豬鏈球菌的分離鑒定及其毒力基因型和耐藥性研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2023（22）：97-103， 146.

MAO C J， CAO Y， YU J F， et al. Isolation and identification of Streptococcus suis in some areas of Sichuan Province and study on its virulence genotype and drug resistance［J］. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine， 2023（22）：97-103， 146. （in Chinese）

［14］ TANG J S， GUO M R， CHEN M， et al. A link between STK signalling and capsular polysaccharide synthesis in Streptococcus suis［J］. Nat Commun， 2023， 14（1）：2480.

［15］ FITTIPALDI N， SEGURA M， GRENIER D， et al. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis［J］. Future Microbiol， 2012， 7（2）：259-279.

［16］ TRAM G， JENNINGS M P， BLACKALL P J， et al. Streptococcus suis pathogenesis-A diverse array of virulence factors for a zoonotic lifestyle［J］. Adv Microb Physiol， 2021， 78：217-257.

［17］ ZHONG Q， ZHAO Y， CHEN T， et al. A functional peptidoglycan hydrolase characterized from T4SS in 89K pathogenicity island of epidemic Streptococcus suis serotype 2［J］. BMC Microbiol， 2014， 14：73.

［18］ CORSAUT L， MARTELET L， GOYETTE-DESJARDINS G， et al. Immunogenicity study of a Streptococcus suis autogenous vaccine in preparturient sows and evaluation of passive maternal immunity in piglets［J］. BMC Vet Res， 2021， 17（1）：72.

［19］ 段倩倩， 毛天驕， 韓業(yè)芹， 等. 豬鏈球菌2型滅活疫苗對(duì)小鼠的免疫效果評(píng)價(jià)［J］. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2020， 32（4）：577-585.

DUAN Q Q， MAO T J， HAN Y Q， et al. Evaluation of immune efficacy of inactivated Streptococcus suis serotype 2 vaccine in mice［J］. Acta Agriculturae Zhejiangensis， 2020， 32（4）：577-585. （in Chinese）

［20］ 李倩倩， 龍?jiān)浦荆?梁 鞏， 等. 豬鏈球菌3型疫苗候選菌株篩選及3+9型二價(jià)滅活疫苗對(duì)小鼠免疫效果評(píng)估［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2022， 49（6）：2307-2317.

LI Q Q， LONG Y Z， LIANG G， et al. Screening of vaccine candidate strains of Streptococcus suis serotype 3 and evaluation of the immune effect of the bivalent inactivated vaccine Streptococcus suis serotype 3+9 on mice［J］. China Animal Husbandry amp; Veterinary Medicine， 2022， 49（6）：2307-2317. （in Chinese）

［21］ SCHULTSZ C， JANSEN E， KEIJZERS W， et al. Differences in the population structure of invasive Streptococcus suis strains isolated from pigs and from humans in the Netherlands［J］. PLoS One， 2012， 7（5）：e33854.

［22］ ZHANG B Z， KU X， YU X X， et al. Prevalence and antimicrobial susceptibilities of bacterial pathogens in Chinese pig farms from 2013 to 2017［J］. Sci Rep， 2019， 9（1）：9908.

［23］ BAUMS C G， KOCK C， BEINEKE A， et al. Streptococcus suis bacterin and subunit vaccine immunogenicities and protective efficacies against serotypes 2 and 9［J］. Clin Vaccine Immunol， 2009， 16（2）：200-208.

［24］ 趙 望， 孫 毅， 曾同祥. 大蠟螟作為病原真菌動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)研究［J］. 中國(guó)真菌學(xué)雜志， 2020， 15（4）：248-252.

ZHAO W， SUN Y， ZENG T X. The related research of Galleria mellonella as an animal experimental model of pathogenic fungi［J］. Chinese Journal of Mycology， 2020， 15（4）：248-252. （in Chinese）

［25］ VELIKOVA N， KAVANAGH K， WELLS J M. Evaluation of Galleria mellonella larvae for studying the virulence of Streptococcus suis［J］. BMC Microbiol， 2016， 16（1）：291.

［26］ YEPES-P REZ Y， RODR GUEZ-OBEDIENTE K， CAMARGO A， et al. Molecular characterisation of parvorder Platyrrhini IgG sub-classes［J］. Mol Immunol， 2021， 139：23-31.

［27］ HUNTER C A， JONES S A. IL-6 as a keystone cytokine in health and disease［J］. Nat Immunol， 2015， 16（5）：448-457.

［28］ TRINCHIERI G. Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity［J］. Nat Rev Immunol， 2003， 3（2）：133-146.

［29］ DE LA CRUZ DOM NGUEZ-PUNARO M， SEGURA M， RADZIOCH D， et al. Comparison of the susceptibilities of C57BL/6 and A/J mouse strains to Streptococcus suis serotype 2 infection［J］. Infect Immun， 2008， 76（9）：3901-3910.

［30］ 崔麗榮， 王嘉珍， 李 亮， 等. 豬鏈球菌三價(jià)滅活苗的制備及對(duì)小鼠免疫效果的評(píng)價(jià)［J］. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2022， 44（2）：169-178.

CUI L R， WANG J Z， LI L， et al. Preparation of trivalent inactivated vaccine of Streptococcus suis and evaluation of immune efficacy on mice［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine， 2022， 44（2）：169-178. （in Chinese）

［31］ LI Y A， SUN Y N， FU Y， et al. Salmonella enterica serovar Choleraesuis vector delivering a dual-antigen expression cassette provides mouse cross-protection against Streptococcus suis serotypes 2， 7， 9， and 1/2［J］. Vet Res， 2022， 53（1）：46.

［32］ LI Q， LV Y F， LI Y A， et al. Live attenuated Salmonella enterica serovar Choleraesuis vector delivering a conserved surface protein enolase induces high and broad protection against Streptococcus suis serotypes 2， 7， and 9 in mice［J］. Vaccine， 2020， 38（44）：6904-6913.

［33］ OBRADOVIC M R， CORSAUT L， DOLBEC D， et al. Experimental evaluation of protection and immunogenicity of Streptococcus suis bacterin-based vaccines formulated with different commercial adjuvants in weaned piglets［J］. Vet Res， 2021， 52（1）：133.

（編輯 白永平）