摘 要： 旨在評估1株替抗專利菌株唾液乳桿菌XP132對健康白羽肉種雞腸道菌群的影響。選取12只6月齡白羽肉種雞，隨機平均分為試驗組和對照組，每組6只。試驗組白羽肉種雞每日飼喂活菌數(shù)為1×109 CFU的唾液乳桿菌XP132發(fā)酵液，對照組飼喂PBS，連續(xù)飼喂4周后，基于16S rDNA測序方法，比較兩組雞腸道菌群發(fā)生的相對改變。結(jié)果表明，在飼喂唾液乳桿菌XP132后，通過α多樣性分析物種豐富度，試驗組菌群豐富程度高于對照組。在菌群組成的屬水平上，飼喂唾液乳桿菌XP132的肉種雞腸道菌群中，螺旋體科NK4A136屬、梭狀芽胞桿菌屬、副擬桿菌屬、羅氏菌屬等有益物種豐度增加；在種水平上，飼喂唾液乳桿菌XP132組的肉種雞腸道菌群中乳桿菌、擬桿菌、鼠李糖乳桿菌類等有益物種豐度增加。結(jié)果提示，本試驗條件下，飼喂唾液乳桿菌XP132改變了白羽肉種雞腸道菌群的豐富度，增加了有益菌菌群的物種豐度。

關(guān)鍵詞： 腸道菌群；唾液乳桿菌；16S rDNA；白羽肉種雞

中圖分類號：S831.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4091-09

Effect of Feeding Lactobacillus salivarius XP132 on the Gut Microbiota of White-feathered Broiler Breeder based on 16S rDNA Analysis

HE" Tana" HU" Xinyun "MI" Jielan "GAO" Li "ZHANG" Yanping "QI" Xiaole "CUI" Hongyu1*，

YANG" Guilian2*， GAO" Yulong1*

（1.State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology， Harbin Veterinary

Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069，" China;

2.College of Animal Medicine， Jilin Agricultural University， Changchun 130118，" China）

Abstract：" In this study， the effect of a patent-protected strain， Lactobacillus salivarius XP132， on the gut microbiota of healthy white feathered broiler breeders was evaluated using 16S rDNA sequencing. Twelve 6-month-old white-feathered broilor breeders were selected and randomly divided into control growp and experimeat group， with 6 broilers in each group. Lactobacillus salivarius XP132 fermentation broth with 1×109 CFU was fed to broiler breeders in experiment group per day for 4 weeks， while broiler breeders in the control group were fed with PBS. Gut microbiota were determined by 16S rDNA sequencing. The results showed that after feeding Lactobacillus salivarius XP132 the species richness was higher in the experimental group than that in the control group using α diversity analysis. At the genus level of microbial composition， there was an increase in the abundance of beneficial species such as Laehnospiraceae NK4A136 spp.， Clostridium spp.， Paramycetes spp.， and Rhodococcus spp. in the gut microbiota of the experimental group compared to the control group. While at the species level， there was a significant increase in the abundance of beneficial species such as Lactobacillus spp.， Anaplasmatales spp.， and Lactobacillus rhamnosus spp. in the gut microbiota of the experimental group. The results showed that feeding Lactobacillus salivarius XP132 changed the richness of intestinal microbiota and increased the species abundance of beneficial bacteria in white-feathered broilers.

Key words： gut microbiota; Lactobacillus salivarius; 16S rDNA; white-feathered broiler breeder

*Corresponding authors： CUI Hongyu， E-mail：cuihongyu@caas.cn; YANG Guilian， E-mail：yangguilian@jlau.edu.cn; GAO Yulong， E-mail：gaoyulong@caas.cn

腸道菌群是一組由共生菌、益生菌以及致病微生物等組成的生態(tài)群落，最早是由約書亞·萊德伯格（Joshua Lederberg）引入科學(xué)界的，微生物組與人們共享身體空間，通過腸-腦軸等影響機體健康，是諸多疾病產(chǎn)生的決定性因素［1］。長期以來，人們僅從致病微生物和宿主細(xì)胞之間的聯(lián)系來考慮疾病的產(chǎn)生與預(yù)防，并沒有注意到大多數(shù)腸道微生物與宿主健康之間的關(guān)系。隨著益生細(xì)菌和腸道免疫的研究發(fā)展，益生微生物對腸道微生物群的改變以及對疾病治療中的作用顯得尤為突出，人們也越來越認(rèn)識到腸道菌群在促進(jìn)動物的整體健康和生產(chǎn)性能方面發(fā)揮著重要作用。

家禽腸道中有許多微生物，家禽腸道健康的因素除物理和化學(xué)屏障外，主要由腸黏膜及其微生物組來決定。其中微生物組更是維持腸道健康必不可少的組成部分，腸道微生物組主要由細(xì)菌、真菌、原生動物和古生菌等組成，并隨著機體新陳代謝而動態(tài)變化［2］。機體中很多疾病的發(fā)生都與腸道內(nèi)微生物的繁殖、發(fā)育及代謝有關(guān)，微生物菌群的組成和結(jié)構(gòu)與數(shù)量也在不斷發(fā)生變化，并影響著疾病的發(fā)生與發(fā)展，其復(fù)雜程度并不亞于機體內(nèi)其他任何場所［2］，因此腸道菌群又被稱為第二基因組［3］。有許多研究表明，口服益生菌對腸道微生物群會產(chǎn)生一些重大并有益的影響，例如口服植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、嗜酸片球菌、屎腸球菌和釀酒酵母組成的新型多菌種益生菌可以增加飼料利用率，減輕多殺性巴氏桿菌導(dǎo)致的腸道炎癥，增強腸道健康，降低肉雞死亡率［4-5］。唾液乳桿菌于1953年首次報道，是乳桿菌屬的一種革蘭陽性細(xì)菌，主要從人和動物口腔的及腸道中分離，是公認(rèn)的有益微生物，有研究表明，口服唾液乳桿菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群的結(jié)構(gòu)，建立以有益細(xì)菌為主的微生物群落，增強黏膜或腸道上皮組織的屏障功能，防止細(xì)胞凋亡，并且可以誘導(dǎo)腸道免疫反應(yīng)，提高小腸免疫水平，并通過各種機制對抗致病菌感染［6-8］。

益生菌在家禽養(yǎng)殖業(yè)已得到了廣泛應(yīng)用，但目前大多數(shù)應(yīng)用和研究主要集中在增加家禽的飼料利用率和營養(yǎng)代謝特性及生產(chǎn)性能上，而對使用益生菌對家禽腸道菌群的影響，特別是對種禽的腸道菌群的影響研究較少。本研究旨在探索飼喂唾液乳桿菌XP132對白羽肉種雞腸道菌群的影響，為益生菌改變家禽宿主腸道菌群組成，特別是對白羽肉種雞的腸道菌群的影響提供科學(xué)數(shù)據(jù)，為提高種禽的免疫能力與代謝功能等方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株及試驗動物

唾液乳桿菌XP132由本實驗室前期分離并保存在－80℃冰箱（唾液乳桿菌XP132分離自中國黑龍江省大興安嶺原始森林野生健康野豬的盲腸黏膜上，該菌株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其微生物保藏號是CGMCC No.24532。已有研究表明該菌株具有獨特的抗菌特性，同時還具有耐酸、耐膽鹽等特性，僅口服該菌株即可抑制沙門菌感染引發(fā)的疫病，尤其是對雞白痢沙門菌的感染有特效，可以使部分雞白痢陽性種雞抗體轉(zhuǎn)陰，顯示了唾液乳桿菌XP132株對雞白痢沙門菌的強大殺滅作用，在雞白痢的凈化中將發(fā)揮重要保護(hù)作用；菌株專利號：ZL 2022 1 111 3152.3）；本試驗所用12只6月齡白羽肉種雞由黑龍江省五常市某種雞場提供，飼養(yǎng)于濕度50%±10%的負(fù)壓隔離器中。

1.2 試驗試劑與器材

試驗試劑：MRS液體培養(yǎng)基；MagPure Soil DNA LQ Kit（Magen 中國）；1×dsDNA HS Assay Kit for Qubit（Yeasen 中國）；Ex Taq 高保真酶購自（TaKaRa 日本）；DNeasy PowerSoil Kit 購自（Qiagen 德國）；Qubit dsDNA檢測試劑盒（MD，美國）。試驗儀器：臺式高速離心機- Centrifuge 5418（Eppendorf 德國）；PCR儀-580BR10905（Bio-rad 美國）；電泳儀HE-120（Tanon 中國）；凝膠成像儀-2500（Tanon 中國）；Bioanalyzer-2100（Aglient美國）。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 菌株制備

將唾液乳桿菌XP132以1%的比例接種到MRS液體培養(yǎng)基中，于37℃靜置培養(yǎng)12 h。進(jìn)行菌落計數(shù)，將發(fā)酵液進(jìn)行倍比稀釋，每個梯度取100 μL均勻涂在MRS固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 h后，取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板進(jìn)行計數(shù)，最終將菌落濃度調(diào)至1×109 CFU·mL－1備用。

1.3.2 分組及樣品采集

將12只6月齡白羽肉種雞均分成2組，分別飼養(yǎng)在2個負(fù)壓隔離器中。試驗組飼喂唾液乳桿菌XP132，每只雞每天飼喂活菌數(shù)為1×109 CFU·mL－1的唾液乳桿菌XP132發(fā)酵液5 mL，對照組飼喂同體積PBS。連續(xù)飼喂4周后，將所有白羽肉種雞進(jìn)行安樂死，采集各腸段腸內(nèi)容物，分裝到15 mL離心管中，放于-80℃凍存?zhèn)溆貌杉须u的空腸和回腸內(nèi)容物，將對照組所有雞的空腸內(nèi)容物均勻混合，平均分為3份放于-80 ℃凍存?zhèn)溆?；回腸內(nèi)容物以相同的方法混合樣品分裝后凍存?zhèn)溆?。XP132試驗組空腸、回腸內(nèi)容物也用同樣的方法采集后分別凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因組DNA提取及測序

腸道菌群的16S測定由OEbiotech（中國上海）進(jìn)行。其主要步驟如下，取出-80℃凍存樣本，使用DNeasy PowerSoil Kit （Qiagen， Duesseldorf， Germany）提取每組小腸糞便樣本中細(xì)菌的總DNA并進(jìn)行純化。通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA的濃度測定，取適量的DNA樣品于離心管中，使用無菌水將樣品稀釋至1 ng·μL－1。將稀釋后的基因組DNA做為模板，根據(jù)16S rDNA測序特異性區(qū)域的選擇，使用正向引物343F 5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′和反向引物798R 5′-AGGGTATCTAATCCT-3′，配合Ex Taq高保真酶（TaKaRa）對細(xì)菌總DNA的16S rDNA的V3-V4 區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物使用電泳檢測后，再使用磁珠進(jìn)行純化，去除擴(kuò)增產(chǎn)物中游離引物和引物二聚體。純化后擴(kuò)增產(chǎn)物作為第二輪PCR模板，并再次使用電泳檢測，檢測后使用磁珠純化，純化后使用Qubit dsDNA檢測試劑盒（Life technologies corporation， MD， USA）進(jìn)行定量［9］。純化后PCR的產(chǎn)物進(jìn)行等量混樣，由生物分析儀Bioanalyzer-2100 （Agilent Technologies， LJ， USA）合并和測序。

1.5 生物信息分析

由“1.4”中獲得的測序原始數(shù)據(jù)為FAST Q格式，數(shù)據(jù)下機后，首先使用 cut adapt 軟件，對 raw data 序列剪切掉引物序列并修剪到最佳長度。然后使用 DADA2將上一步合格的雙端raw data序列按照QIIME 2（2020.11）默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，降噪，拼接及去嵌合體等質(zhì)控分析，得到代表序列及ASV豐度表格。使用QIIME 2軟件包挑選出各個ASV的代表序列后，并將所有代表序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對注釋。16S 使用 Silva（version138）數(shù)據(jù)庫比對，18S使用Silva（version138）數(shù)據(jù)庫比對，ITS使用 Unite 數(shù)據(jù)庫比對。物種比對注釋使用 q2-feature-classifier 軟件默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行分析。

1.6 道德聲明

本研究中的所有動物試驗均按照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部（中國北京）的《實驗動物規(guī)范》進(jìn)行。動物倫理委員會批準(zhǔn)文號為SYXK（黑龍江）2023022。所有白羽肉種雞都是根據(jù)人道護(hù)理和使用實驗動物的原則飼養(yǎng)和處理的。

2 結(jié) 果

2.1 測序深度及質(zhì)量

如圖1所示，飼喂唾液乳桿菌XP132 4周后白羽肉雞的12個小腸糞便樣本，分別是XP132_J1/J2/J3（3個飼喂XP132試驗組的空腸內(nèi)容物），Cont_J1/J2/J3（3個對照組的空腸內(nèi)容物），XP132_I1/I2/I3（3個飼喂XP132試驗組的回腸內(nèi)容物），Cont_I1/I2/I3（3個對照組的回腸內(nèi)容物）。每一條曲線代表一個樣本，橫坐標(biāo)為隨機抽樣的深度（即抽樣的序列數(shù)），縱坐標(biāo)為進(jìn)化距離指數(shù)，曲線的平緩程度表示樣品的合理性。結(jié)果顯示，12條曲線均隨著抽取序列數(shù)的增加而趨于平緩時，說明本研究樣本的測序數(shù)據(jù)量合理。測序下機后數(shù)據(jù)量分布在 78 225～81 540之間，在進(jìn)行質(zhì)量過濾篩選得到的數(shù)據(jù)量分布在 62 879～76 220 之間，最后通過拼接、去除嵌合體后得到最終用于分析的數(shù)據(jù)量分布在62 201～75 717 之間。

2.2 飼喂唾液乳桿菌XP132對腸道菌群的影響

2.2.1 基于α多樣性分析物種豐富度

如圖2所示，本研究12個樣品相對豐度均在0.01～0.001之間，表示12個樣品的物種組成均勻程度相似，但飼喂XP132組橫軸跨度更大，樣品豐富程度均在100～150之間，而空白對照組豐富度大多在70～100之間，相對比較而言，飼喂唾液乳桿菌XP132組樣本中物種的豐富程度更高，腸道菌群更具多樣性。

2.2.2 飼喂唾液乳桿菌XP132對腸道菌群的影響

2.2.2.1 飼喂唾液乳桿菌XP132在屬水平上物種豐度差異：

如圖3所示，在屬水平上，飼喂唾液乳桿菌XP132肉種雞空腸菌群中，螺旋體科NK4A136屬、梭狀芽胞桿菌屬、副擬桿菌屬、沉積物桿狀菌屬、羅氏菌屬、假諾卡氏菌屬、MND1屬、普雷沃氏菌屬、羅爾斯通氏屬、丹毒梭菌、布勞特氏菌屬、擬桿菌屬、黃單胞桿菌屬、腸桿菌屬、毛梭桿菌、節(jié)線菌屬、螺桿菌屬、棲糞桿菌屬、普雷沃氏菌科UCG001物種豐度高于對照組；飼喂唾液乳桿菌XP132肉種雞回腸中，膜單胞菌屬、志賀菌屬、艱難梭菌屬等物種豐度高于對照組。

2.2.2.2 飼喂唾液乳桿菌XP132在種水平上物種豐度差異：

如圖4所示，飼喂唾液乳桿菌XP132肉種雞空腸菌群中，種水平上耐酸乳桿菌、回腸類桿菌、擬桿菌、巴尼西亞擬桿菌、鼠李糖乳桿菌、擬桿菌類、足尖螺旋桿菌、黃單胞桿菌、新型脫硫弧菌、羅爾斯通氏菌、賽迪米尼菌屬的某個種、卵形擬桿菌、產(chǎn)酸擬桿菌、假單胞菌、玫瑰桿菌、副流感嗜血桿菌物種豐度高于對照組，而對照組中螺形菌和丹毒梭菌物種豐度高于飼喂XP132試驗組；對照組肉種雞空腸菌群中羅氏菌、擬桿菌物種豐度高于試驗組。

2.2.3 基于Meta分析影響群落的主要差異物種

圖5中列出了4個樣品組內(nèi)物種豐度差異顯著的物種以及相對豐度較高的物種。其中腸桿菌、變形菌、腸桿菌屬、志賀氏菌、γ變形菌5個物種在飼喂唾液乳桿菌XP132的試驗組肉種雞空腸內(nèi)影響相對突出；類桿菌屬、擬桿菌屬、魏斯氏菌屬4個種屬在飼喂唾液乳桿菌XP132試驗組肉種雞的回腸內(nèi)影響相對突出；乳桿菌屬、芽孢桿菌綱、乳桿菌屬、厚壁菌門4個物種在對照組空腸中影響相對突出，Atopobiaceae、Coriobacteriaceae_UCG_002兩個物種在對照組回腸影響相對突出。

2.3 腸道微生物重要物種分析

通過隨機森林算法分析樣本中變量較大的物種，結(jié)果顯示飼喂唾液乳桿菌XP132對腸道菌群中 羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、擬桿菌屬（Bacteroides）的影響最大（圖6方框指示）。

3 討 論

腸道微生物群主要是由細(xì)菌、真菌、古細(xì)菌、原生動物和病毒等組成的生態(tài)菌落，它們與宿主相互作用并相互影響宿主的生理和健康。其中腸道菌群動物健康中起著重要作用。腸道中細(xì)菌可以在腸道通過分泌、代謝等活動，幫助宿主消化和吸收，并獲取自身活動所需要的能量和微量元素。此外，腸道菌群對宿主黏膜細(xì)胞功能產(chǎn)生多方面影響，包括腸道細(xì)胞增殖和分化、能量平衡和pH控制、免疫系統(tǒng)發(fā)育，以及對抗病原體入侵和定植等。因此，腸道菌群與宿主健康和疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

唾液乳桿菌XP132是本實驗室前期分離得到的1株具有廣譜抗菌活性的益生菌株，本研究通過16S rDNA分析，比較了飼喂唾液乳桿菌XP132的試驗組和未飼喂XP132的對照組的腸道微生物群組成和結(jié)構(gòu)上的差異，發(fā)現(xiàn)試驗組肉種雞腸道菌群豐富度顯著高于對照組，同時添加唾液乳桿菌XP132后可以增強腸道微生物中羅氏菌屬、梭菌屬、乳桿菌屬等厚壁菌門的公認(rèn)有益微生物數(shù)量。其中腸道重要基石菌屬-羅氏菌屬（Roseburia）是腸道內(nèi)重要的共生細(xì)菌，占健康腸道細(xì)菌總數(shù)的2%～31%，羅氏菌屬的大多數(shù)成員都可以產(chǎn)生丁酸、丙酸等短鏈脂肪酸，幫助宿主分解不易消化的碳水化合物，減少促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，減輕腸道炎癥，保護(hù)腸道免受病原體和疾病的侵害［10-12］。同時羅氏菌屬數(shù)量增加對宿主的免疫系統(tǒng)也有很大的好處，比如能促進(jìn)調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞的發(fā)育和功能，產(chǎn)生抗菌分子如有機酸、乙醇和細(xì)菌素等，能夠抑制病原微生物的定植，并重塑宿主中的共生微生物群組成，有益宿主免疫系統(tǒng)［13-16］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)所有試驗組與對照組相比，腸道微生物群都以羅姆布茨菌屬（Romboutsia）、擬桿菌屬（Bacteroides）、乳桿菌屬（Lactobacillus）的變化為主。其中Romboutsia屬由Ricaboni等［17］于2014年首次從健康大鼠的回腸消化物樣本中分離后創(chuàng)建。羅姆布茨菌作為腸道中的專性厭氧菌，其相對豐度的改變對厭氧腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)和破譯腸道微生物群與健康之間的聯(lián)系至關(guān)重要，現(xiàn)有研究表明，Romboutsia可以將多種碳水化合物代謝為短鏈脂肪酸、低聚糖和其他益生元，這些代謝產(chǎn)物對宿主有益，此外Romboutsia的相對豐度的增加也有助于增強蛋雞的免疫功能［18］。擬桿菌屬由超過7 000多種不同的革蘭陰性菌組成，主要來自擬桿菌、副擬桿菌、普氏菌和卟啉單胞菌等，是胃腸道的主要定植者。擬桿菌屬的成員也可以產(chǎn)生丁酸鹽，發(fā)揮抗癌特性，并在維持腸道健康方面發(fā)揮作用。同時擬桿菌屬的部分成員在調(diào)節(jié)吸收，能量轉(zhuǎn)換和葡萄糖代謝中起重要作用［19-21］。此外，擬桿菌屬的成員還參與膽汁酸的代謝和有毒化合物的轉(zhuǎn)化，這也強調(diào)了它們的積極作用［21］。乳酸菌屬的增加也產(chǎn)生重要的積極作用，在家禽中先天免疫、機械黏膜屏障和乳酸菌屬的定植抵抗等防御機制可防止內(nèi)源性細(xì)菌從腸道易位，腸道定植抵抗是對攝入細(xì)菌定植的抵抗力或抑制通常存在于腸道內(nèi)低水平的常駐細(xì)菌過度生長的抵抗力［22-24］。這種機制主要由腸道中主要厭氧常駐微生物群（例如乳酸桿菌）的有益作用維持［25］，而本研究在種水平上觀察到的乳酸桿菌的增加，表明了唾液乳桿菌XP132是一種對病原菌定植抵抗的菌株之一。

其他包括變形桿菌、放線桿菌也有檢測到，但占比較少。變形桿菌是胃腸道的首批定植者之一［26］。變形桿菌可降低氧化還原電位，并且在腸道準(zhǔn)備中起關(guān)鍵作用，以便隨后通過健康腸道功能所必需的嚴(yán)格厭氧菌定植［27］。此外，在連續(xù)飼喂唾液乳桿菌XP132四周后，螺旋體屬、腸桿菌屬、普雷沃氏菌屬成員在白羽肉種雞腸道中的豐度較對照組有所增加，有報道稱它們的增加可能影響宿主如人或小鼠的健康［28-31］，但沒有明確研究表明，螺旋體屬、腸桿菌屬、普雷沃氏菌屬的成員在雞腸道中富集會導(dǎo)致宿主產(chǎn)生潛在的有益或無益的代謝性變化。

4 結(jié) 論

腸道微生物群與宿主健康之間有著密不可分的關(guān)系，隨著分子工具和技術(shù)（即代謝組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)）的發(fā)展，宿主與腸道微生物之間的復(fù)雜關(guān)系正在逐步被破譯。本研究主要探索了飼喂唾液乳桿菌XP132對于白羽肉種雞腸道菌群的影響，研究發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌XP132可以調(diào)節(jié)白羽肉種雞腸道微生物群的組成，增強物種豐富度和多樣性，并促進(jìn)有益細(xì)菌種屬豐度的增加，為乳酸菌改變腸道菌群豐富度以及菌群組成結(jié)構(gòu)等方向提供了科學(xué)數(shù)據(jù)，對益生菌調(diào)節(jié)宿主腸道菌群的研究具有重要意義。

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（編輯 范子娟）