摘 要： 旨在揭示干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRFs）對豬偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）增殖的影響，本研究通過shRNA技術(shù)構(gòu)建敲減IRF1-9的PK15細(xì)胞系，并檢測其敲減效率。采用流式細(xì)胞術(shù)以及滴度測定檢測敲減IRF1-9后PRV的增殖情況；利用RT-qPCR技術(shù)檢測PRV感染細(xì)胞后PRV-gB、IFN-β、ISG-15和IL-6的mRNA表達(dá)水平；Western blot技術(shù)檢測PRV感染細(xì)胞后gB蛋白的表達(dá)水平。敲減效率測定結(jié)果顯示，PK15細(xì)胞中的IRF1-9 mRNA表達(dá)水平均有顯著降低；流式細(xì)胞術(shù)及滴度測定結(jié)果表明，敲減IRF1-9基因后有助于PRV的增殖；RT-qPCR及Western blot結(jié)果證明，敲減IRF1-9基因后，PRV-gB mRNA及蛋白表達(dá)水平均有顯著提高；細(xì)胞炎性因子的mRNA表達(dá)水平檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲減IRF1-9抑制PRV誘導(dǎo)的IFN-β、ISG-15以及IL-6 mRNA表達(dá)。綜上所述，IRF1-9是PRV在PK-15細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的宿主限制因子。

關(guān)鍵詞： shRNA；干擾素調(diào)節(jié)因子；豬偽狂犬病病毒；細(xì)胞炎性因子

中圖分類號： S852.4; S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4100-10

Construction of Interferon Regulatory Factor Knockdown Cell Line and Its Effect on Pseudorabies

Virus Proliferation

FU" Yiqian "LIANG" Dongge "WANG" Mingyang "PAN" Jiajia "YANG" Yanbin "ZENG" Lei "KANG" Xiangtao4*

（1.College of Animal Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

2.Key Laboratory of Animal Biochemistry and Nutrition， Ministry of Agriculture and

Rural Areas， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China;

3.Henan Key Laboratory of Animal Growth and Development Regulation， Henan Agricultural

University， Zhengzhou 450046，" China;

4.College of Animal Science and

Technology， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" To elucidate the impact of interferon regulatory factors （IRFs） on the proliferation of porcine pseudorabies virus （PRV）， this study utilized shRNA technology to establish a PK15 cell line with the targeted knockdown of IRF1-9 genes. The knockdown efficiency was verified， and the proliferation of PRV subsequent to the knockdown was assessed using flow cytometry and titration assays. Additionally， the mRNA expression levels of PRV-gB， IFN-β， ISG-15， and IL-6 in PRV-infected cells were quantified by reverse transcription quantitative polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The expression of the gB protein in PRV-infected cells was analyzed by Western blotting. The knockdown efficiency assay demonstrated a significant reduction in the expression of IRF1-9 mRNA in PK15 cells. The results from flow cytometry and titration assays indicated that the knockdown of IRF1-9 genes facilitated the proliferation of PRV. Furthermore， RT-qPCR and Western blot results revealed a significant increase in the mRNA and protein expression levels of PRV-gB following the knockdown of IRF1-9 genes. The analysis of mRNA expression levels of cellular inflammatory factors showed that the knockdown of IRF1-9 inhibited the PRV-induced expression of IFN-β， ISG-15， and IL-6 at the mRNA level. In conclusion， these findings suggest that IRF1-9 serves as a host restriction factor， limiting the replication of PRV within PK-15 cells.

Key words： shRNA; interferon regulatory factor; pseudorabies virus; inflammatory cytokines

*Corresponding authors：" ZENG Lei， E-mail： zenglei2021918@163.com; KANG Xiangtao， E-mail： xtkang2001@263.net

偽狂犬病病毒（pseudorabies virus），屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科水痘病毒屬。雙鏈線性DNA病毒，基因組長度143 kb，可編碼70多種蛋白質(zhì)［1］。1902年，首次被證實(shí)PRV是奧耶斯基病的致病病原體［2］，直到1947年，首次在中國發(fā)現(xiàn)偽狂犬病病毒［3］，并在國內(nèi)傳播。由于當(dāng)時沒有穩(wěn)定有效的疫苗，該病一直在中國大范圍傳播，給中國生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失?？筛腥静煌曫B(yǎng)階段的豬群：仔豬常表現(xiàn)為致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病癥狀，死亡率高，育肥豬、后備母豬出現(xiàn)呼吸道癥狀，但死亡率低，公豬會出現(xiàn)睪丸炎，懷孕母豬會發(fā)生流產(chǎn)，或者產(chǎn)死胎、木乃伊胎［4］。

目前，多項(xiàng)研究表明，雖然豬是PRV的唯一宿主，但是也可以導(dǎo)致多種動物感染，包括羊、狗、狐貍、虎、熊等［5-6］。近年，有研究報(bào)道表明，世界范圍內(nèi)出現(xiàn)了多例人感染偽狂犬病毒引起嚴(yán)重腦炎［7］。因此，由于PRV在各種動物和人之間的傳播嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生安全，使其越來越受到人們的高度重視［8］。

偽狂犬病毒進(jìn)入宿主后，首先感染宿主鼻腔和口咽黏膜的上皮細(xì)胞，然后擴(kuò)散到周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元。病毒顆粒通過逆行運(yùn)輸?shù)竭_(dá)感覺和自主外周神經(jīng)節(jié)，在此建立潛伏的終身感染［9-11］。病毒感染宿主后，宿主可以通過模式識別受體（PRRs）識別入侵的病毒，激活信號通路產(chǎn)生Ⅰ型干擾素（IFN-Ⅰ），從而激活先天免疫系統(tǒng)對抗病毒的入侵［12］。釋放的IFN-I結(jié)合IFN受體（IFNAR1和/或IFNAR2），激活下游JAK-STAT信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致多種干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)［13］。

干擾素調(diào)節(jié)因子（interferon regulatory factor，IRFs）是一個轉(zhuǎn)錄因子家族，是調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要成員，可以促進(jìn)抗病毒反應(yīng)和促炎反應(yīng)，并且調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化［14］。作為干擾素調(diào)節(jié)因子，其對干擾素的表達(dá)水平調(diào)節(jié)起重要的作用，調(diào)控免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒的效果。本研究利用shRNA技術(shù)成功構(gòu)建了敲減IRF1-9的PK15細(xì)胞系，并檢測敲減IRF1-9的PK15細(xì)胞系與對照PK15細(xì)胞系相比感染PRV后對病毒增殖的影響以及對細(xì)胞炎性因子的影響，證明IRF1-9是PRV在PK-15細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的宿主限制因子，在抑制病毒復(fù)制中發(fā)揮著重要作用，為PRV的防控及藥物研發(fā)提供策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系和病毒

細(xì)胞系：PK15（豬腎上皮細(xì)胞）與HEK293T/17（人胚腎上皮細(xì)胞衍生細(xì)胞系）購自美國ATCC。病毒：豬偽狂犬病病毒（PRV-QXX）由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)李永濤老師饋贈。豬偽狂犬病重組熒光病毒（PRV-GFP）由中國科學(xué)院武漢病毒所王漢中老師饋贈。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)耗材

PK15、HEK293T/17傳代培養(yǎng)基為含有10%的胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）的DMEM。PK15細(xì)胞維持培養(yǎng)基為含有1% FBS的DMEM。嘌呤霉素和細(xì)胞培養(yǎng)耗材均購自美國Thermo公司。

1.1.3 主要感受態(tài)和質(zhì)粒

E. coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自北京鼎國昌盛公司。pLKO.1、pMD2.G和pSPAX2購自美國Addgene公司。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

超低溫冷存冰箱（Thermo，美國）；-20 ℃冷凍冰箱（Thermo，美國）；4 ℃冷藏冰箱（美菱，安徽）；全自動節(jié)能滅菌鍋（SANYO，日本）；全自動直立式制冰機(jī)（Panasonic， 日本）；恒溫水浴鍋（鼎國，北京）；梯度PCR儀（Eppendorf， 德國）；全波長酶標(biāo)儀、DNA濃度測定儀、QuantStudioTM6 Flex PCR儀（Thermo， 美國）；Mini-PROTEAN Tetra垂直電泳槽、水平電泳槽、電泳儀、制膠板、制膠器和凝膠成像器（Bio-Rad，美國）；流式細(xì)胞儀（BD，美國）；熒光倒置顯微鏡（OLYMPUS， 日本）；生物安全柜（Thermo， 美國）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo， 美國）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（精宏，上海）；超低溫液氮罐（Thermo，美國）；超凈工作臺（Thermo，美國）。

1.1.5 主要試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑、DNA Marker均購自大連寶生物公司；Tryptone、Yeast Extract和Agar power購自英國OXIOD公司；主要生化試劑購自北京索萊寶科技有限公司；異丙醇等有機(jī)試劑購自河南天馳生物科技有限公司；Q5高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶購自美國NEB公司；細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司；二甲亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢豬IRF-1、2、3、4、5、8基因組序列（shIRF-6、7、9重組質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室原先保存），根據(jù)此基因序列按照shRNA設(shè)計(jì)原則，在豬IRFs基因的外顯子中設(shè)計(jì)兩條shRNA（表1）。

通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢所要檢測的基因mRNA序列，利用Primer7.0 軟件設(shè)計(jì)RT-qPCR引物（表2）。

1.3 PK15 shIRFs敲減細(xì)胞系的構(gòu)建

1.3.1 shIRFs重組載體的構(gòu)建

將設(shè)計(jì)好的shRNA引物94℃ 4min進(jìn)行退火雜交，然后將退火產(chǎn)物與限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF和AgeⅠ-HF酶切線性化后的pLKO.1載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli TOP10感受態(tài)細(xì)胞，隨后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定，條帶正確的菌液送北京擎科生物科技有限公司測序。測序正確的菌液進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，并將質(zhì)粒-40℃保存。

1.3.2 敲減細(xì)胞系的構(gòu)建

將pLKO.1-shIRFs、pMD2.G、pSPAX2以4∶1∶3的比例共轉(zhuǎn)染至HEK293T/17細(xì)胞并培養(yǎng)。48 h后收取含有慢病毒的細(xì)胞上清，并取1 mL感染PK15細(xì)胞。48 h后用8 μg·mL-1的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，待對照組細(xì)胞全部死亡后，更換含有3 μg·mL-1嘌呤霉素濃度的培養(yǎng)基將敲減細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.4 IRFs基因敲減效率的驗(yàn)證

1.4.1 RT-qPCR檢測

將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞分別鋪種于6孔板中，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時，使用TRizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)體系為10 μL，其中，去離子水2.7 μL，SYBR Green mix 5 μL，20 μmol·L-1的上下游引物 各0.4 μL，cDNA模板1.5 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)。以β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參值，計(jì)算IRFs基因的相對mRNA水平。

1.4.2 Western blot檢測

在6孔板中分別鋪種PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRF-3細(xì)胞，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右時收取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，然后根據(jù)計(jì)算結(jié)果在SDS-PAGE膠中加入蛋白樣品，并用Loading Buffer補(bǔ)齊。電泳過后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜用5%的脫脂奶室溫封閉1 h后，加入IRF-3鼠多克隆抗體（1∶5 000），4℃搖床孵育過夜，之后用1×TBST在搖床室溫清洗4次后，再與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）室溫?fù)u床孵育2 h。洗4遍后進(jìn)行顯影，并以β-actin作為內(nèi)參。

1.4.3 免疫熒光檢測

在24孔板中分別鋪種PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRF-3細(xì)胞，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度達(dá)到40%左右時加入4%多聚甲醛固定30 min，隨后加入0.1%Triton X-100通透10 min，清洗后加入10%FBS PBS封閉1 h，后加入IRF-3兔多克隆抗體（1∶100）室溫孵育1 h，清洗后加入山羊抗兔IgG熒光二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，PBS清洗后使用超純水清洗，隨后封片，晾干后即可在共聚焦顯微鏡下拍照。

1.5 驗(yàn)證shIRFs基因敲減對PRV在PK15細(xì)胞上增殖的影響

1.5.1 熒光流式檢測病毒復(fù)制

24孔板鋪種PK15 control和PK15 shIRFs細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度為70%左右時，以MOI=0.001 感染PRV-GFP，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育1 h后，更換維持培養(yǎng)基，并在36 h后觀察熒光結(jié)果。當(dāng)多數(shù)熒光結(jié)果達(dá)到50%以上后，使用胰酶將細(xì)胞消化下來，以沒有感染PRV-GFP的PK15 control和PK15 shIRFs細(xì)胞的為空白對照，進(jìn)行細(xì)胞流式檢測。

1.5.2 PRV子代病毒滴度的測定

PK15 control和PK15 shIRFs細(xì)胞分別鋪種于12孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，然后將稀釋好的PRV-QXX病毒液加入孔中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱孵育1 h后更換維持培養(yǎng)基。觀察病變至80%左右時，于-40℃反復(fù)凍融3次。融化的病毒1 000×g離心6 min，吸取上清液，并于-80℃凍存。

將PK15細(xì)胞鋪種于24孔板中，細(xì)胞匯合度達(dá)80%以上時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，每個病毒樣品從10-1倍梯度稀釋至10-6倍，加入孔中，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育1 h后，更換維持培養(yǎng)基。等待至無新蝕斑出現(xiàn)后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗兩遍，4%多聚甲醛固定1 h后，使用1%結(jié)晶紫染色液染色30 min，選擇蝕斑清晰且數(shù)目適中的孔，在顯微鏡下計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)。

1.5.3 Western blot檢測PRV-gB蛋白表達(dá)

在6孔板中分別鋪種PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度為70%左右時，以MOI=0.001 感染PRV-QXX，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育1 h后，更換維持培養(yǎng)基，36 h后收取蛋白，BCA法測定蛋白濃度，然后根據(jù)計(jì)算結(jié)果在SDS-PAGE膠中加入蛋白樣品，并用Loading Buffer補(bǔ)齊。電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜用5%的脫脂奶室溫封閉1 h后，加入PRV-gB（1∶5 000）鼠多克隆抗體，4℃搖床孵育過夜，之后用1×TBST在搖床室溫清洗4次后，再與HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（1∶5 000）室溫?fù)u床孵育2 h。洗4遍后進(jìn)行顯影，并以β-actin作為內(nèi)參。

1.5.4 RT-qPCR檢測PRV-gB基因轉(zhuǎn)錄水平將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞分別鋪種于6孔板中，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度為70%左右時，以MOI=0.001 感染PRV-QXX，37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育1 h后更換維持培養(yǎng)基，待36 h后使用TRizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。以β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參值，計(jì)算PRV-gB基因的相對mRNA水平。

1.6 驗(yàn)證shIRFs基因敲減對細(xì)胞內(nèi)炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞分別鋪種于6孔板中，并各設(shè)3組重復(fù)。待細(xì)胞匯合度為70%左右時，以MOI=0.001 感染PRV-QXX，37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱孵育1 h后更換維持培養(yǎng)基，待36 h后使用TRizol法提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。以β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參值，計(jì)算IFN-β、ISG-15以及IL-6基因的相對mRNA水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各試驗(yàn)均平行重復(fù)3次，結(jié)果通過GraphPad Prism 8.0進(jìn)行t-test檢驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 豬pLKO.1-shIRFs重組載體的構(gòu)建

為了構(gòu)建豬IRFs基因敲減細(xì)胞系，針對豬IRFs基因的外顯子上設(shè)計(jì)兩條shRNA，將其雜交退火，后將pLKO.1載體雙酶切（圖1A），產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果顯示在7 026與1 875 bp處有明顯條帶，將大條帶切割進(jìn)行膠回收，與shRNA退火產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化后挑取單菌落培養(yǎng)，并進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯示，在271 bp處有明顯大小，為理想條帶（圖1B），隨后進(jìn)行菌液測序，結(jié)果表明豬pLKO.1-shIRFs重組載體構(gòu)建正確（圖1C）。隨后提取質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)（pLKO.1-IRF-6、7、9質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室原先保存）。

2.2 PK15 shIRFs敲減細(xì)胞系的構(gòu)建

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒通過慢病毒包裝轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中，通過嘌呤霉素篩選出敲減成功的細(xì)胞，并將其擴(kuò)大培養(yǎng)。隨后對每組敲減細(xì)胞系進(jìn)行總RNA提取，以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR檢測，以β-actin mRNA轉(zhuǎn)錄水平為內(nèi)參值，檢驗(yàn)IRFs基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，相較于對照組，敲減組的IRFs基因轉(zhuǎn)錄水平均有明顯降低，證明PK15 shIRFs敲減細(xì)胞系構(gòu)建成功（圖2A）。

隨后抽選PK15 shIRF-3細(xì)胞系進(jìn)行Western blot檢測，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，檢測IRF-3基因表達(dá)水平?？梢钥吹较噍^于PK15 control，PK15 shIRF-3樣品并未出現(xiàn)明顯條帶（圖2B）。在免疫熒光試驗(yàn)中，PK15 shIRF-3細(xì)胞中IRF-3蛋白的表達(dá)量明顯低于PK15 control細(xì)胞。證明PK15 shIRF-3敲減細(xì)胞系構(gòu)建成功。

2.3 驗(yàn)證IRFs基因敲減對PRV在PK15細(xì)胞上復(fù)制的影響

為探究IRFs基因敲減對PRV病毒復(fù)制的影響，將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞以MOI=0.001 感染PRV-GFP，隨后觀察熒光并進(jìn)行細(xì)胞流式檢測，結(jié)果表明，相較于PK15 control細(xì)胞，PK15 shIRFs細(xì)胞帶有熒光的細(xì)胞數(shù)明顯上調(diào)（圖3A）。隨后又將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞以MOI=0.001感染PRV-QXX，收取病毒液后以蝕斑法測定子代病毒滴度，結(jié)果表明，相較于PK15 control，PK15 shIRFs細(xì)胞上的病毒滴度同樣有明顯升高（圖3B）。初步證實(shí)IRFs基因敲減有助于PRV-GFP在細(xì)胞中的增殖。

為進(jìn)一步探究IRFs基因敲減對PRV的影響，本研究驗(yàn)證了PRV-gB的基因轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達(dá)水平。將PK15 control細(xì)胞與PK15 shIRFs細(xì)胞鋪種于6孔板中，以MOI=0.001感染PRV-QXX，分別收取總RNA，反轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行RT-qPCR，以及收取蛋白質(zhì)，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。結(jié)果顯示，相較于PK15 control，在PK15 shIRFs細(xì)胞中PRV-gB的基因轉(zhuǎn)錄水平（圖3C）以及蛋白表達(dá)水平（圖3D）均有明顯增多。證明IRFs基因的敲減對PRV-gB的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)均有上調(diào)作用。

2.4 驗(yàn)證IRFs的敲減對炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

為進(jìn)一步探究IRFs基因敲減有助于病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，本試驗(yàn)通過RT-qPCR分別檢測了在未感染病毒以及以MOI=0.001感染PRV-QXX時，細(xì)胞中IFN-β、ISG-15以及IL-6基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，不論有無PRV-QXX感染，相比對照組，IRFs敲減組的IFN-β、ISG-15以及IL-6的基因轉(zhuǎn)錄水平均有明顯下調(diào)（圖4），表明IRFS對于病毒的抑制作用是通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)炎性因子的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

3 討 論

病毒感染宿主后首先激活機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線—先天性免疫系統(tǒng)，活化的NF-κB、IRF3等轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)細(xì)胞促炎性因子和干擾素的產(chǎn)生。野生PRV會調(diào)節(jié)宿主的早期免疫應(yīng)答建立病毒潛伏感染條件，以便逃逸免疫。干擾素調(diào)節(jié)因子是調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要成員，可以促進(jìn)抗病毒反應(yīng)和促炎反應(yīng)，并且調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞分化［14］。自1988年第一個干擾素調(diào)節(jié)因子被發(fā)現(xiàn)以來［15-16］，迄今為止，在哺乳動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有9個IRF因子。另外，IRF-10在魚類和鳥類中被證實(shí)存在，IRF-11僅在硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)［17］。所有IRF家族成員都具有多個結(jié)構(gòu)域，包括：N-末端DNA結(jié)合域（DBD）、多肽連接物（LK）和C末端激活結(jié)構(gòu)域（AD）內(nèi)的IRF-關(guān)聯(lián)域（IAD）1或IAD2。通過這種方式，IRFs密切控制著IFN-Ⅰs和ISGs的轉(zhuǎn)錄激活。所以，它們是Toll樣受體（TLR）和干擾素信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器［18］。

近年來，眾多研究表明IRF家族具有抗病毒作用。有報(bào)道IRF-4與IRF-5共同參與EB病毒入侵宿主后所引起的免疫反應(yīng)，其中，IRF-5誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到抗病毒的效果［19］。此外，蜱傳腦炎病毒誘導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，激活RIG-I/MDA5和TBK 隨后激活I(lǐng)RF-3［20］。在仙臺病毒的感染中，IRF-3發(fā)揮了促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能，通過迅速消滅受感染的細(xì)胞來達(dá)到有效的病毒控制［21］。還有研究發(fā)現(xiàn)草魚呼腸孤病毒可誘導(dǎo)脾、腎和頭部中的IRF-5的表達(dá)，并且IRF-5可參與固有免疫應(yīng)答和DNA損傷誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)［22］，表明IRFs的抗病毒作用在動物界中是廣泛存在的。因此，本研究利用shRNA技術(shù)，成功構(gòu)建了以PK15細(xì)胞為模型的針對豬源IRFs基因文庫。篩選出9種敲減效率高的PK15細(xì)胞株，以此來確定敲減IRFs基因是否影響PRV病毒的增殖。因此本研究通過流式細(xì)胞術(shù)以及滴度測定檢測敲減IRF1～9后PRV的增殖情況，發(fā)現(xiàn)敲減IRF1～9基因后感染PRV-GFP的熒光細(xì)胞數(shù)明顯增多，病毒滴度明顯增高，說明敲減IRF1～9基因后有助于PRV的增殖。再利用RT-qPCR技術(shù)檢測PRV-gB基因轉(zhuǎn)錄水平，Western blot技術(shù)檢測PRV-gB蛋白表達(dá)水平，RT-qPCR以及Western blot結(jié)果顯示，敲減IRF1～9后PRV-gB基因的轉(zhuǎn)錄水平以及蛋白表達(dá)水平均有顯著升高。綜上所述，在PK15細(xì)胞中敲減IRFs基因有助于PRV的增殖，但具體的分子機(jī)制研究尚不明確。因此本研究進(jìn)一步探究了IRFs基因有助于PRV增殖的分子機(jī)制，通過實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)敲減IRF1-9抑制PRV誘導(dǎo)的IFN-β、ISG-15以及IL-6 mRNA表達(dá)，推測其可能是通過誘導(dǎo)干擾素的生成來抑制PRV 的增殖。最近研究發(fā)現(xiàn)敲除ISG15的PK15細(xì)胞中可阻斷IRF3激活干擾IFN-β的產(chǎn)生從而利于PRV的復(fù)制，而PRV的UL13則可通過IRF3的磷酸化抑制cGAS-Sting介導(dǎo)的IFN-β的產(chǎn)生［23］。此外有報(bào)道指出，對于偽狂犬病毒基因缺失疫苗毒株Bartha K61株的感染同樣適用于本機(jī)制，該研究指出Bartha K61毒株感染細(xì)胞后，誘導(dǎo)激活Ⅰ型干擾素的表達(dá)［24］。另有研究指出Bartha K61感染pDC細(xì)胞后，可通過LPS與TLR-4相互作用激活NF-κB信號通路，從而促進(jìn)IRFs基因的表達(dá)［25］。IRFs抗PRV的具體分子機(jī)制還需要更多的研究來探明。本研究結(jié)果將為該機(jī)制研究提供重要的理論依據(jù)，對于IRFs的研究也有著十分重要的意義，不僅有助于研發(fā)抗病毒藥物，也為眾多疾病機(jī)制的探索提供了一個相對可靠的靶標(biāo)。

4 結(jié) 論

本研究利用shRNA技術(shù)成功構(gòu)建了敲減IRF1-9的PK15細(xì)胞系，并檢測敲減IRF1-9的PK15細(xì)胞系與對照PK15細(xì)胞系相比感染PRV后對病毒增殖的影響以及對細(xì)胞炎性因子的影響，結(jié)果顯示敲減IRF1-9有助于病毒在細(xì)胞中的復(fù)制，抑制PRV誘導(dǎo)的IFN-β、ISG-15以及IL-6mRNA表達(dá)水平，證明IRF1-9是PRV在PK-15細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的宿主限制因子，在抑制病毒復(fù)制中發(fā)揮著重要作用。本研究為未來探究IRFs抗病毒機(jī)制提供了有力的細(xì)胞工具，進(jìn)而為今后的疫病防控及治療提供新的見解和應(yīng)對策略。

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（編輯 白永平）