摘 要： 旨在從健康海蘭褐雞腸道中分離鑒定乳酸菌，并研究其對(duì)育雛早期蛋雞腸道健康的影響。本研究采用細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)、16S rRNA測(cè)序和牛津杯擴(kuò)散法，分離、篩選、鑒定可產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株，檢測(cè)其對(duì)高溫、pH和膽鹽的耐受性；動(dòng)物試驗(yàn)選取240只1日齡健康、體重相近的海蘭褐雞，隨機(jī)分為4組，每組60只雞，包括對(duì)照組（C）、低劑量唾液乳桿菌CL09組（L）、中劑量唾液乳桿菌CL09組（M）和高劑量唾液乳桿菌CL09組（H），研究該乳酸菌菌株對(duì)育雛早期蛋雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)及腸道健康相關(guān)指標(biāo)的影響。試驗(yàn)周期為21 d。結(jié)果表明：分離菌為可產(chǎn)細(xì)菌素的革蘭陽性菌，結(jié)合16S rRNA鑒定結(jié)果將其命名為唾液乳桿菌CL09，該菌的無細(xì)胞上清液可抑制大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌的生長(zhǎng)。該菌的耐受溫度為60 ℃，具有耐酸、耐膽鹽的特性。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，灌服唾液乳桿菌CL09可以增加雛雞體重和免疫器官重量；H組十二指腸、空腸的隱窩深度變化最為顯著，L和M組十二指腸絨毛高度顯著增加，且H組十二指腸絨毛呈“波浪形”；M和H組腸道干細(xì)胞標(biāo)記基因Lgr5和Bmi1表達(dá)水平升高極顯著（P＜0.001）；H組的黏膜屏障基因Zo-1和Ocln的mRNA 表達(dá)水平升高極顯著（P＜0.01）；M組潘氏細(xì)胞標(biāo)記性基因Lyz的mRNA 表達(dá)水平最高。L、M和H組的杯狀細(xì)胞標(biāo)記基因Muc的mRNA 表達(dá)水平均升高，且差異極顯著（P＜0.01）。綜上所述，源自健康海蘭褐雞腸道的唾液乳桿菌CL09，通過促進(jìn)雛雞腸道干細(xì)胞分化為潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，增加絨毛高度，降低隱窩深度，從而增大腸道的黏膜面積。該菌具有調(diào)節(jié)育雛早期雞腸道健康的良好特性，可作為益生菌的備選菌株。

關(guān)鍵詞： 蛋雞；唾液乳桿菌；腸道健康；絨毛高度；隱窩深度

中圖分類號(hào)：S831

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：文獻(xiàn)標(biāo)志碼A 文章編號(hào)： 0366-6964（2024）09-4161-11

Isolation and Identification of a Chicken Source Lactobacillus salivary Strain and

Its Effect on Intestinal Health of Laying Hens in Early Brood Period

YU" Xiuju "HU" Yanjiao "LIU" Jiayue "WANG" Haidong "ZHU" Zhiwei2， FAN" Kuohai "WANG" Rongrong2， DUAN" Chenghao2， SHI" Jiawei2， YANG" Lihua1*

（1.College of Veterinary Medicine， Shanxi Agricultural University， Taigu 03080 ""China;

2.College of Life Sciences， Shanxi Agricultural University， Taigu 03080 ""China）

Abstract：" This experiment mainly aimed at isolating and identifying lactic acid bacteria from the gut of healthy Hyline brown laying hens， and detected the effect of the isolated lactic acid bacteria on intestinal health of laying hens in early brood period. Bacterial culture， 16S rRNA and Oxford Cup diffusion methods were used to isolate， screen and identify Lactobacillus strains that could producing bacteriocins. The tolerance to high temperature， pH and bile salt was assessed. Two hundred and forty healthy one-day-old Hyline brown laying hens with similar body weight were randomly divided into four groups： control group （C）， low dose Lactobacillus salivarius CL09 group （L）， medium dose Lactobacillus salivarius CL09 group （M） and high dose Lactobacillus salivarius CL09 group （H）. The effects of this strain on growth performance， immune organ index and intestinal health were analyzed. The experiment lasted for 21 days. The results showed that the isolated strain was a bacteriocin-producing Gram-positive bacteria， identified as Lactobacillus salivarius CL09 based on 16S rRNA identification. The cell-free supernatant of Lactobacillus salivarius CL09 demonstrated inhibitory effects on the growth of Escherichia coli， Salmonella， Staphylococcus aureus and Listeria. The resistant temperature of Lactobacillus salivarius CL09 was 60 ℃， and possessed the characteristics of acid and bile salt tolerance. The results of animal testing showed the Lactobacillus salivary CL09 supplementation could improved body weight and immune organ weight， with noticeable decreases in crypt depth of duodenum and jejunum observed in the H group， and significant increase in villus height of duodenum observed in L and M groups. The intestinal villi in the group H showed a wavy trend. Additionally， the mRNA levels of intestinal stem cell marker genes Lgr5 and Bmi1 were significantly increased in the M and H group（Plt;0.001）， while the mRNA level of mucosal barrier genes Zo-1 and Ocln was significantly increased in the H group（Plt;0.01）. Lactobacillus salivarius CL09 supplementation also led to the increasing of mRNA levels of Pan’s cell marker gene Lyz and goblet cell marker gene Muc （Plt;0.01）. In summary， Lactobacillus salivary CL09 isolated from the gut of healthy Hyline brown laying hens， has the potential to enhance villi length and crypt depth by promoting differentiation of intestinal stem cells into Paneth and goblet cells， thereby increasing the mucosal surface area in the intestine. Lactobacillus salivary CL09 exhibits favorable characteristics for regulating the intestinal health of chicks in the early brood period， and could be considered as a candidate probiotic strain.

Key words： laying hens; Lactobacillus salivarius; intestinal health; villus height; crypt depth

*Corresponding author： YANG Lihua，E-mail：13834526215@163.com

在飼料端“禁抗”的背景下，益生菌在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用引起了廣泛關(guān)注。益生菌作為一種對(duì)宿主健康有益的活性微生物制劑［1］，具有安全、綠色、無毒等優(yōu)點(diǎn)。其可以定殖于宿主腸道，改善宿主腸道微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)腸道健康和提高免疫防御能力，從而提高宿主的生產(chǎn)性能［2］。目前，在人類健康和動(dòng)物生產(chǎn)中應(yīng)用最多是乳酸菌［3］。唾液乳桿菌屬于乳桿菌屬，是一種可產(chǎn)細(xì)菌素的革蘭陽性細(xì)菌。唾液乳桿菌多數(shù)源于腸道和乳汁中，據(jù)目前的研究報(bào)道，唾液乳桿菌不僅具有調(diào)節(jié)腸道微生物菌群、產(chǎn)生短鏈脂肪酸抑制糞便酶活性從而使腸道發(fā)生酸化，且可產(chǎn)生抑制病原菌生長(zhǎng)的抗菌物質(zhì)、刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力［4］。

蛋雞的生命周期分為3個(gè)階段：育雛期、育成期和產(chǎn)蛋期，育雛早期是其腸道微生物定植和腸道發(fā)育的重要時(shí)期，維持促進(jìn)該階段的腸道健康對(duì)蛋雞生長(zhǎng)發(fā)育及其產(chǎn)蛋性能具有重大的意義［5-6］。腸道微生物分為自源微生物和外源微生物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，自源微生物由于其為該物種腸道本身所有，對(duì)宿主相對(duì)安全，而外源微生物可能會(huì)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，不利于宿主的健康［7-8］。因此，從宿主腸道中分離自源有益菌，使其成為本宿主物種的健康促進(jìn)劑具有重要的意義。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，在雞上已有較多關(guān)于益生菌對(duì)腸道健康影響的研究，但從宿主體內(nèi)篩選自源微生物并運(yùn)用于本品種動(dòng)物的研究報(bào)道相對(duì)較少。本研究以海蘭褐雞腸道內(nèi)容物和黏膜為益生菌分離源，分離、篩選并鑒定具有產(chǎn)細(xì)菌素特性的自源乳酸菌。并通過動(dòng)物試驗(yàn)分析所選菌株在育雛早期調(diào)節(jié)蛋雞生長(zhǎng)性能、免疫功能和腸道健康的作用。為其在蛋雞育雛早期腸道健康中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

指示菌株：大腸桿菌（Escherichia coli）CMCC 44102、沙門菌（Salmonella paratyphi A）CMCC（B） 50001-25、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003和李斯特菌（Listeria）ATCC19111均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

分離菌株：采取健康海蘭褐雞的糞便和腸黏膜刮取物，參照文獻(xiàn)［9］的方法進(jìn)行分離，按照0.2g·只－1用100 mL 生理鹽水將其制成混懸液，37℃孵育1 h，進(jìn)行10倍梯度稀釋后，將100 μL混懸液涂布于含2%碳酸鈣的MRS平板上，37℃培養(yǎng)24 h，根據(jù)溶鈣環(huán)、菌落形態(tài)和大小等特征，結(jié)合革蘭染色，挑選菌落并編號(hào)。劃線3～5次進(jìn)行純化，通過牛津杯擴(kuò)散法檢測(cè)菌株上清液對(duì)指示菌的抑菌活性。

通過抑菌活性的比較，獲得抑菌能力最佳的1個(gè)菌株，將其送至華大基因進(jìn)行16S rRNA 菌種鑒定。運(yùn)用NCBI的BLAST進(jìn)行核苷酸序列的同源性比對(duì)，通過Mega 11分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析分離菌株的同源性和菌種歸屬。

1.2 菌株的耐受性測(cè)定

過夜培養(yǎng)的菌液按2%體積比加入MRS培養(yǎng)基，置于40、50、60、70、80、90、100℃水浴鍋中加熱5 min后，37℃搖床培養(yǎng)16 h，檢測(cè)菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值（OD600值）。未經(jīng)水浴處理的菌液設(shè)為對(duì)照組，每個(gè)溫度5個(gè)重復(fù)。

菌株耐酸耐膽鹽測(cè)定：1 mL過夜培養(yǎng)的菌液離心，收集菌體，分別加入1 mL PBS、1 mL pH=3的PBS和含0.3%豬膽鹽的PBS中，重懸并37℃孵育2 h，離心重懸后按2%體積比加入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃，200 r·min－1培養(yǎng)16 h，測(cè)定其OD600值，按照酸或膽鹽處理組OD600/對(duì)照組OD600計(jì)算其相對(duì)存活率。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康、體重相近的240只1日齡海蘭褐雞購自山西佳博農(nóng)牧開發(fā)有限公司，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房中，采用3層籠養(yǎng)方式，自由采食和飲水。將其分為4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雞，包括對(duì)照組（C）、低劑量唾液乳桿菌CL09組（L）、中劑量唾液乳桿菌CL09組（M）和高劑量唾液乳桿菌CL09組（H）。L、M和H組每日分別灌服200 μL 2×107、2×108和2×109 CFU·mL－1唾液乳桿菌CL09，C組每日灌服200 μL無菌PBS，試驗(yàn)期21 d。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)期結(jié)束后，禁食過夜進(jìn)行解剖，每組隨機(jī)選取10只，共40只，按照NY/T 823—2004標(biāo)準(zhǔn)屠宰，稱取體重，測(cè)量脛骨長(zhǎng)；收集法氏囊和脾，進(jìn)行稱重和分析。分離十二指腸、空腸和回腸，各段腸管取中部2 cm，分段后部分固定于Bouins固定液中，用于腸組織切片制作和染色分析，部分凍存于液氮中，用于熒光定量PCR的分析；并收集空腸黏膜組織，置于EP管中，液氮冷凍，用于sIgA含量的測(cè)定。

1.5 生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)和sIgA的測(cè)定

樣品采集前，準(zhǔn)確稱重，并測(cè)量脛骨長(zhǎng)度；收集法氏囊、脾兩種免疫器官，稱取其濕重；按照sIgA ELISA試劑盒（上海源桔生物科技）的說明書測(cè)定各組空腸黏膜組織中的sIgA的含量。計(jì)算方法：以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度；再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的試劑濃度。

1.6 腸道形態(tài)學(xué)分析

Bouins固定液處理好的腸段進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋和切片，制成厚度為5 μm的石蠟切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining， HE）和阿利新藍(lán)-過碘酸雪夫（Alcian blue （AB） and Periodic acid Schiff （PAS） stain）染色，顯微鏡采集圖片，每組隨機(jī)選擇10張切片，每張切片5個(gè)視野，一個(gè)視野5～8根腸絨毛，通過Image J軟件對(duì)絨毛長(zhǎng)度（villus length，VH）、隱窩深度（crypt depth，CD）和杯狀細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行測(cè)定。

1.7 熒光定量PCR

根據(jù)TRIzol試劑說明書提取腸組織的總RNA，使用NanoDrop One （Gene Company Limited，Hong Kong， China）瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估總RNA的質(zhì)量和濃度。按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒將提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

利用Primer 5.0軟件或參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)熒光定量PCR所用引物，送至上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。Real-time PCR反應(yīng)體系為20μL：cDNA 2μL，TB Green PremixExTaq 10μL，每個(gè)引物0.8 μL，ROX 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，55 ℃ 退火10 s， 72℃ 延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。檢測(cè)Lgr5、Bmi1、Zo-1、Ocln、Lyz、Muc的mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為持家基因。采用2-ΔΔCT法計(jì)算檢測(cè)基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism 9.0 的One Way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“Mean±SEM” 表示。*、**、***、****分別代表P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001、P＜0.000 "表示數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 菌株的分離鑒定結(jié)果

從健康雞腸道中分離到多株有溶鈣環(huán)、乳白色、表面突起的菌株，經(jīng)革蘭染色，顯微鏡下觀察為藍(lán)紫色、桿狀的革蘭陽性菌。經(jīng)牛津杯擴(kuò)散法檢測(cè)其抑菌活性，篩選抑菌效果最佳的1株菌作為目的菌株。該菌落呈乳白色、表面光滑凸起，產(chǎn)酸且可與碳酸鈣反應(yīng)產(chǎn)生溶鈣環(huán)（圖1A）；革蘭染色呈藍(lán)紫色、短桿狀，單個(gè)或成對(duì)成鏈存在（圖1B）；該菌的無細(xì)胞上清液對(duì)沙門菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌的生長(zhǎng)具有抑制作用（圖1C～1F）。瓊脂糖電泳結(jié)果顯示其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1 465 bp，與預(yù)計(jì)大小一致，且將其16S rRNA序列上傳至NCBI，登錄號(hào)為：PP757798.1。進(jìn)化樹結(jié)果顯示：分離菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上與唾液乳桿菌為同一簇，且與唾液乳桿菌3168相似度高達(dá)99.31%（圖1G），表明分離菌株是唾液乳桿菌，將其命名為唾液乳桿菌CL09（Lactobacillus salivarius CL09），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為M20231713。

2.2 唾液乳桿菌CL09對(duì)高溫、pH和膽鹽的耐受性

唾液乳桿菌CL09在37～60℃溫度下生長(zhǎng)良好，但經(jīng)70℃處理5 min后，完全失活（圖2A）。該菌具有良好的耐酸和耐膽鹽活性，在pH=3.0條件下，相對(duì)存活率達(dá)到100%的存活率，在0.3%膽鹽濃度下，能達(dá)到79.58%存活率（圖2B）。

2.3 唾液乳桿菌CL09對(duì)育雛期蛋雞生長(zhǎng)性能、免疫器官指數(shù)和sIgA水平的影響

由表2可知，灌服唾液乳桿菌CL09的蛋雞體重（body weight，BW）、脛骨長(zhǎng)度（tibia length，TL）、免疫器官重量（immune organ weight，IOW）均呈升高的趨勢(shì)，但差異性不顯著（Pgt;0.05）。與對(duì)照相比，L組、M組和H組雛雞空腸黏膜組織中的sIgA滴度無變化。這表明，唾液乳桿菌CL09可能對(duì)雞的生長(zhǎng)和免疫力具有積極的促進(jìn)作用，但由于缺乏顯著的差異，需要進(jìn)一步試驗(yàn)來證實(shí)這一現(xiàn)象。

2.4 唾液乳桿菌CL09對(duì)育雛期蛋雞腸道形態(tài)和杯狀細(xì)胞數(shù)量的影響

灌服唾液乳桿菌CL09可提高雛雞十二指腸和空腸絨毛高度（圖3A～3H），且H組十二指腸的絨毛形態(tài)呈現(xiàn)“波浪形”。與對(duì)照組相比，L和M組十二指腸的絨毛高度增加顯著（Plt;0.05），H組十二指腸的絨毛高度增加不顯著（Pgt;0.05）；各試驗(yàn)組空腸絨毛高度增加差異不顯著（Pgt;0.05）。各試驗(yàn)組腸道隱窩深度均顯著降低（Plt;0.000 1）。這表明唾液乳桿菌CL09通過提高絨毛高度和降低隱窩深度使雞腸道面積增加，從而改善育雛早期蛋雞的腸道健康。

采用AB-PAS試劑盒對(duì)杯狀細(xì)胞進(jìn)行染色，結(jié)果顯示：M和H組的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于C組（Plt;0.05），L組與C組相比差異性不顯著（Pgt;0.05，圖4）。

2.5 唾液乳桿菌CL09對(duì)育雛期蛋雞腸道相關(guān)標(biāo)記基因相對(duì)表達(dá)量的影響

灌服不同劑量唾液乳桿菌CL09后，與對(duì)照組相比，除L組Lgr5的mRNA表達(dá)水平升高不顯著（Pgt;0.05）外，其余各試驗(yàn)組的Lgr5和Bmi1干細(xì)胞標(biāo)記基因 mRNA 表達(dá)水平升高差異極顯著（P＜0.00 圖5A和B）。各試驗(yàn)組黏膜屏障基因Zo-1和Ocln的 mRNA 表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，其中M和H組的Zo-1表達(dá)水平升高極顯著（P＜0.01），而L組差異性不顯著（Pgt;0.05，圖5C）；H組Ocln的mRNA 表達(dá)水平提高極顯著（P＜0.01），L和M組其表達(dá)量提高不明顯（Pgt;0.05，圖5D）；各試驗(yàn)組潘氏細(xì)胞標(biāo)記性基因Lyz的mRNA 表達(dá)水平提高均極顯著（P＜0.0001），但其在M組的表達(dá)量最高（圖5E）；各試驗(yàn)組杯狀細(xì)胞標(biāo)記基因Muc的mRNA 表達(dá)水平提高極顯著（P＜0.0 圖5F）。

3 討 論

根據(jù)細(xì)菌與其宿主的關(guān)系，腸道微生物菌群可分為自源性微生物和外源性微生物菌群兩類。大量研究報(bào)道證實(shí)：自源性微生物作為宿主固有的微生物菌群，通常不會(huì)引起宿主的不良免疫反應(yīng)，而外源性微生物通常可能引發(fā)宿主產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)［12］。與外源性菌株相比，來自宿主本身的分離菌更適于定殖和發(fā)揮改善腸道的作用［13］。研究表明，產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌在腸道中定殖更具優(yōu)勢(shì)，原因在于細(xì)菌素作為細(xì)菌的代謝產(chǎn)物之一，不僅可以有效抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，且是產(chǎn)生菌獲得生存優(yōu)勢(shì)的重要手段［14］。本研究從健康的海蘭褐雞腸道中分離到產(chǎn)細(xì)菌素的唾液乳桿菌CL09。據(jù)統(tǒng)計(jì)，唾液乳桿菌作為益生菌在家禽中的使用已有十余年，抑制有害菌的生長(zhǎng)是其特征之一，唾液乳桿菌 UCC118可以分泌細(xì)菌素 Abp118，它可以抑制各種病原菌的生長(zhǎng)［15］，熱滅活的唾液乳桿菌 CECT 5713可以抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)［16］，唾液乳桿菌LS01上清液對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制作用［17］。因此，唾液乳桿菌已被納入微生態(tài)制劑中，在實(shí)際應(yīng)用和生產(chǎn)中具有良好的發(fā)展和應(yīng)用前景。本研究中，唾液乳桿菌CL09對(duì)被測(cè)病原菌具有不同程度的抑制作用，其無細(xì)胞上清液對(duì)大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌的生長(zhǎng)均具有抑制作用，對(duì)沙門菌的抑制效果極顯著，其表現(xiàn)出對(duì)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌的拮抗性與其他研究人員的發(fā)現(xiàn)一致。

益生菌作為動(dòng)物腸道調(diào)節(jié)劑，其生產(chǎn)加工和臨床應(yīng)用，首先要考慮其熱穩(wěn)定性和耐酸、耐膽鹽的能力。一般家禽消化系統(tǒng)環(huán)境的pH=3.0～7.0，腸道膽鹽濃度為0.03%～0.3%［18］。唾液乳桿菌分別經(jīng)過40～100℃、pH=3、0.3%豬膽鹽處理后，發(fā)現(xiàn)唾液乳桿菌CL09可耐受60℃的溫度，具有良好的耐酸和耐膽鹽活性。這些優(yōu)良特性顯示唾液乳桿菌CL09在飼料加工、藥物治療等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

小腸是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要部位，小腸黏膜面積越大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率越高，腸道形態(tài)的變化影響腸道的消化和吸收，從而影響宿主的生產(chǎn)性能。腸道的吸收能力與腸絨毛的高度（VH）和隱窩深度（CD）有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，灌服唾液乳桿菌CL09的海蘭褐雞十二指腸和空腸的VH顯著升高，而CD顯著降低。VH增加和CD降低增加了腸道黏膜面積，有利用于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收。隱窩被認(rèn)為各類腸細(xì)胞“起源地”，隱窩底部的干細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞，新形成的細(xì)胞沿著隱窩壁向上遷移至絨毛，并進(jìn)一步分化成為具有生理機(jī)能的上皮細(xì)胞［19-20］。因此，VH/CD值越大，上皮細(xì)胞越多，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收就越高。這表明，唾液乳桿菌CL09通過提高小腸絨毛的高度和降低隱窩深度從而改善育雛早期蛋雞腸道形態(tài)。

腸黏膜屏障主要包括物理屏障、生物屏障和化學(xué)屏障，緊密連接蛋白（Occludin、zonula、occludens和Claudins）作為物理屏障的重要組成部分，與肌動(dòng)蛋白連接相鄰細(xì)胞以維持腸黏膜的完整性［21］，它們對(duì)黏膜損傷修復(fù)和腸道健康至關(guān)重要［22］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，唾液乳桿菌組Zo-1和Ocln的mRNA表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，特別是灌服高劑量唾液乳桿菌CL09后，其表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。結(jié)果顯示，唾液乳桿菌CL09具有調(diào)節(jié)雛雞腸上皮屏障的作用，其可能原因是唾液乳桿菌CL09的代謝產(chǎn)物促進(jìn)過氧化物酶體的增殖，激活相應(yīng)受體后上調(diào)了緊密連接蛋白的表達(dá)水平，從而增強(qiáng)腸道物理屏障［23］。這表明唾液乳桿菌CL09在維持和增強(qiáng)雛雞腸黏膜屏障的完整性方面發(fā)揮作用。

腸上皮細(xì)胞的自我更新依賴于位于隱窩底部不同區(qū)域的腸干細(xì)胞的增殖和分化。Lgr5細(xì)胞位于潘氏細(xì)胞之間［24］，Bmi1細(xì)胞位于腸隱窩內(nèi)附近，腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISCs）的激活狀態(tài)決定腸道上皮細(xì)胞的自我更新［25-27］。本研究顯示，灌服唾液乳桿菌CL09，育雛早期蛋雞表現(xiàn)Lgr5和Bmi1基因表達(dá)水平增加，同時(shí)各試驗(yàn)組潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞標(biāo)記基因Lyz和Muc的mRNA水平也增加。這可能是由于唾液乳桿菌CL09激活了Lgr5和Bmi1干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖分化形成轉(zhuǎn)運(yùn)放大細(xì)胞（transit amplifying，TA）細(xì)胞，TA細(xì)胞沿隱窩向上移動(dòng)，并分化為潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，潘氏細(xì)胞向下遷移到隱窩的基部，而杯狀細(xì)胞向上遷移到絨毛［28］。這表明唾液乳桿菌CL09在促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的自我更新和分化中發(fā)揮作用，從而增強(qiáng)雛雞的腸道健康。

4 結(jié) 論

從海蘭褐雞腸道中分離的唾液乳桿菌CL09，可維持和增強(qiáng)雛雞腸黏膜屏障的完整性，并通過促進(jìn)雛雞腸道干細(xì)胞分化為潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞，增加絨毛高度，降低隱窩深度，使腸道的黏膜面積增大，從而促進(jìn)雛雞腸道健康。

參考文獻(xiàn)（References）：

［1］ LUKIC J， JANCIC I， MIRKOVIC N， et al. Lactococcus lactis and Lactobacillus salivarius differently modulate early immunological response of wistar rats co-administered with Listeria monocytogenes［J］. Benef Microbes， 2017， 8（5）： 809-822.

［2］ WU Y， NIE C， LOU R， et al. Effects of multispecies probiotic on intestinal microbiota and mucosal barrier function of neonatal calves infected with E. coli K99［J］. Front Microbiol， 2022， 12： 813245.

［3］ MOKOENA MP. Lactic acid bacteria and their bacteriocins： classification， biosynthesis and applications against uropathogens： a mini-review［J］. Molecules， 2017， 22（8）： 1255.

［4］ WEI Z， HE Z， WANG T， et al. Lactobacillus salivarius WZ1 inhibits the inflammatory injury of mouse jejunum caused by enterotoxigenic Escherichia coli K88 by regulating the TLR4/NF-κB/MyD88 inflammatory pathway and gut microbiota［J］. Microorganisms， 2023， 11（3）： 657.

［5］ SUJATHA T， ABHINAYA S， SUNDER J， et al. Efficacy of early chick nutrition with aloe vera and azadirachta indica on gut health and histomorphometry in chicks［J］. Vet World， 2017， 10（6）： 569-573.

［6］ 李 鐵， 齊夢(mèng)迪， 張克英，等. 育雛育成期飼糧添加益生菌對(duì)蛋雞生長(zhǎng)性能、血清指標(biāo)、腸道健康及后續(xù)生產(chǎn)性能的影響［J/OL］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2024， 1-16.

LI T， QI MD， ZHANG KY， et al. Effects of dietary probiotics during brood-rearing period on growth performance， serum biochemistry， intestinal health and subsequent performance of laying hens［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica， 2024， 1-16.

［7］ RANJITKAR S， LAWLEY B， TANNOCK G， et al. Bacterial succession in the broiler gastrointestinal tract［J］. Appl Environ Microbiol， 2016， 82（8）： 2399-2410.

［8］ YAMASHITA MM， FERRAREZI JV， PEREIRA GDV， et al. Autochthonous vs allochthonous probiotic strains to Rhamdia quelen［J］. Microb Pathog， 2020， 139： 103897.

［9］ XU C， WEI F， YANG X， Feng Y， et al. Lactobacillus salivarius CML352 isolated from Chinese local breed chicken modulates the gut microbiota and improves intestinal health and egg quality in late-phase laying hens［J］. Microorganisms， 2022， 10（4）： 726.

［10］ ZHAO X， YANG J， JU Z， et al. Clostridium butyricum ameliorates Salmonella Enteritis induced inflammation by enhancing and improving immunity of the intestinal epithelial barrier at the intestinal mucosal level［J］. Front Microbiol， 2020， 11： 299.

［11］ 劉慧娟， 王 超， 周斌斌， 等. 飼糧中添加蘆丁對(duì)肉雞回腸形態(tài)、免疫、抗氧化及屏障功能的影響［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（2）： 630-641.

LIU HJ， WANG C， ZHOU BB， et al. Effects of dietary rutin supplementation on ileal morphology， immunity， antioxidant and barrier function of broilers［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinia， 2023， 54（2）： 630-641. （in Chinese）

［12］ FULLER R. Nature of the determinant responsible for the adhesion of lactobacilli to chicken crop epithelial cells［J］. J Gen Microbiol， 1975， 87（2）： 245-250.

［13］ LIN WC， PTAK CP， CHANG CY， et al. Autochthonous Lactic acid bacteria isolated from dairy cow feces exhibiting promising probiotic properties and in vitro antibacterial activity against foodborne pathogens in cattle［J］. Front Vet Sci， 2020，7：239.

［14］ 張 軍，王 祺，湯 偉，等. 細(xì)菌素對(duì)產(chǎn)生菌獲得生存優(yōu)勢(shì)及其誘導(dǎo)合成條件的研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)通報(bào)， 2020， 47 （3）： 923-932.

ZHANG J， WANG Q， TANG W， et al. Bacteriocinogeny， the way to acquire survival advantages through biosynthetic regulation： a review［J］. Microbiology China， 2020， 47（3）： 923-932 （in Chinese）

［15］ CORR SC， LI Y， RIEDEL CU， et al. Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2007，104（18）：7617-7621.

［16］ SANUDO AI， LUQUE R， DLAZ-ROPERO MP， et al. In vitro and in vivo anti-microbial activity evaluation of inactivated cells of Lactobacillus salivarius CECT 5713 against Streptococcus mutans［J］. Arch Oral Biol， 2017， 84： 58-63.

［17］ DRAGO L， DE VECCHI E， GABRIELI A， et al. Immunomodulatory effects of Lactobacillus salivarius LS01 and Bifidobacterium breve BR03， alone and in combination， on peripheral blood mononuclear cells of allergic asthmatics［J］.Allergy Asthma Immunol Res， 2015， 7（4）： 409-413.

［18］ 趙世義. 羅伊氏乳桿菌調(diào)控雛雞腸黏膜屏障機(jī)制的研究［D］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

ZHAO SY. Study of the mechanism of Lactobacillus reuteri on regulating intestinal mucosal barrierinchick［D］. Nanjing Agricultural University， 2019.

［19］ SHOKRYAZDAN P， FASELEH JAHROMI M， LIANG JB， et al. Effects of a Lactobacillus salivarius mixture on performance， intestinal health and serum lipids of broiler chickens［J］. PLoS One， 2017， 12（5）： e0175959.

［20］ MOHAMMADI ZIARAT M， KERMANSHAHI H， NASIRI MOGADDAM H， et al. Performance of an Escherichia coli phytase expressed in Lactococcus lactis on nutrient retention， bone traits and intestinal morphology in broiler chickens［J］. J Anim Physiol Anim Nutr （Berl）， 2020， 104（3）： 909-917.

［21］ GAO X， MIAO R， TAO Y， et al. Effect of montmorillonite powder on intestinal mucosal barrier in children with abdominal Henoch-Schonlein purpura： a randomized controlled study［J］. Medicine （Baltimore）， 2018， 97（39）： e12577.

［22］ ODA H， TAKEICHI M. Evolution： structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction［J］. J Cell Biol， 201 "193（7）： 1137-1146.

［23］ KUO WT， ODENWALD MA， TURNER JR， ZUO L. Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival［J］. Ann N Y Acad Sci， 2022， 1514（1）： 21-33.

［24］ SATO T， VAN ES JH， SNIPPERT HJ， et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts［J］. Nature， 201 "469（7330）： 415-418.

［25］ HOU Q， JIA J， LIN J， et al. Bacillus subtilis programs the differentiation of intestinal secretory lineages to inhibit Salmonella infection［J］. Cell Rep， 2022， 40（13）： 111416.

［26］ MEI X， GU M， LI M. Plasticity of Paneth cells and their ability to regulate intestinal stem cells［J］. Stem Cell Res Ther， 2020， 11（1）： 349.

［27］ 陳奡蕾， 黃德如， 安婭菲， 等. 動(dòng)物腸類器官培養(yǎng)技術(shù)［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 2023， 54（7）： 2743-275.

CHEN AL， HUANG DR， AN YF， et al. Animal intestinal organoids culture［J］. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinia， 2023， 54 （7）： 2743-2750. （in Chinese）

［28］ GEHART H， CLEVERS H. Tales from the crypt： new insights into intestinal stem cells［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2019， 16（1）： 19-34.

（編輯 范子娟）