［摘要］目的構建穩(wěn)定的腸屏障損傷高尿酸血癥小鼠模型。

方法采用不同濃度腺嘌呤（Ade）和氧嗪酸鉀（PO）灌胃小鼠，分別在第3、7、14和21天檢測血清尿酸、尿素氮、肌酐水平和腸滲透性，檢測空腸、回腸和結腸中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達。

結果高濃度的Ade和PO導致小鼠尿酸升高（F=25.453～518.039，P<0.01）、體質量降低（F=6.900～43.724，P<0.05）。50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7 d導致小鼠尿酸升高（P<0.05），可持續(xù)升高至21 d（P<0.05），同時腸滲透性升高（F=28.563～185.808，P<0.05）并與尿酸水平呈正相關性（r=0.876 9，P<0.05）。與正常小鼠相比，Occludin和ZO-1在高尿酸血癥小鼠回腸和結腸中表達降低（t=3.164、3.678，P<0.05），Claudin-1在空腸中表達降低（t=2.670，P<0.05）。

結論采用50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7 d可構建腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型。

［關鍵詞］高尿酸血癥；腸；容積滲克分子濃度；疾病模型，動物

［中圖分類號］R589.9；R322.45

［文獻標志碼］A

［文章編號］2096-5532（2024）04-0508-05doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.121

［開放科學（資源服務）標識碼（OSID）］

［網絡出版］https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20240829.1158.003;2024-08-3107：00：03

Establishment of a mouse model of hyperuricemia with intestinal barrier injury

ZHU Xianju， LUQiulan， HU Heming（Laboratory Department of Qingdao Eighth People’s Hospital， Qingdao 266000， China） ; ［Abstract］ObjectiveTo establish a stable mouse model of intestinal barrier injury induced by hyperuricemia.

Methods

The mice were given different concentrations of adenine （Ade） and potassium oxazinate （PO） by gavage， and serum uric acid， urea nitrogen， creatinine， and intestinal permeability were measured on days 3， 7， 14， and 21. The expression levels of tight junction proteins Occludin， ZO-1， and Claudin-1 in the jejunum， ileum， and colon were measured.

ResultsThe high concentrations of Ade and PO induced a significant increase in uric acid （F=25.453-518.039，P<0.01） and a significant reduction in body weight （F=6.900-43.724，P<0.05）. Administration of 50 mg/kg Ade and 125 mg/kg PO by gavage for 7 consecutive days induced a significant increase in uric acid （P<0.05）， which continued to rise until day 21 （P<0.05）， and there was also a significant increase in intestinal permeability （F=28.563-185.808，P<0.05）， which was positively correlated with the level of uric acid （r=0.876 9，P<0.05）. Compared with normal mice， the mice with hyperuricemia had significant reductions in the expression levels of Occludin and ZO-1 in the ileum and the colon （t=3.164，3.678;P<0.05）， as well as a significant reduction in the expression level of Claudin-1 in the jejunum （t=2.670，P<0.05）.

ConclusionAdministration of 50 mg/kg Ade and 125 mg/kg PO by gavage for 7 consecutive days can establish a mouse model of hyperuricemia with intestinal barrier injury.

［Key words］hyperuricemia; intestines; osmolar concentration; disease models， animal

高尿酸血癥是一種常見的代謝性疾病，除導致痛風外，高尿酸血癥還被認為是代謝綜合征和心血管疾病的風險因素之一[1-2]?；蚯贸夹g是構建高尿酸血癥模型的一種重要手段，通過CRISPR/Cas9技術敲除與尿酸代謝或尿酸排泄相關的基因（如尿酸酶UOX基因、尿酸轉運蛋白SLC2A9基因等）可構建穩(wěn)定的高尿酸血癥模型[3-5]。但基因敲除構建的高尿酸血癥小鼠模型常存在不易繁殖、死亡率高等問題。藥物誘導主要采用一些尿酸合成酶抑制劑或尿酸排泄抑制劑例如氧嗪酸鉀（PO）等藥物構建高尿酸血癥模型，飲食誘導主要采用提供高嘌呤飲食或補充尿酸前體物[6]。單一的藥物或者飲食可以快速升高尿酸水平，但不能長期維持。目前常聯(lián)合使用PO和腺嘌呤（Ade）構建高尿酸血癥模型[7-8]。但目前大部分研究構建的高尿酸血癥模型為大鼠模型，采用藥物誘導構建高尿酸血癥小鼠模型的研究較少。腸道在維持體內代謝平衡和免疫系統(tǒng)調控中起著至關重要的作用[9]。腸屏障損傷被認為與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[10-12]。建立一種穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，并研究其腸屏障的變化及機制對于研究高尿酸血癥的發(fā)病機制和尋找潛在的治療途徑具有重要意義。本研究構建一種穩(wěn)定的腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型，研究腸道與高尿酸血癥之間的關系，為未來該病的治療開辟新的道路。

1材料與方法

1.1實驗動物

C57BL/6J品系雄性小鼠（6周齡左右）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠被飼養(yǎng)在青島大學附屬醫(yī)院動物實驗中心的SPF級動物房中，可自由獲取水和食物。在適應性飼養(yǎng)（正常飲食和正常飲水）1周后，開始進行實驗處理。所有實驗操作均符合動物實驗倫理要求，并且獲得青島大學附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會批準（AHQU-MAL2018-079）。

1.2高尿酸血癥小鼠模型構建

采用Ade和PO灌胃的方式構建高尿酸血癥小鼠模型。將小鼠隨機分為6組，每組6只，分別接受以下處理。正常組（Con組）：C57BL/6J小鼠接受正常標準飲食，并灌胃同實驗組等體積的5 g/L羧甲基纖維素鈉；高尿酸血癥第1組（100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO）：每天灌胃100 mg/kg Ade和500 mg/kg PO；高尿酸血癥第2組（50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO）：每天灌胃50 mg/kg Ade和250 mg/kg PO；高尿酸血癥第3組（50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO （2 d））：每2 d灌胃1次，每次灌胃50 mg/kg Ade和250 mg/kg PO；高尿酸血癥第4組（25 mg/kg Ade+125 mg/kg PO）：每天灌胃25 mg/kg Ade和125 mg/kg PO；高尿酸血癥第5組（50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO）：每天灌胃50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO。PO溶解于5 g/L羧甲基纖維素鈉中。實驗過程中，相對于正常組，當小鼠體質量下降了10%～15%時，終止實驗。21 d后，小鼠被安樂處死，收集血清及空腸、回腸和結腸組織，保存于-80 ℃低溫冰箱中。

1.3尿酸、肌酐和尿素氮的檢測

分別于灌胃后的第3、7、14和21天，小鼠禁食過夜，采集其血液，以3 500 r/min離心5 min，收集血清。使用全自動生化分析儀檢測血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平。

1.4小鼠腸滲透性檢測

使用異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖（FD4）測定小鼠的腸道通透性。所有小鼠禁水4 h以后，灌胃400 mg/kg體質量的FD4，并在4 h后采集其血液。使用多功能酶標儀測量血清中FD4的熒光強度，檢測的激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為528 nm。根據(jù)標準曲線計算出FD4濃度，F(xiàn)D4濃度代表腸滲透性的大小。

1.5RNA的提取及反轉錄

加入總RNA抽提試劑Trizol后，將結腸組織研磨成勻漿液，加入氯仿，混勻，離心取上清液，加入同體積異丙醇，離心，棄上清液，用體積分數(shù)0.75乙醇洗滌3次，沉淀為總RNA。使用QuickDrop超微量紫外可見分光光度儀測定RNA濃度及純度。反轉錄體系：All-In-One 5×RT Master Mix 4 μL，總 RNA 5 μL，無核酶水11 μL。以上反應體系混合均勻，于37 ℃ 15 min、60 ℃ 10 min、95 ℃ 3 min條件下反應，反轉錄產物為cDNA。

1.6熒光定量PCR

熒光定量PCR反應體系：BlasTaq 2×qPCR MM 10.0 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物 0.5 μL，cDNA 2.0 μL，無核酶水17.0 μL。反應條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。引物序列見表1。

1.7統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。定量數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)的比較采用兩獨立樣本比較的t檢驗；多組均數(shù)隨時間變化比較采用重復測量方差分析，兩兩比較采用Tukey檢驗。相關性檢驗采用Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1Ade和PO誘導的高尿酸血癥小鼠的體質量變化當采用100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO和

50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO誘導時，分別在第3、7天時小鼠體質量減少量低于正常小鼠體質量的20%，終止該組實驗。重復測量的方差分析顯示，F(xiàn)濃度=12.723，P＜0.001；F時間=8.375，P＜0.001；F濃度*時間=9.071，P＜0.001。灌胃之前和灌胃第3、7天時，各組小鼠體質量之間差異無統(tǒng)計學意義（F=0.037～2.245，P＞0.05）。第14天時，不同濃度處理組小鼠體質量之間的差異具有統(tǒng)計學意義（F=6.901，P＜0.05），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠體質量顯著低于正常組（P<0.01）。建模第21天時，不同濃度處理組小鼠體質量比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=43.724，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠體質量顯著低于正常組（P<0.01）。見圖1。

2.2Ade和PO誘導的高尿酸血癥小鼠尿酸變化

重復測量方差分析結果顯示，F(xiàn)濃度=159.443，P＜0.001；F時間=107.273，P＜0.001；F濃度*時間=99.518，P＜0.001。灌胃第3天時，各組小鼠的尿酸差異無統(tǒng)計學意義（F=3.034，P>0.05）。第7天時，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計學意義（F=25.453，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平顯著高于正常組（P<0.01）。在第14天時，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計學意義（F=518.039，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平高于正常組（P<0.01）。第21天時，各組小鼠的尿酸水平差異有統(tǒng)計學意義（F=232.211，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠尿酸水平高于正常組（P<0.01）。100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO組和50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO組小鼠尿酸水平從第3天開始高于正常組小鼠（P<0.01）。見圖2。

2.3Ade和PO誘導的高尿酸血癥小鼠尿素氮和肌酐的變化

重復測量方差分析顯示，肌酐、尿素氮F濃度=123.244、97.092，P＜0.001；F時間=64.808、36.101，P＜0.001；F濃度*時間=11.924、13.130，P＜0.001。第3天時，正常組、50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO（2 d）、 50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO及25 mg/kg Ade+125 mg/kg PO各組小鼠的肌酐、尿素氮差異無統(tǒng)計學意義（F=2.2390、1.569，P>0.05）。采用100 mg/kg Ade+500 mg/kg PO及50 mg/kg Ade+250 mg/kg PO灌胃誘導的高尿酸血癥小鼠血清肌酐、尿素氮水平在第3天時均高于正常組小鼠（P<0.01）。在第7天時，各組小鼠肌酐、尿素氮的差異具有統(tǒng)計學意義（F=77.675、47.127，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導的高尿酸血癥小鼠肌酐和尿素氮顯著高于正常小鼠（P<0.01）。第14天時，各組小鼠肌酐、尿素氮比較差異具有統(tǒng)計學意義（F=48.469、44.953，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導的高尿酸血癥小鼠肌酐和尿素氮高于正常小鼠（P<0.01）。第21天時，各組小鼠肌酐、尿素氮的差異有統(tǒng)計學意義（F=55.872、80.966，P<0.01），50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO誘導的高尿酸血癥小鼠肌酐、尿素氮水平高于正常小鼠（P<0.01）。見圖3A、B。

A：不同濃度Ade和PO灌胃第3、7、14和21天時小鼠血清肌酐變化；B：不同濃度Ade和PO灌胃第3、7、14和21天時小鼠血清尿素氮變化。與正常組比較，**P<0.01。

2.4Ade和PO誘導的高尿酸血癥小鼠腸滲透性變化

重復測量方差分析顯示，F(xiàn)濃度=172.161，P＜0.001；F時間=49.938，P＜0.001；F濃度*時間=36.387，P＜0.001。在第3天時，兩組小鼠腸滲透性的差異無統(tǒng)計學意義（F=2.310，P>0.05）；第7、14、21天時，兩組小鼠腸滲透性的差異均有統(tǒng)計學意義（F=28.563～185.808，P<0.01）。見圖4A。腸滲透性與血清尿酸水平呈正相關性（r=0.876 9，P<0.01）。見圖4B。

2.5高尿酸血癥小鼠緊密連接蛋白表達變化

在空腸中，與正常組相比，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Claudin-1的表達量降低（t=2.670，P=0.016），見圖5A。在回腸中，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Occludin和ZO-1的表達量低于正常組（t=3.164、3.678，P<0.01）。見圖5B。在結腸中，50 mg/kg Ade+125 mg/kg PO組小鼠Occludin和ZO-1的表達量低于正常組（t=9.040、13.215，P<0.01）。見圖5C。

A：50 mg/kg Ade和125 mg/kg PO誘導的高尿酸血癥小鼠腸滲透性變化；B：血清尿酸水平與腸滲透性的相關性分析。與正常組比較，**P<0.01。

A：空腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達；B：回腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達；C：結腸組織Occludin、ZO-1、Claudin-1基因的表達。

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖5高尿酸血癥小鼠緊密連接蛋白表達變化

3討論

本研究結果顯示，50 mg/kg的Ade及125 mg/kg的PO連續(xù)灌胃7 d可成功構建高尿酸血癥小鼠模型，高尿酸水平可持續(xù)至21 d。伴隨著尿酸的升高，腸滲透性也升高并與尿酸水平呈正相關。緊密連接蛋白Occludin和ZO-1在回腸和結腸中表達降低，Claudin-1在空腸中表達降低，表明緊密連接蛋白參與調控高尿酸血癥小鼠腸滲透性。高尿酸血癥是由于尿酸產生增多或排泄減少而引起的一種代謝性疾病，除了引起痛風外，還與糖尿病、高血壓、動脈粥樣硬化等多種代謝性疾病的發(fā)生密切相關[13]。構建合適的高尿酸血癥模型對研究高尿酸血癥及相關的并發(fā)癥具有重要意義。目前，高尿酸血癥模型主要分為基因修飾和環(huán)境誘導的高尿酸血癥模型。高尿酸血癥大鼠模型構建的研究較多[7，14-16]，但對高尿酸血癥小鼠模型構建的研究較少。且在不同的研究中，不同的抑制劑用量、誘導期、給藥方法導致所得模型實際上無法進行比較[17-19]。

腸屏障損傷被認為與多種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關[20]。建立一種腸屏障損傷的高尿酸血癥小鼠模型對于深入研究高尿酸血癥的發(fā)病機制和尋找潛在的治療途徑具有重要的意義。本研究結果顯示，隨著尿酸濃度的升高，模型小鼠腸滲透性也不斷增高，腸滲透性和尿酸水平呈正相關，與鄒通等[21-22]研究的尿酸酶基因敲除的高尿酸血癥小鼠類似，均現(xiàn)腸屏障損傷。腸屏障損傷可能是尿酸升高的重要影響因素[23]。腸滲透性增加可導致腸道

菌群及有害代謝產物通過腸屏障進入循環(huán)系統(tǒng)，進而進入各個靶器官，增加系統(tǒng)性炎癥反應，引起各種代謝性疾病的發(fā)生[24]。緊密連接蛋白在維持腸屏障功能中起著重要的作用，緊密連接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1的表達降低會導致腸屏障損傷、腸滲透性增加。

綜上所述，采用50 mg/kg Ade及125 mg/kg PO連續(xù)灌胃7d可構建穩(wěn)定的高尿酸血癥小鼠模型，模型小鼠尿酸水平可持續(xù)升高至21 d，同時伴隨著腸屏障損傷，其腸滲透性與尿酸水平呈正相關。

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（本文編輯周曉彬）