摘要 本研究以2019～2023 年份收獲的稻谷為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法對稻谷的揮發(fā)性成分進行檢測，結(jié)合標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫及保留指數(shù)建立選擇離子監(jiān)測方法，通過內(nèi)標法計算各個組分的含量。采用主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析對揮發(fā)性化合物進行多元統(tǒng)計分析，篩選出與稻谷新鮮度相關(guān)的差異化合物，建立了基于揮發(fā)性成分分析的儲藏稻谷鑒別模型。在不同年份收獲的稻谷樣本中共檢出44 種揮發(fā)性化合物，包括醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、酚類和呋喃等。多元統(tǒng)計分析結(jié)果表明，根據(jù)揮發(fā)性化合物含量建立的正交偏最小二乘法判別分析模型， 2023 年收獲的稻谷與2019～2022 年收獲的稻谷可顯著區(qū)分為兩類，進一步基于變量重要性投影（VIP）值大于1 和單因素分析p 值小于0.05，確定己酸和壬酸等12 種化合物為差異化合物。本研究提出的基于揮發(fā)性成分分析的儲藏稻谷分類模型可為稻谷新陳度判定提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 稻谷；揮發(fā)性成分；氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜；多元統(tǒng)計分析；分類模型

稻谷是我國三大主要糧食作物之一，富含碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，是人體所需能量和多種營養(yǎng)素的重要來源。稻谷的儲藏是我國國家糧食安全的重要組成部分。儲藏期間，稻谷的代謝活動仍在進行，其呼吸作用趨于平穩(wěn)，營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗[1-2]。受收獲時水分含量、運輸條件以及儲藏期間溫度、濕度、酶、蟲害和微生物等多種因素影響，稻谷在儲藏過程中物理化學(xué)性質(zhì)不斷發(fā)生改變[3-4]。其中，稻谷籽粒內(nèi)部的脂質(zhì)將會水解和氧化生成脂肪酸和醛酮類物質(zhì)，蛋白質(zhì)將會水解產(chǎn)生游離氨基酸，導(dǎo)致稻谷產(chǎn)生酸味和陳味[5-6]。此外，隨著儲藏時間的進一步延長，稻谷的生活力和發(fā)芽率下降、細胞膜通透性增加，代謝的有毒害產(chǎn)物逐漸積累，同時籽粒組織硬化，柔性與韌性變?nèi)酰l(fā)生糊化及吸水率降低。上述物理化學(xué)變化造成稻谷食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值下降，產(chǎn)生陳化現(xiàn)象，嚴重威脅國家糧食安全[7]。因此，研究儲藏稻谷新陳度的分析方法，對保障稻谷儲藏品質(zhì)和節(jié)糧減損具有重要意義。

研究表明，儲藏期間稻谷的多種理化指標均發(fā)生不同程度的變化[8-9]。雷玲等[10]采用人工控制溫度和濕度的方法模擬稻谷陳化，并對儲藏期間水分、發(fā)芽率、脂肪酸值、降落數(shù)值、糊化特性、食用品質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)進行分析，探討了各指標與稻谷儲藏品質(zhì)的相關(guān)性。周顯青等[11]以儲藏稻谷為原料，通過測定脂肪酸值、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、丙二醛含量、巰基含量、電導(dǎo)率和發(fā)芽率，分析了各指標的品質(zhì)變化及差異性。黃象鵬等[8]以實倉中不同倉儲時間的早秈稻為研究對象，將檢測指標范圍進一步擴大至淀粉、蛋白質(zhì)及揮發(fā)性成分的測定。此外，王鄧琳等[9]通過加速陳化方式模擬稻谷儲藏，并對富硒稻谷的α-淀粉酶活力、脂肪酶活動度、游離酚含量、糊化特性、質(zhì)構(gòu)特性和食味值進行分析。程曉雨等[12]對稻谷樣本以及儲藏一年后的稻谷樣本進行代謝組學(xué)研究，探討儲藏對稻谷代謝產(chǎn)物的影響。上述理化指標中，揮發(fā)性成分測定的前處理過程相對簡單，在儲藏稻谷品質(zhì)現(xiàn)場實時分析中有較大的應(yīng)用潛力。目前已報道的稻谷相關(guān)揮發(fā)性化合物已超過300 種[13]，包括烴類、醛類、酮類、酯類、酸類、醇類以及雜環(huán)類等[14]，研究人員通過同時蒸餾萃取[15]、超臨界流體萃取[16]、溶劑輔助風(fēng)味萃取[17]和頂空固相微萃?。℉eadspace solid phase microextraction， HS-SPME）[18]等方法對稻谷中的揮發(fā)性成分進行富集。其中， HS-SPME 方法操作簡單、無需提取溶劑、不易受外界物質(zhì)干擾且靈敏度較高，可與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合對含量較低、揮發(fā)性較弱的物質(zhì)進行分離分析，已成為稻谷揮發(fā)性成分檢測的有效手段。

本研究以2019～2023 年收獲的稻谷為研究對象，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Headspace solid phase microextraction-gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry， HSSPME-GC-MS/MS）對其揮發(fā)性成分進行定性和定量分析，結(jié)合主成分分析（Principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal partial least squares discriminant analysis， OPLS-DA）等多元統(tǒng)計分析方法，篩選出新陳稻谷中存在的差異性成分，以期為構(gòu)建基于揮發(fā)性成分的稻谷新陳度鑒別模型提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GC8890-7010BMS/MS 氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀、PAL3 多合一自動進樣器和DVB/CarbonWR/PDMS 固相微萃取纖維（美國安捷倫公司）；SQP 電子天平（感量0.0001 g， 德國賽多利斯公司）；20 mL 頂空樣品瓶和開孔頂空磁性金屬蓋（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

2，4，6-三甲基吡啶（98%，上海吉至生化科技有限公司）；二氯甲烷（色譜純，≥99.9%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；正己烷（色譜純，≥99.9%，北京百靈威科技有限公司）。稻谷籽粒樣品共41 份，分別于2019～2023 年采集后置于4 ℃低溫庫中保存，產(chǎn)地包括黑龍江省、河南省、江西省和安徽省，其中， 2019 年5 份， 2020 年5 份， 2021 年8 份， 2022 年8 份， 2023 年15 份。

1.2 實驗方法

1.2.1 固相微萃取條件

稱取5.00 g 稻谷樣品于20 mL 頂空瓶中，加入10 μL 5 μg/mL 的2，4，6-三甲基吡啶后立即密封，置于自動進樣盤上；固相微萃取頭于260 ℃預(yù)老化3 min， 樣品瓶于50 ℃平衡10 min， 以250 r/min 速度振搖萃取80 min；將萃取頭自動轉(zhuǎn)移至氣相色譜進樣口中，于250 ℃解吸4 min， 然后在260 ℃將萃取頭老化10 min。

1.2.2 色譜條件

DB-Wax UI 毛細管柱（60.0 m×0.25 mm， 0.25 μm）， 進樣口溫度為250 ℃。升溫程序如下：40 ℃保持5 min；以3 ℃/min 升溫至230 ℃， 保持15 min；230 ℃運行5 min。載氣為高純氦氣，流速1.00 mL/min。進樣方式為不分流進樣。

1.2.3 質(zhì)譜條件

電子轟擊電離源（Electron impact ionization， EI），電子能量為70 eV；離子源溫度為230 ℃， 四極桿溫度為150 ℃；數(shù)據(jù)采集方式為全掃描（Scan）和選擇離子監(jiān)測（Selective ion monitoring， SIM）；質(zhì)量掃描范圍為m/z 33～550；溶劑延遲15 min；參考譜庫為NIST 20.0 標準質(zhì)譜庫和安捷倫香味物質(zhì)數(shù)據(jù)庫。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理方法

定性分析首先采用Mass Hunter 工作站對樣品的總離子流圖進行峰識別和峰提取，根據(jù)C7～C40 正構(gòu)烷烴混合標準品的保留時間數(shù)據(jù)按公式（1）計算化合物的保留指數(shù)（Retention index， RI），通過比對NIST 20.0 標準質(zhì)譜庫中的化合物質(zhì)譜圖、特征離子信息、相似度匹配值和RI，對檢出的化合物進行篩查和定性分析[19]。

RI x = 100 + 100 ×（"RT（x）×RT（n）/"RT（ n+1） + RT （n"）" ）

其中， RI（x）是化合物x保留指數(shù)， n 是保留時間在化合物x 之前的正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù)， RT（x）是化合物x 的保留時間， RT（n）是碳原子數(shù)為n 的正構(gòu)烷烴的保留時間， RT（n+1）是碳原子數(shù)為n+1 的正構(gòu)烷烴的保留時間。

定量分析 通過優(yōu)化化合物前級離子建立SIM 方法，以2，4，6-三甲基吡啶為內(nèi)標物質(zhì)，采用峰面積比值歸一化法計算稻谷中檢出的各種揮發(fā)性組分的相對含量[20]：

Cx＝ C0× V0× Ax/"A0" ×m

其中， Cx 為檢出物含量（μg/kg）， C0 為內(nèi)標物濃度（μg/mL）， V0 為內(nèi)標體積（μL）， Ax 為檢出物的色譜峰面積， A0 為內(nèi)標物的色譜峰面積， m 為樣品質(zhì)量（g）。

數(shù)據(jù)分析 通過峰積分獲得各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的保留時間并計算保留指數(shù)和相對含量，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至Microsoft Excel 2019 軟件進行數(shù)據(jù)處理；通過Chiplot（https：//www.chiplot.online/）繪制化合物分類圖；采用Origin 2019 軟件繪制柱狀圖；利用SIMCA 14.1 軟件進行多元統(tǒng)計分析，計算預(yù)測變量重要性投影（Variable importance in projection， VIP），以VIPgt;1、單因素分析plt;0.05 為條件篩選差異化合物，建立稻谷新陳度的鑒別模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 稻谷中揮發(fā)性成分檢測

采用HS-SPME-GC-MS/MS 對稻谷中的揮發(fā)性成分進行非靶向分析（圖1），并對檢出的揮發(fā)性化合物進行未知物識別，以去除非呈味的烷烴和烯烴等物質(zhì)。通過與NIST 20.0 標準質(zhì)譜庫對照并結(jié)合計算RI進行定性分析，從41 個稻谷樣品中共鑒定出44 種揮發(fā)性化合物，結(jié)果見表1。通過條件優(yōu)化確定最佳樣品用量為5.00 g、SPME 溫度為50 ℃、SPME 時間為80 min、解吸時間為4 min；依據(jù)化合物的特征前級離子信息建立稻谷揮發(fā)性成分的SIM 分析方法。

2.2 稻谷儲藏過程中揮發(fā)性成分變化規(guī)律分析

稻谷中各類揮發(fā)性成分分布如圖2A 所示，可知鑒定出的揮發(fā)性化合物可分為7 類，包括15 種醛類化合物、11 種醇類化合物、7 種酮類化合物、5 種酸類化合物、3 種酯類化合物、2 種酚類化合物和1 種呋喃類化合物。其中，醛類和醇類化合物種類較豐富，分別占總揮發(fā)性化合物的34.1%和25.0%，超過總揮發(fā)性化合物數(shù)量的1/2；其次是酮類、酸類和酯類化合物，種類分別占總揮發(fā)性化合物的15.9%、11.4%和6.8%。采用內(nèi)標法對揮發(fā)性化合物進行定量分析，以2023 年收獲的稻谷為新稻谷、2019～2022 年收獲的稻谷為陳稻谷，比較不同種類揮發(fā)性化合物在新、陳稻谷中的含量變化情況，結(jié)果如圖2B 所示，稻谷中酸類和醇類化合物的含量相對較高，為主要揮發(fā)性成分，隨著儲藏時間延長，稻谷中酸類、醛類、酯類和呋喃類化合物的含量均呈上升趨勢，其中，酸類化合物含量變化較顯著；醇類和酮類化合物含量在新、陳稻谷中的變化趨勢不明顯；酚類物質(zhì)在新稻谷中含量較高，隨儲藏時間延長而呈下降趨勢。稻谷中脂質(zhì)降解后會產(chǎn)生低級脂肪酸，使其酸度增加；脂肪酸氧化產(chǎn)生氫過氧化物并進一步降解為醛類、酮類、醇類和呋喃類化合物，這是稻谷產(chǎn)生揮發(fā)性成分的主要途徑，影響稻谷的食用品質(zhì)和營養(yǎng)價值[21-22]。

2.3 新陳稻谷揮發(fā)性成分多元統(tǒng)計分析

為探究新、陳兩類稻谷中揮發(fā)性成分差異，以44 種揮發(fā)性化合物為因變量，新、陳稻谷為自變量，對鑒定出的44 種揮發(fā)性化合物進行多元統(tǒng)計分析。主成分分析結(jié)果如圖3A 所示，大部分樣品處于95%置信區(qū)間內(nèi)，其中，主成分1 貢獻總方差的71.5%，主成分2 貢獻總方差的9.9%，累積貢獻總方差的81.4%，在PCA 得分圖中，新、陳兩類稻谷有一定的聚類趨勢，但有個別樣品出現(xiàn)重疊的現(xiàn)象。為進一步提高模型的分類效能，在PCA 模型的基礎(chǔ)上進行有監(jiān)督的OPLS-DA 分析，結(jié)果如圖3B 所示，新、陳稻谷可顯著區(qū)分為兩類。本次分析中的自變量擬合指數(shù)（R2X）為0.852，因變量擬合指數(shù)（R2Y）為0.824，模型預(yù)測指數(shù)（Q2）為0.774， R2 和Q2 大于0.5 表示模型擬合結(jié)果可接受。經(jīng)過200 次置換檢驗，如圖3C 所示， R2 截距值為0.208（lt;0.30）， Q2 截距值為?0.469（lt;0.05），說明此模型不存在過擬合現(xiàn)象，具有良好的預(yù)測能力，可通過此模型實現(xiàn)新、陳稻谷鑒別。

2.4 新陳稻谷中差異化合物的篩選

為進一步篩選新、陳稻谷中的特征差異化合物，采用降維算法對數(shù)據(jù)進行VIP， VIP 值可以衡量各揮發(fā)性成分積累差異對樣本分類判別的影響強度和解釋能力， VIP 值越大表明該變量在新、陳稻谷中差異越顯著[23]。新、陳稻谷中揮發(fā)性化合物的VIP 得分圖如圖4 所示，基于OPLS-DA 模型的VIPgt;1 與plt;0.05 相結(jié)合的原則，共篩選出12 種差異化合物（紅色柱），包括4 種醇類化合物、3 種酸類化合物、3 種醛類化合物、1 種酯類化合物和1 種呋喃化合物，化合物信息列于表2。一些醇類具有相對較低的氣味閾值，對稻谷儲藏過程中的呈香起到了促進作用，其中， 1-己醇和（E，7R，11R）-3，7，11，15-四甲基-2-十六碳烯-1-醇（植物醇）均賦予稻谷果香和花香味。在4 種醇類化合物中， 1-辛醇受儲藏時間的影響相對較小，在儲藏過程中的含量較穩(wěn)定。醛類主要由不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生，苯甲醛可通過苯丙氨酸降解產(chǎn)生，通常具有堅果味和苦味[24]；壬醛和己醛為正鏈烷醛，具有花香和植物芳香，但高濃度的醛類會產(chǎn)生不好的氣味。2-戊基呋喃是由油酸和亞油酸氧化而成，具有豆香、果香和花香味。酸類和酯類通常具有較高的閾值，對稻谷的風(fēng)味貢獻相對較低[25]。對12 種差異化合物的相對含量進行分析，結(jié)果表明，除植物醇在新稻谷中的含量高于陳稻谷，其余11 種化合物（包括1-己醇、2-乙基-1-己醇、1-辛醇、己酸和苯甲醛等）在陳稻谷中的含量均高于新稻谷，表明在稻谷儲藏過程中上述化合物隨著內(nèi)部代謝活動產(chǎn)生，并導(dǎo)致稻谷產(chǎn)生苦味和酸味。

3 結(jié)論

基于揮發(fā)性成分和多元統(tǒng)計分析建立了儲藏稻谷新陳度的分析方法，采用HS-SPME-GC-MS/MS 技術(shù)對2019～2023 年收獲稻谷樣品中的揮發(fā)性成分進行分析，共鑒定出44 種揮發(fā)性化合物，包括醛類、醇類、酮類、酸類、酯類、酚類和呋喃類。依據(jù)化合物的特征前級離子信息建立稻谷揮發(fā)性成分的SIM分析方法，采用內(nèi)標法計算化合物相對含量并進行多元統(tǒng)計分析。通過OPLS-DA 可以將新、陳稻谷有效區(qū)分，構(gòu)建的模型不存在過擬合現(xiàn)象并且具有良好的預(yù)測能力。結(jié)合OPLS-DA 模型的VIPgt;1 與單因素分析plt;0.05 的原則篩選出12 種差異化合物。本研究為糧食安全領(lǐng)域的稻谷新陳度鑒別模型的構(gòu)建提供了參考。

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