摘要 外泌體（Exosome）的分析檢測對于疾病的早期診斷和治療具有重要意義。本研究利用堿基與石墨烯的π-π 相互作用將三螺旋結(jié)構(gòu)DNA（tsDNA）組裝在電化學(xué)還原氧化石墨烯（ERGO）的表面，制備了三腳架（Tripod）DNA探針，并通過懸于探針頂端的膜蛋白（CD63）適配體（apt）序列特異性捕獲外泌體，同時引入血紅素增強(qiáng)魯米諾（Luminol）-過氧化氫（H2O2）電化學(xué)發(fā)光（ECL）體系的信號強(qiáng)度。此生物傳感器的ECL強(qiáng)度與外泌體濃度在70～1.4×106 particles/μL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限低至30 particles/μL （S/N=3）。這種三腳架結(jié)構(gòu)的DNA較雙鏈或單鏈DNA具有大的探針間距，使其更有利于較大目標(biāo)物的捕獲和檢測，有望應(yīng)用于臨床樣品的分析測定。

關(guān)鍵詞 外泌體；三腳架DNA；適配體；生物傳感器；電化學(xué)發(fā)光

外泌體（Exosome）是由真核細(xì)胞（包括各種腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞）通過溶酶體途徑主動分泌的一種納米級細(xì)胞外囊泡，直徑約為30～150 nm[1]，存在于多種體液（血漿、唾液、尿液、腹水和腦脊液等）中[2]，在細(xì)胞間通訊和免疫反應(yīng)等生理過程中發(fā)揮了重要作用[3]。研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體通過釋放相關(guān)的信號分子促進(jìn)腫瘤發(fā)展，并且腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體量通常高于正常細(xì)胞[4-5]，這些獨特的功能使外泌體可以作為生物標(biāo)志物用于癌癥的早期診斷和治療。

目前，外泌體的分析檢測方法包括流式細(xì)胞術(shù)[6]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[7]、熒光法[8]和比色法[9]等。外泌體的形態(tài)特征可通過透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope， TEM）[10]、掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscope， SEM）[11]、原子力顯微鏡（Atomic force microscope， AFM）[12]等表征獲得。但是，以上方法尚存在不足和局限性，如分析過程復(fù)雜、操作耗時以及靈敏度難以滿足低濃度外泌體的檢測要求[13]。電化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence， ECL）生物傳感器具有檢測靈敏度高、響應(yīng)速度快、便攜性好以及樣品需求量少等優(yōu)勢[14-17]。適配體（Aptamer， apt）是通過指數(shù)富集技術(shù)經(jīng)體外篩選得到的與目標(biāo)物具有高親和力、高特異性的單鏈DNA或RNA序列，其靶標(biāo)物質(zhì)包括多肽、蛋白質(zhì)、金屬離子甚至細(xì)胞或細(xì)菌，因此得到了廣泛應(yīng)用[18]。Qiao等[19]構(gòu)建了Eu3+摻雜CdS納米晶體的ECL適配體傳感器，用于檢測外泌體時顯示出較高的穩(wěn)定性和靈敏度。

控制探針的界面密度和取向是構(gòu)建以DNA為識別元件的電化學(xué)生物傳感器的關(guān)鍵[20]。為了防止在電極表面的非特異性吸附和鏈間纏結(jié)，研究者將DNA 探針從簡單的單鏈DNA（Single-stranded DNA，ssDNA）擴(kuò)展到多種具有不同空間構(gòu)型的高級DNA結(jié)構(gòu)[21]。Travascio 等[22]提出了一種特殊拓?fù)錁?gòu)象的核酸結(jié)構(gòu)G-四聯(lián)體，可與血紅素（Hemin）復(fù)合形成一種功能性DNA復(fù)合物，具有類過氧化物酶活性，可高效催化基于過氧化氫（H2O2）的氧化反應(yīng)。單鏈寡核苷酸鏈與DNA雙鏈可通過Hoogsteen氫鍵形成三鏈DNA（Triple-stranded DNA， tsDNA）[23]。Tian等[24] 基于特異性核酸酶設(shè)計了一種環(huán)狀tsDNA納米開關(guān)探針，用于靈敏檢測microRNA Let-7a。本研究組的前期研究[25]表明， tsDNA探針的穩(wěn)定性和直立性優(yōu)于雙鏈和單鏈DNA探針，并且tsDNA的電荷轉(zhuǎn)移速率（約為3～5 s–1）也明顯高于單鏈和雙鏈DNA。

本研究基于tsDNA結(jié)構(gòu)的探針構(gòu)建了ECL 生物傳感器用于靈敏檢測外泌體。三腳架（Tripod）結(jié)構(gòu)的識別探針可以有效避免傳感界面上探針之間的纏結(jié)和潛在的空間位阻效應(yīng)。此傳感器采用電催化策略增強(qiáng)魯米諾–H2O2 體系的EC信號。如圖1所示，三鏈探針包括3個部分：首先，底部的單鏈DNA通過π-π 堆積作用使探針結(jié)合到電化學(xué)還原氧化石墨烯（Electrochemically reduced graphene oxide， ERGO）[26]表面，中間的tsDNA 由于不與石墨烯作用而直立在電極界面[27]，從而形成三腳架形狀；其次，三腳架探針的頂端是特異性識別外泌體膜蛋白CD63 適配體的互補(bǔ)序列，可以有效捕獲外泌體；最后，通過將G-四聯(lián)體DNA 與外泌體結(jié)合形成外泌體-DNA復(fù)合物，當(dāng)適配體探針捕獲到外泌體復(fù)合物后，通過引入Hemin 與G-四聯(lián)體DNA 形成具有類過氧化物酶活性的復(fù)合物，催化基于H2O2 的氧化反應(yīng)，從而實現(xiàn)外泌體的靈敏檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CHI 660A電化學(xué)分析儀（上海辰華儀器有限公司）；KQ-400KDE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DYY-10C 凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；H-7650 透射電鏡（日本Hitachi 公司）；Zetaview 粒徑分析儀和Eppendorf 5427R高速冷凍離心機(jī)（德國Wiggens公司）；T100 PCR熱循環(huán)儀（美國Bio-Rad 公司）；MPI-E 電化學(xué)分析儀（西安瑞邁電子科技有限公司）；Dimenson ICON 原子力顯微鏡（美國Bruker公司）。采用三電極系統(tǒng)：玻碳電極（Glassy carbon electrode， GCE， d=3 mm）為工作電極，Ag/AgCl（飽和KCl）電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。

K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl、HCl、NaH2PO4·2H2O和Na2HPO4·12H2O（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；青霉素和鏈霉素（分析純，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；精胺、血紅素（Hemin）、98% 魯米諾（Luminol）、30% H2O2 和杜氏改良Eagle培養(yǎng)基-高葡萄糖（DMEM）（美國Sigma-Aldrich 公司）；胎牛血清、MgCl2、1×TE 緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH=8.0）和1×Tris-HCl緩沖溶液（10 mmol/L Tris-HCl， pH=8.0）（上海生工生物科技有限公司）；氧化石墨烯（GO）分散液（1 mg/mL， 南京先豐納米有限公司）；無血清培養(yǎng)基和總外泌體分離試劑（賽默飛世爾科技有限公司）。本實驗所用細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（北京）提供；所有化學(xué)品均為分析純。實驗用水為Milli-Q純水系統(tǒng)純化的超純水（18.2 MΩ·cm）。實驗所用DNA序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（高效液相色譜純化），具體序列信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 外泌體的分離及提取

在5% CO2、37 ℃ 條件下，在含有10% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)肺腺癌細(xì)胞（A549細(xì)胞）。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80% 后，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；在4 ℃ 以2000 r/min離心30 min， 以分離漂浮的細(xì)胞和細(xì)胞碎片；吸取上清液，采用商用外泌體分離試劑盒處理，并在2～8 ℃下孵育過夜；在2～8 ℃ 條件下，將樣品以10000 r/min離心1 h， 棄去上清液，加入100 μL 1×PBS緩沖液將沉淀重懸，于–80 ℃ 保存，備用。采用1×PBS緩沖液稀釋外泌體母液，制備不同濃度的外泌體溶液。

1.2.2 TsDNA 的合成以及外泌體-signal DNA 復(fù)合物的制備

分別移取3 μL 100 μmol/L的單鏈DNA（ssDNA-1、ssDNA-2和ssDNA-3）至60 μL緩沖液（10 mmol/LTris-HCl， pH=6.8）中，并加入一定濃度的精胺，在37 ℃ 下培養(yǎng)24 h， 得到5 μmol/L tsDNA溶液，于?20 ℃下冷凍儲存，備用。移取5 μL 100 μmol/L信號DNA（signal DNA）與95 μL 1.4×106 particles/μL外泌體溶液，在室溫下混合孵育60 min， 得到外泌體-signal DNA復(fù)合物，于?20 ℃ 冷凍儲存，備用。

1.2.3 ECL 生物傳感界面的構(gòu)建

首先在拋光絨布上將GCE用0.05 μm Al2O3 懸濁液打磨成鏡面，依次用水、乙醇和水超聲清洗處理3 min 后，用氮氣吹干，備用。將預(yù)處理過的GCE 置于1 mg/mL GO 水分散液中，以100 mV/s 的掃速在0.5～ ?1.5 V的電壓范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描10圈，在電極表面得到ERGO，將此電極命名為ERGO/GCE，掃描過程中始終保持氮氣的氛圍。在ERGO/GCE表面滴加5 μL合成的tsDNA，在室溫下孵育1 h后， tsDNA通過π-π 堆積作用被錨定在ERGO 上，形成直立的Tripod DNA，獲得Tripod DNA/ERGO/GCE。以水和Tris-HCl緩沖液依次清洗電極表面，氮氣吹干，備用。

1.2.4 外泌體的檢測

在修飾電極Tripod DNA/ERGO/GCE表面滴加5 μL CD63 aptamer溶液， 孵育45 min， 得到修飾電極apt/Tripod DNA/ERGO/GCE；滴加10 μL 預(yù)先制備的外泌體-signal DNA 復(fù)合物溶液，孵育2 h， 得到exo-DNA/apt/Tripod DNA/ERGO/GCE；滴加10 μL Hemin， 孵育1 h， 得到修飾電極hemin/exo-DNA/apt/Tripod DNA/ERGO/GCE。將此修飾電極浸入含有0.5 mmol/L Luminol和0.08 mol/L H2O2 的0.1 mol/L PBS（pH=7.5）中，進(jìn)ECL測試，電壓掃描范圍為0～0.8 V， 掃描速率為100 mV/s。

1.2.5 原子力顯微鏡成像

將0.1 mg/mL GO分散液滴涂到新剝落的云母（Mica）表面，在室溫下干燥，得到GO/mica界面。在GO修飾的云母表面滴加5 μL 500 nmol/L的tsDNA溶液，在濕潤的環(huán)境下孵育30 min， 然后用Tris-HCl緩沖液小心潤洗多次，在氮氣中干燥，得到Tripod DNA/GO/mica界面。將得到的樣品在輕敲模式下進(jìn)行原子力顯微鏡掃描成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 tsDNA 探針的合成與表征

為降低DNA鏈的磷酸骨架的負(fù)電荷之間的靜電排斥力，需要在體系中添加二價陽離子或多胺（如精胺或亞精胺）進(jìn)行電荷中和，以形成穩(wěn)定的tsDNA[28]。圖2為ssDNA、dsDNA和tsDNA的凝膠電泳圖，其中，泳道1～9 為不同濃度精胺條件下合成的tsDNA，泳道10 為單鏈DNA（ssDNA-1），泳道11 為ssDNA-1和ssDNA-3合成的dsDNA。由圖2可見，當(dāng)精胺濃度低于0.3 mmol/L（泳道1、2）或高于2.5 mmol/L（泳道8、9）時，只觀察到1條單鏈對應(yīng)的條帶，與泳道10一致，說明此條件下未形成穩(wěn)定的tsDNA；泳道3～7在遷移位移最小時出現(xiàn)1條明顯條帶，并且泳道7已無明顯的單鏈條帶，表明精胺濃度為2.5 mmol/L時合成的tsDNA合成效率最高。因此，本研究選擇在精胺濃度為2.5 mmol/L的條件下合成tsDNA。

2.2 外泌體的提取和表征

由透射電子顯微鏡（TEM）圖（圖3A）可見，從A549細(xì)胞中提取的外泌體具有明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)，呈典型的茶杯狀，直徑約為100 nm。利用NTA進(jìn)一步分析外泌體的粒徑分布及其濃度（圖3B），可見外泌體濃度約為1.4×1010 particles/mL，粒徑分布集中在80～120 nm之間，平均直徑為91 nm。外泌體的理論直徑為50～200 nm[8]，提取的外泌體大小在此特征直徑范圍內(nèi)，表明已成功提取和純化得到A549細(xì)胞外泌體。

2.3 ECL 生物傳感界面的表征

利用原子力顯微鏡表征ERGO/mica和Tripod DNA/ERGO/mica的界面形貌（圖4A），可以看到沉積的ERGO厚度為（1.0±0.5） nm， 這與其單層的特性一致[28]。如圖4B所示，富含A堿基的tsDNA通過強(qiáng)π-π 堆積吸附在ERGO上形成了Tripod DNA，此層的厚度也相應(yīng)增加到（6.0±1.0） nm。由于Tripod DNA的三螺旋互補(bǔ)序列為15個堿基，理論高度為5.1 nm， 與圖像結(jié)果近似，表明Tipod DNA鏈在基底表面呈直立狀態(tài)。

電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy， EIS）常用于表征電極界面的電荷轉(zhuǎn)移性能，其高頻區(qū)的半圓直徑大小對應(yīng)電極的電子轉(zhuǎn)移電阻（Resistance of electron-transfer， Rct），低頻區(qū)的線性部分代表擴(kuò)散過程。如圖5 所示，在GCE 表面電化學(xué)還原GO 后，表面的含氧基團(tuán)減少， Rct 明顯減?。ú鍒D中曲線b）；而組裝三腳架DNA探針后（曲線c）以及與CD63 aptamer雜交后（曲線d）， Rct 均逐步增大，這是因為帶負(fù)電荷的DNA 磷酸骨架排斥負(fù)電性的電化學(xué)探針[Fe（CN）6]3?/4?。捕獲外泌體-SignalDNA復(fù)合物后（曲線e和f），電極界面的導(dǎo)電性進(jìn)一步減弱，使得Rct 進(jìn)一步增大。

圖6 顯示了不同修飾電極在含有0.5 mmol/L Luminol、0.08 mol/L H2O2 的0.1 mol/L PBS 溶液中的ECL響應(yīng)曲線，其中， Luminol為發(fā)光體， H2O2 為共反應(yīng)劑。當(dāng)電極修飾ERGO 后， ECL強(qiáng)度增大，這歸因于ERGO的高導(dǎo)電性提高了電極表面的電子轉(zhuǎn)移速率（曲線b）；繼續(xù)組裝探針和捕獲外泌體后， ECL強(qiáng)度逐步降低（曲線d、e 和f），其原因是電極表面被導(dǎo)電性不佳的物質(zhì)覆蓋，電子傳遞能力降低。在體系中加入Hemin后，其與外泌體上的信號探針形成具有類過氧化物酶活性的Hemin/G-四聯(lián)體DNA復(fù)合物，催化H2O2 的氧化反應(yīng)，ECL信號顯著增強(qiáng)（曲線g）。曲線c為對照實驗，是Hemin直接修飾到ERGO/GCE電極表面的ECL曲線，無H2O2 時， Hemin不能增強(qiáng)Luminol體系的ECL信號。

2.4 實驗條件的優(yōu)化

2.4.1 Signal-DNA 濃度的優(yōu)化

預(yù)組裝在外泌體上的Signal-DNA 的量與體系的ECL 強(qiáng)度直接相關(guān)，圖7A 顯示了不同濃度（0、1、2、3、4 和5 μmol/L）的Signal-DNA與1.4×106 particles/μL外泌體形成復(fù)合物時體系ECL響應(yīng)強(qiáng)度的變化。隨著Signal-DNA 濃度增大，結(jié)合到電極表面的Signal-DNA 增多，ECL 響應(yīng)依次增強(qiáng)。當(dāng)Signal-DNA 的濃度達(dá)到2 μmol/L 后， ECL 信號不再增加并達(dá)到平臺，說明此時已飽和。因此，選擇Signal-DNA濃度為2 μmol/L。

2.4.2 Hemin 濃度的優(yōu)化

圖7B 為不同濃度Hemin 對體系的ECL 響應(yīng)強(qiáng)度的影響。保持信號探針的濃度不變，在0.1～0.4 mmol/L范圍內(nèi)，隨著Hemin濃度增加， ECL信號增強(qiáng)。當(dāng)Hemin濃度大于0.4 mmol/L時， ECL信號不再發(fā)生明顯變化，達(dá)到飽和。因此，選擇0.4 mmol/L作為最佳Hemin濃度。

2.4.3 H2O2 濃度的優(yōu)化

考察了Luminol ECL 體系的共反應(yīng)劑H2O2 濃度的影響。圖7C 為不同濃度H2O2 的條件下，含0.5 mmol/L Luminol 的0.1 mol/L PBS 溶液體系的ECL 響應(yīng)強(qiáng)度。隨著H2O2 濃度從10 mmol/L 增大至80 mmol/L， ECL信號顯著增強(qiáng)；進(jìn)一步增大H2O2 濃度， ECL信號增強(qiáng)不顯著。因此，選擇H2O2 的最佳濃度為80 mmol/L。

2.5 外泌體的檢測

在最優(yōu)實驗條件（Sginal-DNA 濃度為2 μmol/L， Hemin 濃度為0.4 mmol/L， 電解質(zhì)溶液為含有0.5 mmol/L Luminol和0.08 mol/L H2O2 的0.1 mol/L PBS溶液）下，檢測傳感器對不同濃度外泌體的ECL響應(yīng)（圖8A）。當(dāng)不存在外泌體時， Sginal-DNA不能結(jié)合至電極表面，無催化信號，未觀察到明顯的ECL發(fā)光信號（曲線i）；隨著外泌體濃度增大，ECL 信號逐漸增強(qiáng)，體系ECL 強(qiáng)度與外泌體濃度的對數(shù)值在70～1.4×106 particles/μL 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（圖8B），線性回歸方程為y=1278.5x–1797.5（R2=0.996），檢出限為30 particles/μL （S/N=3）。與其它檢測外泌體的ECL方法相比，本方法具有較低的檢出限和較寬的線性檢測范圍（表2），表明本研究設(shè)計的三腳架DNA 探針結(jié)合具有催化放大作用的Hemin/G-四聯(lián)體DNA復(fù)合物有效提高了檢測外泌體的靈敏度和準(zhǔn)確性。

為了考察生物傳感器的重現(xiàn)性，在相同條件下制備3 支修飾電極，測量其對1.4×106 particles/μL外泌體溶液的ECL響應(yīng)，結(jié)果表明， 3支電極測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.08%，說明其具有良好的重現(xiàn)性。ECL 生物傳感器的穩(wěn)定性是評價其性能的另一個重要指標(biāo)。采用此ECL 生物傳感器檢測1.4×104 particles/μL的外泌體，連續(xù)11個周期循環(huán)檢測的ECL響應(yīng)信號非常穩(wěn)定， RSD為1.0%，表明此生物傳感器具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

構(gòu)建了基于三腳架DNA探針的ECL生物傳感器，利用可特異性識別外泌體的適配體和Hemin/G-四聯(lián)體的高效催化性能實現(xiàn)了外泌體的靈敏檢測。采用的tsDNA的尾部寡核苷酸片段含有12個腺嘌呤堿基，其與ERGO通過π-π 堆積作用使探針呈現(xiàn)直立狀態(tài)的三腳架結(jié)構(gòu)，并且12個腺嘌呤堿基使探針間距滿足捕獲尺寸較大的外泌體的要求，提高了精準(zhǔn)性。本研究結(jié)果表明，這種基于探針間距尺寸可控的傳感器在選擇性分析不同尺寸目標(biāo)物中具有良好的應(yīng)用前景。

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