摘" " 要" " 目的" " 探討低頻低強(qiáng)度超聲輻照微泡（LILFU-MB）對(duì)三陰性乳腺癌MDA-MB-231/DOX細(xì)胞耐藥性的影響。方法" " 篩選LILFU-MB最佳非毒性輻照時(shí)間，計(jì)算細(xì)胞存活率；將MDA-MB-231/DOX細(xì)胞分為L(zhǎng)ILFU-MB輻照組和非LILFU-MB輻照組，繪制藥物抑制擬合曲線圖獲得兩組藥物的半抑制濃度（IC50），并篩選阿霉素最佳劑量。根據(jù)不同處理方式將細(xì)胞分為對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組，觀察細(xì)胞增殖活性，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并記錄細(xì)胞核熒光強(qiáng)度及細(xì)胞核型；使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)情況。結(jié)果" " LILFU-MB最佳非毒性輻照時(shí)間為30 s，該條件下細(xì)胞存活率為（92.33±2.58）%，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中LILFU-MB輻照時(shí)間均采用此條件。LILFU-MB輻照組中阿霉素對(duì)耐藥細(xì)胞的IC50低于非LILFU-MB輻照組（7.51 μmol/L vs. 35.40 μmol/L），后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用35.40 μmol/L為阿霉素最佳劑量。阿霉素組和LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞增殖活性均受到明顯抑制，增殖速度減慢，其中LILFU-MB+阿霉素組抑制效果最明顯。對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞遷移率分別為（56.79±1.11）%、（51.34±4.66）%、（46.09±9.42）%、（22.01±6.02）%，其中LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞遷移率低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.01）。倒置熒光顯微鏡觀察顯示，LILFU-MB+阿霉素組中大部分細(xì)胞核明顯皺縮和碎裂，胞核藍(lán)染高亮，染色質(zhì)呈濃縮和邊緣化，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞凋亡核型改變。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率分別為（13.30±0.66）%、（22.68±2.85）%、（20.60±3.72）%、（31.84±2.87）%，其中LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。LILFU-MB+阿霉素組P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，Cyt-c、Cl-caspase3蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。結(jié)論" " LILFU-MB能夠顯著抑制MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖、遷移，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌MDA-MB-231/DOX細(xì)胞耐藥性。

關(guān)鍵詞" " 超聲輻照，低頻，低強(qiáng)度；微泡；三陰性乳腺癌；多藥耐藥性；阿霉素

［中圖法分類號(hào)］R445.1" " " ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

Effect of low-frequency and low-intensity ultrasound irradiation microbubbles on drug resistance of triple-negative breast

cancer MDA-MB-231/DOX cells

WU Zhihui，QU Ni’na，CHEN Huangzhuonan，WANG Guoyun，BI Menglu，LIU Hexiu，CAO Xiaoli

School of Medical Imaging，Binzhou Medical University，Shandong 264003，China

ABSTRACT" " Objective" " To investigate the effect of low-frequency and low-intensity ultrasound irradiation microbubbles（LILFU-MB） on drug resistance of triple-negative breast cancer MDA-MB-231/DOX cells.Methods" " The best non-toxic irradiation time of LILFU-MB was screened and the cell survival rate was calculated.The MDA-MB-231/DOX cells were divided into LILFU-MB irradiation group and non LILFU-MB irradiation group.The drug inhibition fitting curve was drawn to obtain the half inhibitory concentration （IC50） of the two groups of drugs，the best dose of doxorubicin was screened.According to different treatment methods，the cells were divided into control group，doxorubicin group，LILFU-MB group，LILFU-MB+doxorubicin group，the cell proliferation activity was observed，and the cell migration rate was calculated.The morphology of the cells were observed by inverted fluorescence microscope，and the fluorescence intensity and karyotype of the cells were recorded.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.The protein expression was detected by Western blot.Results" " "The best non-toxic irradiation time of LILFU-MB was 30 s，and the cell survival rate was （92.33±2.58）% under this condition.This condition was used for the duration of LILFU-MB irradiation in subsequent experiments.The IC50 of doxorubicin on drug-resistant cells in the LILFU-MB irradiation group was lower than that in the non LILFU-MB irradiation group（7.51 μmol/L vs. 35.40 μmol/L）.The best dose of doxorubicine was 35.40 μmol/L.The cell proliferation activity of doxorubicin group and LILFU-MB+doxorubicin group was significantly inhibited，and the proliferation rate was slowed down，and the inhibition effect of LILFU-MB+doxorubicin group was the most obvious.The cell migration rates of the control group，doxorubicin group，LILFU-MB group，LILFU-MB+doxorubicin group were （56.79±1.11）%，（51.34±4.66）%，（46.09±9.42）%，（22.01±6.02）%，respectively，and the cell migration rates of LILFU-MB+doxorubicin group were significantly different from that of other groups（all Plt;0.01）.Inverted fluorescence microscope revealed that most of the nuclei in the LILFU-MB+doxorubicin group were obviously shrunk and fragmented，the blue staining of the nuclei was highlighted，the chromatin was concentrated and marginalized，and the strong apoptotic karyotype change was showed.The results of flow cytometry showed that the apoptosis rates of the control group，doxorubicin group，LILFU-MB group and LILFU-MB+doxorubicin group were （13.30±0.66）%，（22.68±2.85）%，（20.60±3.72）%，（31.84±2.87）%，respectively.The apoptosis rate of LILFU-MB+doxorubicin group was higher than that of the other groups，and the differences were statistically significant（all Plt;0.05）.The expressions of P-gp protein and Bcl-2 in LILFU-MB+doxorubicin group were significantly down-regulated，while the expressions of Cyt-c and Cl-caspase3 protein were significantly up-regulated，and the differences were statistically significant compared with that of other groups（all Plt;0.05）.Conclusion" " LILFU-MB can significantly inhibit the proliferation and migration of MDA-MB-231/DOX cells，promote cell apoptosis，and reverse the drug resistance of triple negative breast cancer MDA-MB-231/DOX cells.

KEY WORDS" " Ultrasound irradiation，low-frequency，low-intensity；Microbubbles；Triple-negative breast cancer；Multidrug resistance；Doxorubicin

目前，乳腺癌已成為全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤，死亡率居全球女性惡性腫瘤首位，其在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率亦均呈逐年上升趨勢(shì)［1］。三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）占乳腺癌總體的10%～20%，作為一種特殊病理亞型的乳腺癌，極易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的占比約50%［2］?；熓桥R床治療TNBC的主要方法，蒽環(huán)類藥物如阿霉素已廣泛應(yīng)用，短期內(nèi)對(duì)癌細(xì)胞殺傷作用強(qiáng)，能夠有效控制和殺滅癌細(xì)胞，但其缺乏靶向特異性，產(chǎn)生的全身毒副作用和獲得性多藥耐藥會(huì)影響化療效果［3］。因此，尋找副作用小且靶向性強(qiáng)的化療藥物一直是臨床的研究熱點(diǎn)。近年來低頻低強(qiáng)度超聲輻照微泡（low-intensity low-frequency ultrasound-microbubbles，LILFU-MB）在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、增加細(xì)胞膜通透性、開放生物屏障等方面均取得了較好的效果［4-5］，但其對(duì)TNBC耐藥細(xì)胞的相關(guān)作用尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)通過探討LILFU-MB對(duì)TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞耐藥性的影響，旨在為TNBC的精準(zhǔn)治療提供參考。

材料與方法

一、主要實(shí)驗(yàn)材料

TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞與生物研究所）；阿霉素化療藥物，純度gt;98.0%（美國(guó)Sigma公司）；SonoVue造影劑（意大利 Bracco公司）；胎牛血清（德國(guó) PAN公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Hoechst 33342活細(xì)胞染色液、抗兔P-gp多抗（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）；抗兔Bcl-2單抗、抗兔Cyt-c單抗、抗兔Cl-caspase3單抗（武漢艾博泰克生物科技有限公司）；GAPDH、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（上海BBI生命科學(xué)有限公司）；CCK-8試劑盒（安徽蘭杰科技有限公司）；PBS緩沖液、RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基及Western blot實(shí)驗(yàn)所需相關(guān)試劑（山東思科捷生物技術(shù)有限公司）。

二、主要實(shí)驗(yàn)儀器

超聲波治療儀（WED-100，深圳威爾德醫(yī)療電子有限公司）；移液器（Research Plus，德國(guó)Eppendorf公司）；酶標(biāo)儀（Multiskan FC，賽默飛世爾科技有限公司）；倒置熒光顯微鏡（IX51，奧林巴斯有限公司）；流式細(xì)胞儀（Moflo XDP，貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Chemi Scope 6200 Touch，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：將TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞解凍后以1000 r/min的速度離心5 min，接種于含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（以下簡(jiǎn)稱完全培養(yǎng)基）中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇培養(yǎng)，至細(xì)胞恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)后加入5 μmol/L阿霉素以維持細(xì)胞耐藥性，每2～3 d傳代1次。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.LILFU-MB最佳非毒性輻照時(shí)間篩選：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成濃度為5×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，加入20%體積的微泡（用5 ml 0.9%氯化鈉溶液稀釋SonoVue造影劑，充分振蕩搖勻制成混懸液）混勻，分別接種于6個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿底部均勻涂上耦合劑，然后使用超聲探頭垂直進(jìn)行輻照，6個(gè)培養(yǎng)皿分別輻照0 s、10 s、30 s、60 s、90 s、120 s（LILFU-MB組）；超聲輻照條件：頻率1 MHz，聲強(qiáng)1.0 W/cm2，效率60%。然后用完全培養(yǎng)基將每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)胞密度均調(diào)整為1×104個(gè)/ml，并接種于96孔板，每孔100 μl，每組6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白組和正常組，無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h；使用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔細(xì)胞在450 nm處的吸光度（optical density，OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率=［（LILFU-MB組OD值-空白組OD值）/（正常組OD值-空白組OD值）］×100%。篩選LILFU-MB最佳非毒性輻照時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.阿霉素最佳劑量篩選：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成濃度為5×105個(gè)/ml的單細(xì)胞懸液，然后分為L(zhǎng)ILFU-MB輻照組和非LILFU-MB輻照組，按照實(shí)驗(yàn)條件分別處理后收集細(xì)胞并制成1×104個(gè)/ml的混懸液，接種于96孔板，每孔100 μl，后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟同方法2，測(cè)量細(xì)胞OD值并計(jì)算細(xì)胞存活率。繪制藥物抑制擬合曲線圖獲得藥物的半抑制濃度（IC50），以此作為阿霉素最佳劑量；計(jì)算耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)，公式為：耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)=非LILFU-MB輻照組IC50/LILFU-MB輻照組IC50。

4.分組及增殖情況檢測(cè)：按不同處理方法將細(xì)胞分為4組：對(duì)照組（0.8 ml單細(xì)胞懸液+0.2 ml PBS緩沖液）、阿霉素組（0.8 ml單細(xì)胞懸液+0.2 ml PBS緩沖液+最佳劑量的阿霉素）、LILFU-MB組（0.8 ml單細(xì)胞懸液+0.2 ml 微泡，輻照時(shí)間為方法2篩選結(jié)果）、LILFU-MB+阿霉素組（0.8 ml單細(xì)胞懸液+最佳劑量的阿霉素+0.2 ml微泡，輻照時(shí)間為方法2篩選結(jié)果），分別培養(yǎng)12 h、24 h、48 h，根據(jù)OD值繪制細(xì)胞增殖曲線，觀察細(xì)胞增殖活性。

5.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移情況：將各組細(xì)胞分別接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)使用無菌200 μl移液器槍頭在板底部劃等寬的直線。PBS緩沖液洗去漂浮細(xì)胞，分別于即刻和48 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察同一視野下的劃痕寬度，并拍照記錄。使用ImageJ軟件獲得對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組在上述時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞劃痕面積，計(jì)算各組細(xì)胞遷移率，公式為：細(xì)胞遷移率=（即刻空白面積-48 h空白面積）/即刻空白面積×100%。

6.Hoechst染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)：將各組細(xì)胞分別接種于12孔板中，每孔1 ml，均勻分布，24 h后將舊培養(yǎng)基吸出，PBS緩沖液洗滌2次，每孔加入10 μl Hoechst 33342活細(xì)胞染色液，無菌培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 min，然后用PBS緩沖液洗滌2～3次，于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并記錄細(xì)胞核熒光強(qiáng)度及細(xì)胞核型。

7.Annexin V-FITC/PI檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況：將各組細(xì)胞分別接種于6孔板中，24 h后經(jīng)胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，加入500 μl Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI混勻后避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

8.Western blot檢測(cè)細(xì)胞蛋白表達(dá)情況：將各組細(xì)胞加入含PMSF的裂解液提取總蛋白，蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉；將抗兔P-gp多抗（1∶1000）、抗兔Bcl-2單抗（1∶1000）、抗兔Cyt-c單抗（1∶1000）、抗兔Cl-caspase3單抗（1∶1000）、GAPDH（1∶4000）一抗在4℃孵育過夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶5000） 搖床孵育1 h，再次洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影拍照，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)獲取各組P-gp、Bcl-2、Cyt-c及Cl-caspase3蛋白表達(dá)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 9.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-t檢驗(yàn)。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)" 果

一、LILFU-MB最佳非毒性輻照時(shí)間篩選結(jié)果

超聲輻照0 s、10 s、30 s、60 s、90 s、120 s后MDA-MB-231/DOX細(xì)胞存活率分別為（97.35±0.69）%、（94.04±3.27）%、（92.33±2.58）%、（85.90±3.32）%、（65.41±4.03）%、（47.87±4.79）%。與輻照0 s比較，輻照60 s、90 s和120 s時(shí)細(xì)胞存活率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.001）；輻照10 s與輻照30 s時(shí)細(xì)胞存活率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用LILFU-MB輻照30 s進(jìn)行研究。見圖1。

二、阿霉素最佳劑量篩選結(jié)果

LILFU-MB輻照組細(xì)胞的IC50低于非LILFU-MB輻照組（7.51 μmol/L vs. 35.40 μmol/L），耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)為4.71。后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用35.40 μmol/L為阿霉素最佳劑量進(jìn)行研究。

三、各組不同培養(yǎng)時(shí)間MDA-MB-231/DOX細(xì)胞增殖情況

細(xì)胞增殖曲線顯示，培養(yǎng)24 h后阿霉素組和LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞OD值分別為0.89±0.05、0.67±0.03，均低于對(duì)照組和LILFU-MB組細(xì)胞OD值［（1.12±0.03、1.02±0.02）］，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.01）；兩組細(xì)胞增殖活性均受到明顯抑制，增殖速度減慢，其中LILFU-MB+阿霉素組受抑制效果最明顯。培養(yǎng)48 h后對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞OD值分別為1.39±0.09、0.98±0.05、1.08±0.06、0.75±0.04，均較各組培養(yǎng)24 h后稍有增高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2。

四、LILFU-MB對(duì)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞遷移率分別為（56.79±1.11）%、（51.34±4.66）%、（46.09±9.42）%、（22.01±6.02）%；其中LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞遷移率低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.01）；對(duì)照組、阿霉素組及LILFU-MB組細(xì)胞遷移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 見圖3。

五、LILFU-MB對(duì)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞形態(tài)的影響

Hoechst染色結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞分布均勻，正常細(xì)胞核呈低強(qiáng)度熒光；阿霉素組和LILFU-MB組中僅見數(shù)個(gè)細(xì)胞核呈固縮狀態(tài)，顯示為致密濃染的高強(qiáng)度熒光；LILFU-MB+阿霉素組中大部分細(xì)胞核明顯皺縮和碎裂，胞核藍(lán)染高亮，染色質(zhì)呈濃縮和邊緣化，表現(xiàn)為較強(qiáng)的細(xì)胞凋亡核型改變。見圖4。

六、LILFU-MB對(duì)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，對(duì)照組、阿霉素組、LILFU-MB組、LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率分別為（13.30±0.66）%、（22.68±2.85）%、（20.60±3.72）%、（31.84±2.87）%；與對(duì)照組比較，阿霉素組、LILFU-MB組及LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；阿霉素組與LILFU-MB組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。見圖5。

七、LILFU-MB對(duì)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，LILFU-MB組P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)均下調(diào)，Cyt-c、Cl-caspase3蛋白表達(dá)均上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。阿霉素組Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組下調(diào)，Cyt-c、Cl-caspase3蛋白表達(dá)較對(duì)照組上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）；P-gp蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LILFU-MB+阿霉素組P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，Cyt-c、Cl-caspase3蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。見圖6。

討" 論

TNBC作為乳腺癌中最具侵襲性的分子亞型，具有發(fā)病年齡早、臨床分期晚、組織學(xué)級(jí)別高、極易局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)［2］。TNBC對(duì)內(nèi)分泌治療及分子靶向治療均不敏感，目前臨床多采用蒽環(huán)類藥物與紫杉醇、順鉑等藥物聯(lián)合化療的治療方案［6］。阿霉素作為蒽環(huán)類的一線化療藥物，極易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性，從而導(dǎo)致化療失敗。因此，尋找逆轉(zhuǎn)TNBC耐藥性的分子靶點(diǎn)和治療方法成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。目前，LILFU-MB以其靶向特異性和非侵入性的特點(diǎn)在腫瘤治療中受到廣泛關(guān)注。LILFU是指頻率20 kHz～1 MHz、聲強(qiáng)lt;3.0 W/cm2的超聲波，主要通過非熱效應(yīng)（機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)）實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)調(diào)控，而微泡在LILFU作用下破裂可增強(qiáng)非熱效應(yīng)，以及血管和細(xì)胞膜的通透性，提高藥物的轉(zhuǎn)染率［7-8］。文獻(xiàn)［9-11］報(bào)道LILFU-MB能夠靶向傳遞抗癌藥物，改善細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，使胰腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞死亡，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)，但目前關(guān)于LILFU-MB逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性的相關(guān)報(bào)道較少。為明確LILFU-MB的逆轉(zhuǎn)作用，本實(shí)驗(yàn)探討了其對(duì)TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞耐藥性的影響。

本實(shí)驗(yàn)采用LILFU-MB輻照TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞，結(jié)果顯示與輻照0 s比較，輻照60 s、90 s和120 s時(shí)細(xì)胞存活率均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.001）。隨著輻照時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降，表明LILFU-MB能夠以時(shí)間依賴方式顯著抑制耐藥細(xì)胞活力。輻照30 s時(shí)，細(xì)胞存活率與0 s比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本實(shí)驗(yàn)以LILFU-MB輻照30 s為最佳非毒性輻照時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與非LILFU-MB輻照組比較，LILFU-MB輻照組中阿霉素對(duì)MDA-MB-231/DOX細(xì)胞的IC50明顯降低，其耐藥逆轉(zhuǎn)指數(shù)為4.71，并篩選出后續(xù)實(shí)驗(yàn)中阿霉素的最佳劑量為35.40 μmol/L，提示LILFU-MB能夠有效增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)阿霉素的化療敏感性。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞增殖活性和遷移率均低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.01），提示LILFU-MB能使腫瘤細(xì)胞增殖能力顯著降低且遷移能力減弱。本實(shí)驗(yàn)Hoechst染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡特征，表現(xiàn)為核固縮、染色體凝集、形成凋亡小體；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示LILFU-MB+阿霉素組細(xì)胞凋亡率高于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05）。表明LILFU-MB增強(qiáng)了細(xì)胞毒性作用，能夠明顯抑制耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其死亡。分析原因可能為L(zhǎng)ILFU-MB使腫瘤細(xì)胞膜表面產(chǎn)生大量微小孔隙，改變了細(xì)胞膜表面酶的活性，使阿霉素快速大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，致使細(xì)胞凋亡增加［12］。

腫瘤細(xì)胞的耐藥性涉及多種復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)機(jī)制，除藥物攝入減少外，還有藥物流出增加。跨膜蛋白P-gp是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的一員，作為一種具有“藥泵”功能的外排轉(zhuǎn)運(yùn)體，能與多種化療藥物結(jié)合并將其泵出腫瘤細(xì)胞，顯著增加腫瘤細(xì)胞中藥物的流出量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性［13］。Qiu等［14］研究表明，LILFU能夠下調(diào) P-gp蛋白表達(dá)，增強(qiáng)吉西他濱對(duì)胰腺癌耐藥ASPC-1細(xì)胞的化療敏感性。另有研究［15］表明，Bcl-2蛋白觸發(fā)Cyt-c從線粒體釋放，隨后激活caspase3，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和核酸酶激活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，LILFU-MB+阿霉素組P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，Cyt-c、Cl-caspase3蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均Plt;0.05），表明LILFU-MB下調(diào)P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)是克服TNBC多藥耐藥的有效治療策略，而上調(diào)Cyt-c和Cl-caspase3蛋白表達(dá)可實(shí)現(xiàn)耐藥細(xì)胞凋亡。

綜上所述，LILFU-MB對(duì)TNBC MDA-MB-231/DOX細(xì)胞具有毒性增效作用，能夠抑制細(xì)胞的增殖、遷移，誘發(fā)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與下調(diào)P-gp、Bcl-2蛋白表達(dá)，上調(diào)Cyt-C、Cl-caspase3蛋白表達(dá)，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)TNBC細(xì)胞耐藥并增加細(xì)胞凋亡易感性有關(guān)。然而其中涉及的具體通路尚需今后深入研究，以期為臨床腫瘤治療提供新的研究思路。

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（收稿日期：2023-10-06）