摘要 肥料是影響煙葉產(chǎn)量、品質(zhì)的重要因素之一，其中施用有機肥可促進煙葉增產(chǎn)，改善煙葉品質(zhì)。為探究增施有機肥對煙葉代謝的影響，以云煙87為材料，通過增施0、900和1 500 kg/hm2 3個不同梯度的炭基（酒糟）有機肥處理后，利用液相色譜質(zhì)譜方法對打頂后7 d 煙葉中的代謝物進行了非靶向代謝組分析。在煙葉中鑒定了219種次生代謝物，通過代謝物比較分析發(fā)現(xiàn)，增施900和1 500 kg/hm2分別有14和26個代謝物相比對照組積累降低；有7種代謝物在2個處理組中均顯著降低，其中包含了M780（降煙堿）、M1021（尼古?。┖蚆1328（可替寧）3種煙堿類代謝物。進一步分析發(fā)現(xiàn)，33種差異代謝物中有9種代謝物在增施900和1 500 kg/hm2 2個分組之間具有積累差異；其余差異代謝物在2個分組之間無顯著積累差異。差異代謝物相關網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)，山奈酚等苯丙烷途徑代謝物與煙堿的積累變化緊密相關，也具有降低的趨勢。結果表明，增施有機肥既能顯著減少煙葉煙堿類代謝物的積累，也能在一定程度上降低煙葉苯丙烷途徑代謝物的積累；增施900和1 500 kg/hm2有機肥對煙堿的影響無明顯差異。綜上，明確了有機肥對煙葉次生代謝物的影響，為后續(xù)煙葉生產(chǎn)中有機肥合理施用提供了一定的理論指導。

關鍵詞 有機肥；煙葉；代謝物；煙堿；類黃酮

中圖分類號 S 572 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2024）20-0141-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.035

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Analysis of the Effect of Organic Fertilizer on Secondary Metabolites in Tobacco Leaves

SHEN Shu-lin LI Hong-xun2，3， HUANG Lan4 et al

（1. College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715;2. Upland Flue-Cured Tobacco Quality & Ecology Key Laboratory of China Tobacco， Guiyang， Guizhou 550081;3. Guizhou Academy of Tobacco Sciences， Guiyang， Guizhou 550081;4. Bijie Branch of Guizhou Tobacco Company， Bijie， Guizhou 551700）

Abstract Fertilizer is one of the important factors a_{j6nfk/H3tzI6LN+NjO74kw==}ffecting the yield and quality of tobacco leaves， among which the application of organic fertilizer can promote the increase of tobacco leaf yield and improve the quality of tobacco leaves. To explore the effect of increasing the application of organic fertilizers on the metabolism of tobacco leaves， Yunyan 87 was used as the material in this study. After applying three different gradients of carbon-based organic fertilizers at 0， 900 and 1 500 kg/hm2， and by using the liquid chromatography-mass spectrometry method，the metabolites in tobacco leaves 7 days after topping were subjected to untargeted metabolome analysis. A total of 219 secondary metabolites were identified in tobacco leaves. Through comparative analysis of metabolites， it was found that 14 and 26 metabolites were reduced in the accumulation of 900 and 1 500 kg/hm2 respectively compared with the control group;7 metabolites in the two treatments were significantly reduced， which contained three nicotinic metabolites M780 （nornicotine）， M1021 （nicotine） and M1328 （cotinine）. Further analysis found that 9 of the 33 differential metabolites had accumulation differences between the two groups with additional application of 900 and 1 500 kg/hm2; the rest of the differential metabolites had no significant accumulation differences between the two groups. Correlation network analysis of differential metabolites found that phenylpropane pathway metabolites such as kaempferol were closely related to the accumulation changes of nicotine，and also had decreased trend. The above results showed that increasing the application of organic fertilizers could not only significantly reduce the accumulation of nicotinic metabolites in tobacco leaves， but also reduce the accumulation of metabolites in the phenylpropanoid pathway in tobacco leaves to a certain extent; there was no significant difference between adding 900 and 1 500 kg/hm2 organic fertilizer on nicotine. In summary， this study clarified the effects of organic fertilizers on secondary metabolites of tobacco leaves， and provided certain theoretical guidance for the rational application of organic fertilizers in subsequent tobacco leaf production.

Key words Organic fertilizers;Tobacco leaves;Metabolites;Nicotine;Flavonoids

有機肥是以動植物殘體等富含有機質(zhì)的資源為主要原料，經(jīng)發(fā)酵腐熟后而成的肥料，是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的傳統(tǒng)肥料［1］。隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，我國農(nóng)業(yè)施肥體系由以傳統(tǒng)的有機肥為主變成以高效、高生產(chǎn)率的化肥為主的施肥體系［2］。然而化肥的過量使用造成了土壤板結、鹽堿化等問題［3］。近年來，以化肥配施有機肥的施肥體系成為趨勢，大量試驗研究和長期農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐證明：兩類肥料的混合使用可在保證土壤肥力穩(wěn)定的同時兼顧土壤的保護，是保證作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)的基本措施［4-5］。因此，探究有機肥對煙葉代謝的影響，可為合理施肥提供理論依據(jù)，具有較高的研究意義與價值。在煙草種植中，有機肥具有提高烤煙產(chǎn)量，提升煙葉品質(zhì)和改善土壤環(huán)境等多種效果［6］。同時，通過調(diào)整有機肥配方還可以降低煙草花葉病、青枯病、赤星病的發(fā)生率［7］。上述研究表明，施用有機肥對煙葉種植具有多種益處，但目前增施有機肥后煙葉生理變化機理了解較少，特別是煙葉的代謝變化尚不清楚。

煙草作為重要的經(jīng)濟作物，也是一種重要的模式植物，在研究植物遺傳、生長發(fā)育和防御反應方面發(fā)揮重要作用［8-9］。次生代謝物是植物生長的重要物質(zhì)，廣泛參與植物的生命活動，其差異變化能反映植物對基因或環(huán)境改變的最終響應［10］。隨著代謝組檢測技術的日益成熟，近年來非靶向代謝組在煙葉研究中得到廣泛應用［11］。如：向海英等［12］基于非靶向代謝組學對紅花大金元不同生育期煙葉代謝圖譜進行了差異分析，揭示了不同生育期煙草代謝物變化規(guī)律。李楠芬等［13］進行了不同品種雪茄煙葉晾制后代謝組的差異分析，鑒定出楚雪10號和楚雪14號2個品種煙葉晾制后的葉色差異主要與脯氨酸、水楊酸、黃酮類和生物堿的含量差異有關。因此，為明確有機肥處理對煙葉代謝物的影響，該研究以云煙87為對象，基于非靶向代謝組學，解析了增施炭基（酒糟）有機肥處理后煙葉次生代謝物的積累變化，為煙葉生產(chǎn)中通過合理施用有機肥提高煙葉質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

受試煙草種植于貴州省畢節(jié)市大風科技園，采取小區(qū)種植。在正常煙草管理條件下，設置0、900和1 500 kg/hm2 3個不同梯度的當?shù)厣a(chǎn)用炭基（酒糟）有機肥施肥處理，分別命名為CK、T1和T2。每組3次重復。于打頂后7 d，選取每組6株植株中部健康煙葉混合，將煙葉樣品放入凍存管中并立即放入液氮中保存，在實驗室放入-80 ℃超低溫冰箱保存用于后續(xù)試驗。

1.2 試驗方法和條件

1.2.1 煙葉代謝物的提取。

參照Yin等［14］方法，略有改動：將凍存新鮮煙葉研磨成粉末狀，稱取50 mg粉末，加入1 mL 80%甲醇水溶液。使用超聲儀（KQ-100E，昆山，中國）常溫（25 ℃）超聲提取1 h，期間渦旋3次。10 200 r/min離心15 min，吸取上清液，經(jīng)0.22 μm尼龍微孔過濾樣本后，轉置上樣瓶中，進行代謝組上機檢測。

1.2.2 LC-MS/MS條件。

參照Yin等［14］方法，略有改動：液相色譜分析使用the Dionex UltiMateTM 3 000 UHPLC system（Thermo Fisher Scientific，USA）；ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard預柱（孔徑：1.7 μm，2.1 mm×5.0 mm，Waters，Ireland）；Acquity UPLCBEH C18色譜柱（孔徑：1.7 μm，2.1 mm×150.0 mm，Waters，Ireland）。流動相為0.1%甲酸水溶液（A）和0.1%甲酸乙腈水溶液（B）。流速為0.3 mL/min，柱溫40 ℃，流動相梯度為0～2 min，5%～10% B；2～10 min，10%～25% B；10～15 min，25%～50% B；15～20 min，50%～95% B；20～23 min，95% B；23.0～23.5 min，95%～5% B；23.5～28.0 min，5% B。流速為0.3 mL/min，進樣量為5 μL。

質(zhì)譜分析系統(tǒng)為Thermo ScientificTM Q-ExactiveTM，具體參數(shù)為：正離子模式，加熱電噴霧電離源（HESI），離子源電壓為3.5 kV，毛細管溫度為350 ℃，掃描范圍為100～1 200 m/z。氣流參數(shù)設置：鞘氣（sheath gas）35；輔助氣（auxiliary gas）10；反吹氣（sweep gas）0。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用MS-Dail軟件進行離子峰提取，對齊，得到離子峰信息，包括質(zhì)核比、保留時間、二級質(zhì)譜、峰面積等［15］。注釋數(shù)據(jù)庫由MS-Dail軟件提供，具體數(shù)據(jù)庫見網(wǎng)站http：//prime.psc.riken.jp/compms/msdial/main.html#MSP。差異代謝物統(tǒng)計分析使用Metaboanalyst 5.0（https：//www.metaboanalyst.ca/）網(wǎng)站進行［16］。使用 TBtools軟件繪制差異代謝物熱圖［17］。相關性分析使用R語言psych包corr.test函數(shù)計算，并使用Gephi軟件進行代謝網(wǎng)絡的構建［18］。

2 結果與分析

2.1 煙葉代謝物的提取與鑒定

利用MS-Dail軟件對所測樣本原始離子峰進行提取，從提取的5 047個離子峰中篩選了219個高質(zhì)量的注釋離子峰用于后續(xù)分析（圖1A、表1）。為檢測代謝組數(shù)據(jù)的可靠性，對質(zhì)控樣本進行相關性計算，其相關系數(shù)大于0.99，符合質(zhì)控要求（圖1B）。對所有樣本進行無監(jiān)督的PCA分析（圖1C），施肥量1 500 kg/hm2組（T2）與對照有著顯著的區(qū)分，施肥量900 kg/hm2組（T1）與對照組無顯著區(qū)分。PCA分析表明，所檢測離子峰能反映施肥處理后煙草葉片的代謝差異，且隨著施肥量的增加，煙葉次生代謝差異越大。

2.2 差異代謝物的鑒定

為明確受增施有機肥影響的代謝物，該研究分別將2個處理組與對照組進行差異比較分析。以差異倍數(shù)大于1.5且t-test檢驗P值低于0.05為標準篩選差異離子，差異離子結果見圖2A、2B。900 kg/hm2施肥量（T1）處理后有14個離子積累降低；1 500 kg/hm2施肥量處理（T2）后有26個離子積累降低，1個離子積累增高（圖2B）；同時有7個離子在2種處理濃度中均表現(xiàn)為積累降低（圖2C）。這表明增施有機肥后更多的次生代謝物積累量降低。同時，在差異離子數(shù)量上也表現(xiàn)出與主成分分析一致的結果，施肥量1 500 kg/hm2組（T2）差異離子數(shù)多于900 kg/hm2組（T1）。上述結果表明隨著有機肥施肥量的增加煙葉代謝差異越大。

進一步分析發(fā)現(xiàn)：在7個共有差異離子中，有3個與煙堿相關的代謝物，包括M780（降煙堿，nornicotine）、M1021（尼古丁，nicotine）和M1328（可替寧，cotinine）（表1）。同時，在19個T2組特有的差異離子中，新增2個與煙堿相關的代謝物M781（降煙堿，nornicotine）與M1023（尼古丁，nicotine）（圖3）。結果表明，增施有機肥降低了煙葉煙堿的積累。此外，在T2組特有差異離子中，有M387（L-焦谷氨酸，L-Pyroglutamic acid）和M474（天冬氨酸，Aspartic acid）2種氨基酸相關代謝物；還有M1480（3-甲基-N-苯基苯胺，3-Methyl-N-phenylaniline）、M2154（N，N-二甲基十二胺，N，N-Dimethyldodecylamine）、M2592（N，N-二甲基十二胺N-氧化物，N，N-Dimethyldodecylamine N-oxide）、M3580（月桂基二乙醇胺，Lauryldiethanolamine）和M3810（硬脂酰胺，Stearamide）等胺類相關代謝物（圖3）。

2.3 差異代謝物積累模式分析

研究共鑒定到33個代謝物在增施有機肥后積累降低，具體積累趨勢見圖3。通過t檢驗發(fā)現(xiàn)：有9個代謝物在2個處理中具有積累差異。M780（降煙堿，nornicotine）、M1021（尼古丁，nicotine）和M1328（可替寧，cotinine）3個共有的煙堿類差異代謝物與增施1 500 kg/hm2組（T2）特有的差異煙堿代謝物在2個處理組中均無顯著差異。結果表明，增施900與1 500 kg/hm2有機肥對煙堿積累的影響程度無明顯差異。

2.4 差異代謝物相關性分析

為進一步探究增施有機肥處理對煙葉代謝的影響。通過對差異代謝物進行相關性分析，以差異代謝物為核心篩選極顯著相關（P<0.01）離子構建了代謝網(wǎng)絡（圖4）。尼古丁、降煙堿等差異代謝物處于網(wǎng)絡中央，在網(wǎng)絡中有山奈酚等14種苯丙烷途徑代謝物與差異代謝物緊密正相關。這表明雖然在差異代謝物鑒定過程中這些代謝物沒有顯著的差異，但其與差異代謝物具有相似的積累趨勢，即增施有機肥后這些苯丙烷途徑代謝物積累量降低。

3 討論

化肥與有機肥的混合使用是施肥體系發(fā)展的趨勢。化肥能穩(wěn)定、高效地提供作物生長的營養(yǎng)元素，而有機肥能長時間養(yǎng)護土壤肥力。長期的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐表明，增施有機肥可提高煙草產(chǎn)量，試驗研究也證實，增施有機肥處理后，煙葉葉片面積與植株株高、莖圍等指標顯著增加［19］。因此有機肥對煙草營養(yǎng)生長有著促進作用。研究表明，隨著有機肥施用量的增加，煙草鮮葉中次生代謝物如煙堿積累量顯著降低，苯丙烷途徑大量代謝物也具有積累降低的趨勢。這可能是土壤肥力增加，煙葉營養(yǎng)生長增強，從而減少非必要次生代謝的表現(xiàn)。

有機肥對煙葉品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在改善烤后煙葉外觀、煙堿含量和香氣3個方面［20］。張煥菊等［21］通過以有機肥代替部分化肥的方法對煙葉品質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，中部葉、上部葉煙堿含量具有降低的趨勢。這一結果與該研究增施有機肥煙堿相關代謝物積累量降低一致。該研究中，3個T1和T2共有的含量降低的煙堿類代謝物在T1和T2 組間無顯著積累差異，表明隨著施肥量的增加對煙葉中煙堿積累的影響逐漸變小。煙堿是煙葉的重要次生代謝物，各種香煙工藝對煙堿含量的要求不同。綜合上述結果，在生產(chǎn)中可以嘗試通過控制有機肥的施用量來調(diào)節(jié)煙葉煙堿含量，從而滿足不同的香煙工藝需求。

向海英等［12］對紅花大金元的研究表明，煙葉中代謝物的積累量是互相影響的。其研究發(fā)現(xiàn)，煙堿的積累與山奈酚含量顯著正相關。在該研究中也發(fā)現(xiàn)，山奈酚等14種苯丙烷代謝物的積累趨勢與煙堿含量具有顯著的正相關，這些代謝物在不同施肥處理后具有低積累的趨勢但不具有顯著性。因此增施有機肥后山奈酚等苯丙烷代謝物積累降低更可能的是受到煙堿積累量的影響，即有機肥通過影響煙堿的含量間接影響了山奈酚等苯丙烷代謝物的積累。

4 結論

增施0、900和1 500 kg/hm2 3個不同梯度的炭基（酒糟）有機肥后3種煙堿類代謝物積累量顯著降低，同時14種苯丙烷代謝物的積累趨勢與煙堿含量緊密正相關，具有降低趨勢。綜上可知，可以通過合理增施有機肥來調(diào)控煙葉煙堿含量。

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