摘要 ［目的］建立同時(shí)測(cè)定大豆分離蛋白中4種嘌呤的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。［方法］采用三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）將樣品中的嘌呤進(jìn)行水解和提取，并用水稀釋。以含0.002%甲酸水溶液-甲醇體系為流動(dòng)相，選擇安捷倫超高壓色譜柱 Poroshell 120 EC-C18分離4種嘌呤化合物（鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤），以質(zhì)譜條件為電噴霧（ESI）正離子電離，MRM模式，外標(biāo)法定量測(cè)定。［結(jié)果］在1～200 ng/mL濃度范圍內(nèi)，4種嘌呤均具有較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均不低于0.999 定量限（LOQ）和檢出限（LOD）分別在0.24～3.00和0.08～1.00 mg/kg。在3個(gè)濃度級(jí)別的加標(biāo)水平下，4種嘌呤的平均回收率在81.7%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于8.6%（n=6）。［結(jié)論］該方法可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)捷快速，具有較高的靈敏度、回收率和精密度，可以同時(shí)檢測(cè)大豆分離蛋白中的4種嘌呤化合物。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；嘌呤；大豆分離蛋白

中圖分類(lèi)號(hào) TS 207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2024）20-0179-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.043

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Determination of Purines in Soybean Protein Isolate by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

PENG Jing-ya 3，LIN Qin-heng 3，PAN Yun-shan 3 et al

（1.Institute of Analysis，Guangdong Academy of Sciences （China National Analytical Center，Guangzhou），Guangzhou，Guangdong 510070;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Chemical Measurement and Emergency Test Technology，Guangzhou，Guangdong 510070;3.Guangdong Provincial Engineering Research Center for Efficacy Component Testing and Risk Substance Rapid Screening of Health Food，Guangzhou，Guangdong 510070）

Abstract ［Obiective］To establish a method for the simultaneous measurement of 4 purines in soybean protein isolate （SPI） using UPLC-MS/MS.［Method］Purines in SPI samples were hydrolyzed and extracted with trifluoroacetic acid：formic acid （V∶V=1∶1），and diluted with water.The 4 purines （guanine，adenine，hypoxanthine and xanthine） were then separated on an Agilent Poroshell 120 EC-C18 column，using 0.002% formic acid aqueous solution and methanol as mobile phases with gradient elution.Subsequently，the target compounds were analyzed with electrospray ionizationsource in positive ion mode under multi-reaction monitoring mode，employing the external standard quantitative method.［Result］Within the concentration range of 1-200 ng/mL，all four purines had good linear relationships，with correlation coefficients （r） exceeding 0.999 1.The limits of quantitation （LOQ） and the limits of detection （LOD） for the four purines were in the range of 0.24-3.00 mg/kg and 0.08-1.00 mg/kg.The spiked experiments were performed at three concentration levels，and the average recovery rates for the four components ranged from 81.7% to 95.2%，with RSD all less than 8.6%（n=6）.［Conclusion］This method is highly operable，simple and fast，with high sensitivity，recovery rate and precision，and can simultaneously detect four purine compounds in soy protein isolate.

Key words Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry;Purine;Soybean protein isolate

大豆是一種優(yōu)良的糧食作物，不僅營(yíng)養(yǎng)豐富、口味佳，還兼具保健功能。大豆的蛋白質(zhì)含量約占其總干重的40%［1］，是食物中非常重要的蛋白質(zhì)來(lái)源，相關(guān)的深加工產(chǎn)品也已得到充分的開(kāi)發(fā)，如大豆粉、分離蛋白、濃縮蛋白和組織蛋白等［2］。其中大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種全價(jià)蛋白制品，以低溫脫溶大豆粕為原料，經(jīng)過(guò)堿溶酸沉法等工藝生產(chǎn)而得［3］。SPI的外觀為乳白色至淡黃色粉末，一般含有多種氨基酸成分和不低于90%的蛋白質(zhì)含量［4］，是一種優(yōu)良的蛋白質(zhì)原料。SPI還表現(xiàn)出良好的食品加工性能，被廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品、面制品和抗菌保鮮包裝等領(lǐng)域［5-6］，同時(shí)因其具有保健作用，在保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域也有一定的應(yīng)用［7］。

嘌呤類(lèi)物質(zhì)是生物體內(nèi)核酸的主要組成部分，包含鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤和各自的衍生物，具有多種生物學(xué)功能，對(duì)機(jī)體的能量供應(yīng)和新陳代謝起著關(guān)鍵作用［8-9］。如果機(jī)體內(nèi)嘌呤物質(zhì)的代謝長(zhǎng)期出現(xiàn)紊亂，將會(huì)發(fā)展成高尿酸血癥，并極有可能導(dǎo)致痛風(fēng)等代謝性疾病［10］。研究表明，限制飲食中嘌呤的攝入可預(yù)防高尿酸血癥或減輕其相關(guān)癥狀［11］。大豆及其相關(guān)制品一直都被認(rèn)為是高嘌呤食物的代表［12］，但有報(bào)道稱，大豆蛋白中嘌呤含量為0.388 mg/g［13］，而SPI在其加工過(guò)程中嘌呤脫除率也較高［14］，表明這2類(lèi)大豆制品應(yīng)屬于低嘌呤食物。目前關(guān)于SPI嘌呤含量的研究較少，SPI是否為高嘌呤食物仍存在爭(zhēng)議，因此有必要開(kāi)發(fā)相關(guān)的測(cè)試方法，更深入地研究SPI的嘌呤含量，才能更科學(xué)地將其應(yīng)用于膳食食品中。

目前鮮見(jiàn)SPI中嘌呤測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道，食品中常見(jiàn)的嘌呤測(cè)試方法主要有毛細(xì)管電泳色譜法［15］、高效液相色譜法［16］和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［17］等，后2種是目前較主流的檢測(cè)方法。嘌呤為弱堿性化合物，在反向高效液相色譜中保留較弱、分離度較差，導(dǎo)致干擾因素多、準(zhǔn)確率低，需要結(jié)合三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定才能提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。該試驗(yàn)在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，采用三氟乙酸與甲酸的混合酸對(duì)SPI樣品中的嘌呤組分進(jìn)行水解和提取，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時(shí)檢測(cè)SPI中4種嘌呤（鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、黃嘌呤）的方法，以期為充分了解SPI中的嘌呤含量提供測(cè)試手段和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤（含量≥99.8%），采購(gòu)自上海詩(shī)丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，次黃嘌呤（含量99.6%），采購(gòu)自美國(guó)sigma-aldrich公司；甲醇（色譜純，美國(guó)honeywell公司）；甲酸、三氟乙酸（色譜純，上海麥克林生化科技有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）；SPI粉末樣品為實(shí)驗(yàn)室留樣；實(shí)驗(yàn)室用水為蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

1290型超高效液相色譜儀，配有6460A型三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；FB15067型超聲波清洗器（美國(guó)賽默飛公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海恒一科學(xué)儀器公司）；XW-80A型旋渦振蕩器（上海琪特分析儀器公司）；BSA224S型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司，感量0.000 1 g）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 前處理方法。將SPI樣品均質(zhì)后，稱取約0.2 g樣品（精確至0.001 g）于25 mL試管中，加入1 mL水超聲振蕩至樣品溶解。加入6 mL三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1），立即振蕩1 min，輕輕蓋上試管塞（勿擰緊），并置于90 ℃水浴中水解15 min。水解結(jié)束后待其恢復(fù)至室溫，調(diào)節(jié)水解液的pH為接近中性，最后用水定容至25 mL并充分搖勻。根據(jù)樣品的嘌呤含量，用水進(jìn)一步稀釋至合適濃度。樣液經(jīng) 0.22 μm PTFE濾膜過(guò)濾后，供上機(jī)測(cè)定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別準(zhǔn)確稱取鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品約25 mg，分別用水超聲溶解，可加入少量的氫氧化鈉或稀鹽酸溶液助溶，定容至25 mL，配制成1.0 mg/mL的單一嘌呤儲(chǔ)備溶液。然后分別精密吸取上述4種儲(chǔ)備溶液1 mL，混合，并用水定容至100 mL，稀釋成10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述溶液均置于4 ℃保存。上機(jī)測(cè)定前，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液根據(jù)需求，現(xiàn)配現(xiàn)用，進(jìn)一步稀釋成終濃度為1～200 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液。

1.3.3 色譜條件。超高壓色譜柱Poroshell 120 EC-C18 （美國(guó)安捷倫公司，3.0 mm×150 mm，2.7 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為含0.002%甲酸的水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫程序：0～5.5 min，0～5% B;5.5～5.6 min，5%～95% B;5.6～8.0 min，95% B;8.0～8.1 min，95%～0% B;8.1～12.0 min，0% B；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件。AJS ESI離子源，帶有鞘氣流；使用正離子掃描方式和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)模式（MRM）；毛細(xì)管電壓為3.5 kV；霧化氣為310.26 kPa；干燥氣和鞘氣，流速分別為6.0和10.0 L/min，溫度均為350 ℃。4種嘌呤化合物的色譜保留時(shí)間和質(zhì)譜分析參數(shù)詳見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸水解條件的優(yōu)化

嘌呤包括結(jié)合態(tài)嘌呤和游離態(tài)嘌呤，生物體中的嘌呤主要以結(jié)合態(tài)為主。結(jié)合態(tài)嘌呤必須水解為游離態(tài)才能被測(cè)定，水解方式一般采用酸水解，常用的酸類(lèi)主要是高氯酸或三氟乙酸與甲酸的混合酸。有研究表明，采用三氟乙酸∶甲酸（V∶V=1∶1）混合酸（以下簡(jiǎn)稱TF混合酸）進(jìn)行水解，嘌呤損失少，效果較好［18-19］。SPI樣品中蛋白質(zhì)含量較高，可以參考高蛋白含量的樣品如肉類(lèi)或蛋白樣品等的酸水解條件。楊平等［20］測(cè)定豬里脊肉中嘌呤含量采用的酸水解條件為：0.2 g 肉泥加入1 mL超純水，再加入10 mL TF混合酸，90 ℃水浴水解12 min；武惠敏等［13］測(cè)定酵母蛋白中嘌呤含量采用的酸水解條件為：0.200 g樣品加入1 mL 水，再加入10 mL TF混合酸，85 ℃水浴水解15 min。故SPI的水解可以考慮采用TF混合酸在90 ℃水浴中水解15 min，但由于SPI為十分細(xì)膩的粉末且易溶于水，酸的用量不宜過(guò)多。孫玉鳳等［21］測(cè)定大豆粉末中嘌呤含量采用的酸水解條件為：0.100 g樣品加入1 mL 水混勻，再加入1 mL TF混合酸，100 ℃水浴水解30 min，大約相當(dāng)于0.2 g樣品僅加入1 mL TF混合酸水解；同時(shí)由于酸的用量減少，其水解的溫度和時(shí)間都有所提升，而水解時(shí)間的延長(zhǎng)也降低了前處理的效率。因此，為了同時(shí)保證前處理的效果和效率，有必要進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)確定 TF 混合酸的適宜用量。

綜合參考上述方法，該研究選擇以90 ℃水浴水解15 min為固定條件，并以2個(gè)不同來(lái)源的SPI樣品為對(duì)象，比較考察了2、4、6、8、10 mL的TF混合酸用量對(duì)嘌呤的水解提取效果。前處理按“1.3.1”的方法進(jìn)行（其中TF混合酸的用量分別加入2、4、6、8、10 mL），再按“1.3.3”和“1.3.4”的條件上機(jī)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，2個(gè)SPI樣品中，鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤含量均較高，次黃嘌呤含量較低，而黃嘌呤則未檢出；同時(shí)，鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和總嘌呤的含量在TF混合酸用量為6 mL時(shí)均達(dá)到了峰值，隨著TF混合酸用量繼續(xù)增加，嘌呤含量反而有所下降，這說(shuō)明過(guò)量的TF混合酸會(huì)導(dǎo)致游離態(tài)的嘌呤發(fā)生降解，使嘌呤含量偏低。故該試驗(yàn)選擇TF混合酸的用量為6 mL。

2.2 色譜條件的選擇

色譜柱采用安捷倫 Poroshell 120 EC-C18，固定甲醇為有機(jī)洗脫液，對(duì)3種無(wú)機(jī)流動(dòng)相（水、含1 mmol/L 乙酸銨水、含0.002%甲酸水）分離4種嘌呤的效果進(jìn)行考察。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同的無(wú)機(jī)流動(dòng)相對(duì)腺嘌呤的保留時(shí)間影響較大，對(duì)另外3種嘌呤的保留時(shí)間影響則較小。以水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，腺嘌呤保留時(shí)間為6.10 min，與其他3種嘌呤的分離度較好，但鳥(niǎo)嘌呤和次黃嘌呤的出峰時(shí)間分別為4.85和4.90 min，兩者十分接近；以含1 mmol/L乙酸銨水-甲醇為流動(dòng)相時(shí)，腺嘌呤的保留時(shí)間大大提前，但與鳥(niǎo)嘌呤重疊，兩者保留時(shí)間皆為3.6 min，分離效果不佳；當(dāng)流動(dòng)相采用含0.002%甲酸水-甲醇體系時(shí)，4種嘌呤化合物的出峰都沒(méi)有重疊，峰型較好，分離度相對(duì)達(dá)到最優(yōu)（圖1）。因此，該試驗(yàn)的無(wú)機(jī)流動(dòng)相選擇含0.002%甲酸的水溶液。

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

以4種嘌呤化合物濃度為0.5 μg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)溶液為目標(biāo)物，進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描（負(fù)離子、正離子檢測(cè)模式分別進(jìn)行），結(jié)果顯示4種嘌呤化合物均在正離子模式下表現(xiàn)出較高的響應(yīng)值，能形成［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰。然后在正離子模式下繼續(xù)優(yōu)化［M+H］+離子的去簇電壓，并利用二級(jí)質(zhì)譜MRM模式確定4種嘌呤化合物的定性定量子離子及其最優(yōu)碰撞能量，最終得到4種嘌呤化合物在儀器上的最佳參數(shù)。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性關(guān)系、定量限及檢出限。將“1.3.2”的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液按“1.3.3”色譜條件和“1.3.4”質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，考察4種嘌呤目標(biāo)物的線性關(guān)系。將分析結(jié)果以定量離子響應(yīng)值對(duì)目標(biāo)物質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，計(jì)算其線性方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，定量限（LOQ）和檢出限（LOD）則按照各目標(biāo)物定量離子的10倍信噪比和3倍信噪比所對(duì)應(yīng)的濃度分別計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3。鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤和次黃嘌呤在1～200 ng/mL、黃嘌呤在5～200 ng/mL均表現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）在0.999 1～0.999 7，4種嘌呤的定量限和檢出限分別為0.24～3.00和0.08～1.00 mg/kg。

2.4.2 加標(biāo)回收率與精密度。選擇適宜的已知嘌呤含量的SPI樣品為研究對(duì)象，并根據(jù)樣品嘌呤含量配制對(duì)應(yīng)濃度的用于加標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。按每種嘌呤本底值的0.5、1.0和1.5倍共3個(gè)濃度級(jí)別添加嘌呤標(biāo)液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，由于樣品中黃嘌呤為未檢出（＜3.0 mg/kg），則按其定量限的1、3和10倍的濃度級(jí)別添加嘌呤標(biāo)液。每個(gè)濃度水平均重復(fù)制備6份，按“1.3”試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，得到相應(yīng)的回收率和精密度結(jié)果。結(jié)果見(jiàn)表4，4種嘌呤的平均回收率為81.7%～95.2%，說(shuō)明該方法的前處理?xiàng)l件可有效提取和保留樣品中的嘌呤化合物，損失較少，分析干擾較小，準(zhǔn)確度較高；4種嘌呤的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.7%～8.6%，精密度良好，能滿足一般檢測(cè)要求。

2.5 實(shí)際樣品分析

使用該試驗(yàn)優(yōu)化的方法對(duì)10批不同來(lái)源的SPI樣品進(jìn)行4種嘌呤的測(cè)定分析，并將各組分加和計(jì)算總嘌呤含量。測(cè)定結(jié)果如表5所示，SPI樣品中鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的含量較高，鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤分別占總嘌呤的43.3%～58.8%和40.8%～55.5%，次黃嘌呤占總嘌呤的0.14%～1.21%，而黃嘌呤則均為未檢出（＜3.0 mg/kg），說(shuō)明SPI中次黃嘌呤的含量非常低且?guī)缀醪缓悬S嘌呤。10批SPI樣品中總嘌呤的含量為1 236.6～3 636.9 mg/kg，平均值為2 209.9 mg/kg，與干黃豆的嘌呤含量（2 181.9 mg/kg）［12］接近。一般認(rèn)為，食物中的嘌呤含量為 2 000～3 000 mg/kg時(shí)，屬于較高組；嘌呤含量超過(guò)3 000 mg/kg時(shí)，屬于非常高組［22］。這表明SPI屬于嘌呤含量較高的食物，將其作為補(bǔ)充蛋白質(zhì)的膳食食品原料或添加劑時(shí)，應(yīng)充分考慮其用量和搭配，才能更有效地預(yù)防和控制高尿酸血癥和痛風(fēng)等疾病。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)開(kāi)發(fā)了同時(shí)測(cè)定SPI中鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤和黃嘌呤含量的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。該方法簡(jiǎn)單快速、可操作性強(qiáng)，相比于主流的高效液相色譜法效率更高、選擇性更強(qiáng)。對(duì)方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量可靠性、定量限和檢出限、準(zhǔn)確度和精密度等參數(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明該方法靈敏度較高、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、回收率高、重復(fù)性好、滿足一般檢測(cè)要求。應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定證實(shí)了其有效性和適用性，測(cè)試結(jié)果也顯示SPI中嘌呤含量較高，屬于高嘌呤食物。該方法為SPI在膳食食品中的科學(xué)應(yīng)用提供參考依據(jù)，也為其他類(lèi)型樣品中嘌呤化合物及其類(lèi)似物的測(cè)試提供了借鑒。

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