關(guān)鍵詞：紅壤；調(diào)酸；宏基因組；微生物群落；碳／氮代謝過程

紅壤在我國南方分布廣泛，是重要的耕地資源，但酸性強、基礎(chǔ)肥力低，限制了其土壤生產(chǎn)力。土壤微生物是反映土壤肥力的潛在因子，其生長和活性受土壤pH的影響。土壤pH是影響微生物代謝和群落組成的關(guān)鍵指標，研究表明，土壤pH降低時，微生物活性受抑制，酶活性降低，土壤養(yǎng)分運轉(zhuǎn)受限。同時，土壤養(yǎng)分含量與環(huán)境變化是微生物的重要限制因素，養(yǎng)分變化影響土壤微生物特性，碳、氮是構(gòu)成生物基本骨架和能量代謝的基本元素，其循環(huán)關(guān)系到生物生長和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，二者相互偶聯(lián)與制約，微生物驅(qū)動的土壤碳、氮代謝是預(yù)測土壤質(zhì)量動態(tài)變化的重要依據(jù)。細菌、真菌和古菌通過自身生長代謝參與土壤養(yǎng)分分解和轉(zhuǎn)化，為養(yǎng)分循環(huán)和能量流動提供動力和保障，在土壤碳氮循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。研究酸性紅壤微生物群落組成及其碳、氮代謝關(guān)鍵微生物可為紅壤改良提供理論依據(jù)。

近年來，針對紅壤酸性改良開展了多項研究，改良常用措施有石灰、有機肥和有機無機肥配施等。石灰緩解土壤酸化，增加土壤有效養(yǎng)分含量，提高土壤細菌群落多樣性指數(shù)；有機肥（如動物糞便）可增強土壤緩沖性能，降低A13+活性，并提高土壤肥力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；有機無機肥配施有效提高土壤肥力和養(yǎng)分有效性，改變細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)；利用氧化鈣改善土壤酸性的研究較普遍，氧化鎂與氧化鈣都屬于堿性氧化物，兩者共同添加可增加土壤中鈣、鎂離子的養(yǎng)分，同時兩種陽離子可以與土壤中H+和Al3+競爭吸附點位，提高土壤pH，改善土壤肥力。隨著土壤微生物研究的深入，宏基因測序技術(shù)可揭示土壤中全部存在的微生物遺傳組成和群落功能，建立土壤微生物與環(huán)境之間的關(guān)系，宏基因組測序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于土壤微生物研究。

為探究紅壤微生物群落對不同調(diào)酸劑的響應(yīng)，本研究采用宏基因組學(xué)技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)分析，探究不同調(diào)酸劑對紅壤微生物群落的影響，深入分析碳氮代謝過程相關(guān)微生物，揭示調(diào)酸劑對碳氮代謝的潛在影響，為紅壤合理高效的調(diào)酸方案提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1土壤采集與試驗設(shè)計

試驗于2021年在湖南省土壤肥料研究所進行，試驗土壤采自岳陽市岳陽縣三合鄉(xiāng)中心村，該地區(qū)屬亞熱帶季風(fēng)氣候，全年平均氣溫20℃，年平均降水量1310mm，土壤類型為第四紀紅色黏土發(fā)育的紅壤。按S型布設(shè)采樣點，采集表層0～20cm土壤，土樣立即剔除礫石及植物根莖等雜物，自然風(fēng)干后，過2mm篩，保存用于裝盆。供試玉米品種為湘康玉7號，種植作物種子需提前催芽，試驗采用內(nèi)徑35cm、高33cm塑料桶，桶底內(nèi)放置尼龍網(wǎng)。本試驗設(shè)置4個處理，分別為不施肥（CK）、施鈣鎂復(fù)合劑（L，0.04%氧化鈣+0.0072%氧化鎂）、鈣鎂復(fù)合劑配施豬糞（ML，2%豬糞+鈣鎂復(fù)合劑）和鈣鎂復(fù)合劑配施秸稈（SL，2%玉米秸稈+鈣鎂復(fù)合劑）。將供試土壤調(diào)至70%含水量，各調(diào)酸材料與土壤按比例混勻，每盆裝土18kg，每個處理設(shè)3個重復(fù)，每盆播種2～3粒種子，出苗10d后間苗，每盆保留1株，定期澆蒸餾水，每兩周將盆隨機調(diào)換。待玉米收獲后，去除地上部分，一部分土樣風(fēng)干粉碎后用于土壤基本理化性質(zhì)測定，另一部分土樣儲存于-80℃下用于宏基因組測序。

1.2樣品測定與DNA提取

理化性質(zhì)測定采用常規(guī)方法。土壤pH采用電位法，水土比為2.5：1（V/m）；土壤有機碳采用重鉻酸鉀一濃硫酸氧化法；土壤全氮采用半微量凱式定氮法；土壤有效磷采用碳酸氫鈉浸提法；土壤速效鉀采用醋酸銨浸提火焰光度法；交換性鈣／鎂采用醋酸銨交換原子吸收光度法；交換性酸采用氯化鉀交換法。使用NEXTFLEXTM Rapid DNA-Seq Kit試劑盒（美國）對新鮮土壤提取DNA，使用NanoDrop 2000檢測DNA純度，使用TBS-380檢測DNA濃度。通過CovarisM220將DNA打斷為約400 bp的片段，建庫試劑盒使用NEXTFLEX Rapid DNA-SEQ Kit（美國）。通過美吉生物技術(shù)有限公司（上海）PE150策略，在IlluminaHiSeq X-ten平臺（美國Illumina）進行宏基因組測序。

1.3宏基因組測序與數(shù)據(jù)處理

使用軟件fastp去除質(zhì)量剪切后長度小于50 bp、平均質(zhì)量低于20以及含N堿基的reads，保留高質(zhì)量reads；其次使用Megahit軟件對優(yōu)化序列進行組裝；再次使用Prodigal對拼接結(jié)果中的contigs進行ORF預(yù)測。選擇核酸長度≥100 bp的基因，將其翻譯為氨基酸序列。用CD-HIT軟件進行聚類構(gòu)建非冗余基因集。使用SOAPaligner軟件分別將每個樣品的高質(zhì)量reads與非冗余基因集進行比對，統(tǒng)計對應(yīng)樣品中的基因豐度信息。使用DIAMOND將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得物種注釋結(jié)果，物種對應(yīng)的基因豐度總和用于計算該物種的豐度。使用DIA-MOND將非冗余基因集序列與KEGG PATHWAY的基因數(shù)據(jù)庫進行比對，根據(jù)Pathway代謝通路對應(yīng)的基因豐度總和計算碳／氮代謝對應(yīng)類別的物種豐度。

使用Microsoft Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析；利用SPSS 26.0軟件對不同調(diào)酸劑處理進行單因素方差分析，運用Duncan法進行顯著性檢驗；采用R語言的ggplot2包繪制微生物群落相對豐度圈圖和碳氮代謝微生物貢獻度柱形圖；使用軟件Canoco5.0進行土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性狀的冗余分析。

2結(jié)果與分析

2.1紅壤基本理化性質(zhì)

不同調(diào)酸劑顯著提升了土壤pH并改變了紅壤養(yǎng)分含量（表1）?？傮w上，與CK相比：各處理顯著提高了土壤pH、交換性鈣和交換性鎂含量（Plt;0.05），顯著降低交換性酸含量（Plt;0.05）；土壤有機碳和速效鉀含量均有所提高。不同處理之間，L處理的土壤pH最低（5.85），顯著低于ML處理（6.14）與SL處理（5.92）；ML處理的土壤pH、速效磷、交換性鈣和交換性鎂含量顯著高于L處理和SL處理（Plt;0.05）；SL處理的土壤有機碳和速效鉀含量顯著高于L處理和ML處理（Plt;0.05）；土壤全氮含量在3個處理之間無顯著差異。

2.2紅壤微生物群落結(jié)構(gòu)

2.2.1土壤微生物豐度

對土壤微生物進行物種注釋，發(fā)現(xiàn)不同調(diào)酸劑對細菌、真菌和古菌豐度的影響不同（表2）。各處理微生物以細菌為主，占99.25%～99.71%，真菌占0.04%～0.45%，古菌占0.25%～0.53%，總體上，細菌在L處理中豐度最高，真菌在SL處理中豐度最高，古菌在CK處理中豐度最高。L處理的細菌和古菌豐度高于ML處理與SL處理，SL處理的真菌豐度高于L處理和ML處理。

2.2.2土壤微生物群落組成

土壤細菌、真菌和古菌受不同調(diào)酸劑的響應(yīng)不同，所占比例見圖1，相對豐度gt;1%的微生物視為優(yōu)勢菌。土壤細菌群落（圖1a）相對豐度前4的優(yōu)勢菌門有變形菌門（Proteobacteria，22.64%～45.18%）、放線菌門（Actinobacteria，17.95%～28.08%）、綠彎菌門（Chloroflexi．8.70%～22.44%）和酸桿菌門（Acidobacte-ria．10.86%～17.66%）。與CK處理相比：3個處理主要提高了變形菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度。ML處理和SL處理相對于L處理增加了酸桿菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門的相對豐度，ML處理的放線菌門和綠彎菌門相對豐度高于SL處理，而變形菌門和酸桿菌門的相對豐度低于SL處理。土壤真菌群落（圖1b）相對豐度前3的優(yōu)勢菌門有子囊菌門（Ascomvcota，20.18%～88.86%）、毛霉菌門（Mucoromycota，8.58%～47.26%）和擔(dān)子菌門（Basid-iomYcota，1.41%～35.68%）。整體上，與CK處理相比，3個處理均降低了毛霉菌門的相對豐度，L處理降低了子囊菌門的相對豐度，增加了擔(dān)子菌門的相對豐度，ML處理和SL處理提高了子囊菌門的相對豐度，降低了擔(dān)子菌門的相對豐度。調(diào)酸處理之間，ML和SL處理的子囊菌門相對豐度高于L處理，毛霉菌門和擔(dān)子菌門相對豐度低于L處理，SL處理相對于ML處理提高了子囊菌門的相對豐度，降低了毛霉菌門與擔(dān)子菌門的相對豐度。土壤古菌群落（圖1c）相對豐度前5的優(yōu)勢菌門是奇古菌門（Thaumarchaeota，39.77%～68.34%）、廣古菌門（Eurvarchaeota，16.38%～27.03%）、深古菌門（Candidatus_Bathyarchaeota．4.56%～6.91%）、Candidatus Woesearchaeota菌門（1.34%～14.23%）和泉古菌門（Crenarchaeota，1.67%～2.25%）。與CK處理對比：3個處理分別提高了廣古菌門、深古菌門和Candidatus Woesearchaeota菌門的相對豐度，降低了奇古菌門的相對豐度。ML與SL處理的奇古菌門和深古菌門的相對豐度高于L處理，廣古菌門和Candidatus Woesearchaeota菌門的相對豐度低于L處理。SL處理的奇古菌門和Candidatus Wo-esearchaeota菌門的相對豐度高于ML處理，而廣古菌門和深古菌門的相對豐度低于ML處理。

2.3土壤理化性質(zhì)與微生物群落組成的關(guān)系

采用冗余分析（RDA）研究土壤理化性質(zhì)對門水平上細菌、真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)的影響（圖2）。速效鉀（P=0.008）、有效磷（P=0.014）、全氮（P=0.006）和交換性鎂（P=0.026）是影響土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素（圖2a），分別解釋細菌結(jié)構(gòu)變異的35.8%、25.9%、13.0%和2.9%，其中放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門與有效磷呈顯著正相關(guān)，與速效鉀、全氮和交換性鎂呈顯著負相關(guān)。速效鉀（P=0.004）、交換性鎂（P=0.002）、有機碳（P=0.022）、土壤pH （P=0.028）和全氮（P=0.042）是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素（圖2b），分別解釋真菌結(jié)構(gòu)變異的81.4%、11.0%、3.0%、1.8%和0.8%，子囊菌門與速效鉀、有機碳、全氮和土壤pH呈顯著正相關(guān)，毛霉菌門和擔(dān)子菌門與速效鉀、有機碳、全氮、pH和交換性鎂呈顯著負相關(guān)。從圖2c分析可知，土壤pH、有機碳、交換性鎂和交換性鈣是影響土壤古菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素，分別解釋古菌群落結(jié)構(gòu)變異的74.6%、14.7%、7.4%和1.2%，其中Candida-tus Woesearchaeota菌門與土壤pH、交換性鈣和交換性鎂呈顯著正相關(guān)，奇古菌門、廣古菌門、深古菌門和泉古菌門與土壤pH、交換性鈣和交換性鎂呈顯著負相關(guān)。以上結(jié)果表明，交換性鎂是影響紅壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的主要影響因子。

2.4碳代謝過程微生物

從圖3可知，通過分析不同調(diào)酸劑處理土壤微生物（門水平）對碳代謝途徑的貢獻率，發(fā)現(xiàn)變形菌門（23.49%～47.20%）、放線菌門（19.22%～28.20%）、綠彎菌門（8.89%～24.26%）、酸桿菌門（8.64%～14.08%）和芽單胞菌門（1.09%～6.35%）是對碳代謝過程貢獻度較大的前5種菌門。與CK處理相比，3個處理增加了變形菌門和芽單胞菌門對碳代謝過程的貢獻度，但減少了綠彎菌門和酸桿菌門的貢獻度。變形菌門（47.20%）和酸桿菌門（11.89%）在SL處理中對碳代謝貢獻度最高，放線菌門（28.20%）和芽單胞菌門（6.35%）在ML處理中的貢獻度最高（6.35%）．綠彎菌門在L處理中的貢獻度高于ML處理和SL處理。

2.5氮代謝過程微生物

從圖4可知，通過氮代謝門水平微生物的功能貢獻度分析顯示，在微生物驅(qū)動的氮代謝過程中，發(fā)現(xiàn)硝化過程、反硝化過程與硝酸鹽異化還原過程受調(diào)酸劑影響較大。反硝化過程中變形菌門（44.58%～55.88%）、放線菌門（13.80%～20.88%）、綠彎菌門（2.35%～5.90%）、酸桿菌門（2.51%～11.32%）和芽單胞菌門（1.12%～11.32%）的貢獻度較大。與CK處理相比，3個處理增加了變形菌門和芽單胞菌門對反硝化作用的貢獻度，降低了綠彎菌門和酸桿菌門的貢獻度。L處理的變形菌門和綠彎菌門的貢獻度高于ML和SL處理，ML處理的放線菌門和芽單胞菌門的貢獻度高于L和SL處理，SL處理的酸桿菌門的貢獻度最高。硝酸鹽異化還原過程中貢獻度前3的菌門是變形菌門（40.79%～56.83%）、放線菌門（16.93%～38.28%）和酸桿菌門（5.51%～14.35%）。與CK處理相比，3個處理增加了變形菌門對硝酸鹽異化還原作用的貢獻度，降低了酸桿菌門的貢獻度。SL處理中變形菌門（56.83%）和酸桿菌門（9.45%）的貢獻度高于L和ML處理，ML處理中放線菌門的貢獻度最高（38.28%）。硝化過程中變形菌門只存在于L處理和ML處理中，貢獻度分別為3.86%和8.43%，綠彎菌門（84.27%～97.06%）對硝化作用貢獻度占比最高，SL處理中綠彎菌門對反硝化作用的貢獻度（97.06%）高于CK處理（94.58%）和ML處理（85.84%）。

3討論

3.1不同調(diào)酸劑對紅壤微生物群落組成的影響

不同調(diào)酸劑影響種植玉米紅壤中細菌、真菌和古菌群落（圖1）。與CK相比，3個處理增加了變形菌門的相對豐度，降低了綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度（圖1a），分析其與土壤pH變化有關(guān)。本試驗中，單施鈣鎂復(fù)合劑、鈣鎂復(fù)合劑配施有機肥／秸稈顯著提高土壤pH，而土壤pH可通過影響土壤養(yǎng)分含量的利用率改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。酸桿菌門屬于嗜酸性細菌，酸性土壤環(huán)境利于其生長繁殖，隨著土壤pH的增加，其相對豐度逐漸降低。此外，有研究表明變形菌門的相對豐度會隨著酸桿菌門的減少而增加，隨著土壤pH的提高而增多。與鈣鎂復(fù)合劑配施糞肥處理相比，配施秸稈可提高變形菌門和酸桿菌門的相對豐度，降低放線菌門和綠彎菌門的相對豐度。變形菌門作為富營養(yǎng)菌群，可在高有機質(zhì)水平土壤環(huán)境中迅速繁殖，而放線菌門和綠彎菌門對貧瘠營養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性強，屬于耐脅迫能力較強的微生物，適宜在低養(yǎng)分環(huán)境中生長繁殖。本試驗中，鈣鎂復(fù)合劑配施秸稈的處理提高了有機碳和速效鉀含量，更適合富營養(yǎng)菌（變形菌門）的生長，相比之下，單施鈣鎂復(fù)合劑更利于耐脅迫菌群（綠彎菌門和酸桿菌門）的生長繁殖。

真菌群落中子囊菌門、毛霉菌門和擔(dān)子菌門為主要菌群（圖1b）。子囊菌門與擔(dān)子菌門多為腐生菌，子囊菌門可分解土壤中難降解有機質(zhì)以促進土壤養(yǎng)分循環(huán)，比擔(dān)子菌門的物種進化速度高，而擔(dān)子菌門更適合于低營養(yǎng)環(huán)境。本試驗鈣鎂復(fù)合劑配施糞肥／秸稈相對于單施鈣鎂復(fù)合劑提高了子囊菌門的相對豐度，降低了擔(dān)子菌門的相對豐度，子囊菌門與全氮、有機碳和pH呈顯著正相關(guān)，而擔(dān)子菌門與以上理化因子呈顯著負相關(guān)。配施糞肥／秸稈為子囊菌門生長發(fā)育提供了適宜的生存環(huán)境，有利于促進利用植物殘體降解的菌群快速生長繁殖，相較于子囊菌門，擔(dān)子菌門更能適應(yīng)貧瘠環(huán)境，擔(dān)子菌門相對豐度的降低可能與共生后土壤營養(yǎng)環(huán)境變化有關(guān)。

與細菌和真菌相比，土壤古菌的耐脅迫能力更強，對生存環(huán)境底物要求更嚴格。土壤古菌群落與土壤pH、交換性鈣／鎂呈顯著負相關(guān)，這可能與古菌的強耐受性和低養(yǎng)分含量的生長環(huán)境有關(guān)。本試驗調(diào)酸處理提高了廣古菌門的相對豐度，降低了奇古菌門的相對豐度（圖1c）。王寧等發(fā)現(xiàn)秸稈施用下稻田土壤中的奇古菌門相對豐度會顯著降低，奇古菌門是典型的氨氧化古菌，秸稈的高C/N會抑制奇古菌門的生長。有研究提出奇古菌門在氨氧化過程中起著重要作用。施有機肥促進銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，高C/N的有機物料可使硝態(tài)氮更多地轉(zhuǎn)化為微生物量氮儲存起來。本研究從側(cè)面驗證了有機肥（或有機物料）配施可通過影響奇古菌門而對土壤氮循環(huán)起到調(diào)節(jié)作用。

3.2不同調(diào)酸劑對碳／氮代謝過程微生物的影響

本試驗發(fā)現(xiàn)變形菌門、放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門和芽單胞菌門對土壤碳氮代謝過程貢獻度較高，是影響土壤碳氮代謝的重要菌群（圖3、圖4）。與CK相比，3個處理增加了變形菌門對碳代謝過程與反硝化和硝酸鹽異化還原過程的貢獻度，但降低了綠彎菌門和酸桿菌門對其的貢獻度。變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門在碳源、氮素代謝中發(fā)揮重要作用，是促進反硝化的重要菌群。鈣鎂復(fù)合劑配施有機肥／秸稈處理顯著提高有機碳含量，增加紅壤全氮含量，變形菌門是一種富營養(yǎng)型的革蘭氏陰性菌，與碳的利用性有關(guān)且對碳源較敏感。有機肥與秸稈的施入增加了碳／氮源，同時增加了植物殘渣碳轉(zhuǎn)為活性有機碳的數(shù)量，變形菌門易于利用分解的有機碳生長繁殖。單施鈣鎂復(fù)合劑、鈣鎂復(fù)合劑配施有機肥與鈣鎂復(fù)合劑配施秸稈顯著提升了紅壤pH，并增加了有機碳含量，其中酸桿菌門不僅可以調(diào)節(jié)土壤pH，同時還能參與腐殖質(zhì)分解的碳循環(huán)過程，適合在有機碳含量低的酸性土壤中生存繁殖，本試驗調(diào)酸劑顯著提高土壤pH，增加土壤有機碳含量，使酸桿菌門的相對豐度降低。反硝化和硝酸鹽異化還原過程中綠彎菌門和酸桿菌門的貢獻度相對較低。氨氧化微生物的生長與底物銨的有效性密切相關(guān)，秸稈還田可降低土壤硝酸鹽含量，減少硝化／反硝化作用底物，影響微生物數(shù)量。綠彎菌門對硝化過程的相對豐度貢獻度最大，可能與其生理特性有關(guān)。綠彎菌門能促進N02氧化，加快N03形成，對外界惡劣生長環(huán)境的耐受性強，其在鈣鎂復(fù)合劑配施秸稈中的貢獻度高于鈣鎂復(fù)合劑配施有機肥，秸稈本身C/N較高，其分解土壤中的氮素，導(dǎo)致配施秸稈處理中全氮含量低于配施有機肥。張靜等對紅壤稻田土壤的研究也表明酸化土壤中綠彎菌門的相對豐度最高。調(diào)酸處理能緩解土壤酸化，提高土壤中有機碳和全氮含量，為硝化細菌提供底物和能源，促進其生長繁殖從而提高土壤中反硝化微生物數(shù)量。綠彎菌門在酸性紅壤中通過改善碳／氮循環(huán)來促進自身的生長繁殖，成為硝化過程最豐富的菌群。

4結(jié)論

（1）調(diào)酸劑顯著提高了土壤pH和交換性鹽基離子，變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門是酸性紅壤細菌群落的主要優(yōu)勢菌門，子囊菌門、毛霉菌門和擔(dān)子菌門是真菌群落的主要優(yōu)勢菌門，奇古菌門是古菌群落的優(yōu)勢菌門。

（2）鈣鎂復(fù)合劑配施有機肥／秸稈可增加適合生長于富營養(yǎng)環(huán)境的微生物菌類，降低適合貧瘠環(huán)境的微生物菌群數(shù)量。驅(qū)動土壤真菌和古菌群落結(jié)構(gòu)變化的主要土壤環(huán)境因素有土壤pH和有機碳。

（3）調(diào)酸劑直接或間接改變了碳／氮底物與代謝關(guān)鍵過程相關(guān)的微生物貢獻度，貢獻度最高的微生物菌群主要有變形菌門、放線菌門、綠彎菌門和酸桿菌門。