關(guān)鍵詞：漏縫地板發(fā)酵床；育肥羊；氨；溫室氣體；排放

近些年，我國(guó)育肥羊養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，給人們帶來(lái)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，也帶來(lái)一系列的負(fù)面環(huán)境問(wèn)題，尤其是大氣污染。育肥羊養(yǎng)殖糞便長(zhǎng)期堆存會(huì)釋放氨（NH3）、氧化亞氮（N20）、甲烷（CH4）和二氧化碳（C02）等到大氣中。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年畜禽養(yǎng)殖業(yè)NH3排放占總排放量的68.67%，而育肥羊養(yǎng)殖排放的NH3占排放總量的12.14%。糞便中NH3揮發(fā)不僅會(huì)降低糞肥中的養(yǎng)分含量，其擴(kuò)散到大氣中還會(huì)成為細(xì)顆粒物（PM2.5）的前體物，導(dǎo)致霧霾頻發(fā)。此外，CH4、N20和C02等都是大氣中重要的溫室氣體，而全球約18%的溫室氣體排放源于畜禽養(yǎng)殖業(yè)。因此，減少包括育肥羊在內(nèi)的養(yǎng)殖業(yè)的NH3和溫室氣體排放對(duì)于實(shí)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)的綠色可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

為了降低畜禽養(yǎng)殖過(guò)程的NH3排放，研究者采用控制舍內(nèi)溫濕度、舍內(nèi)噴霧除臭等措施，取得了一定的效果，但由于投入成本高、管理方式復(fù)雜的問(wèn)題，難以推廣應(yīng)用。微生物發(fā)酵床主要通過(guò)有益微生物組成的復(fù)合菌群分解、消納糞便中的有機(jī)物，從而促進(jìn)糞便腐熟并減少NH3等氣體排放。微生物發(fā)酵床分為原位微生物發(fā)酵床和異位微生物發(fā)酵床兩種類型。與異位發(fā)酵床相比，原位發(fā)酵床具備建設(shè)運(yùn)行成本低和鋪設(shè)簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，非常適合應(yīng)用于牛、羊和家禽等畜禽養(yǎng)殖，石志芳等發(fā)現(xiàn)生物發(fā)酵床豬舍內(nèi)的NH3濃度均值為（6.85+0.12）mg·m-3，顯著低于水泥地面干清糞和縫隙地面水泡糞的豬舍（Plt;0.05）。為了使微生物發(fā)酵床能夠應(yīng)用于不同的畜禽種類和養(yǎng)殖規(guī)模，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改良的漏縫地板發(fā)酵床具有適應(yīng)性強(qiáng)和易于管理的優(yōu)點(diǎn)。高旭采用“漏糞板+發(fā)酵墊料”羊床開(kāi)展試驗(yàn)，與地面羊床相比，發(fā)酵床組冬、夏季的NH3濃度分別降低32.94%和18.40%。然而，漏縫地板發(fā)酵床實(shí)現(xiàn)NH3減排的同時(shí)，CH4、N20和C02等溫室氣體排放特征如何？這其中的微生物學(xué)機(jī)理也有待進(jìn)一步探究。因此，本研究采用漏縫地板發(fā)酵床（以下簡(jiǎn)稱發(fā)酵床）養(yǎng)殖育肥羊，通過(guò)對(duì)比其與地面養(yǎng)殖育肥羊過(guò)程N(yùn)H3和溫室氣體（CH4、N20和C02）的排放特征，同時(shí)利用宏基因組測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步解析影響上述氣體排放的微生物學(xué)機(jī)制，研究結(jié)果可為漏縫地板發(fā)酵床在畜禽養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用和推廣提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1漏縫地板發(fā)酵床

本試驗(yàn)采用的發(fā)酵床由木質(zhì)竹板鋪設(shè)而成，漏縫間隙為2-3cm．羊糞便可以透過(guò)縫隙落人下層的發(fā)酵床中。發(fā)酵床由墊料和菌種混合而成，墊料主要由稻殼、鋸末和秸稈組成，質(zhì)量比例為5：3：2，墊料的鋪設(shè)高度為20cm，發(fā)酵床墊料基本理化性質(zhì)為：pH7.44，有機(jī)質(zhì)含量61.13%，總氮含量0.71%，總磷含量0.37%，總鉀含量1.62%。發(fā)酵床接種菌劑為微生物菌劑M，由保定三商生物科技有限公司提供，該微生物菌劑為混合菌劑，主要由乳酸菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌等組成（有效活菌數(shù)CFU≥5x108個(gè)．mL-1）。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)共包括兩個(gè)試驗(yàn)處理，分別是發(fā)酵床和地面對(duì)照處理，試驗(yàn)于2022年9-12月在河北保定唐縣一育肥羊養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行，預(yù)試驗(yàn)期為7d，正式試驗(yàn)期為100d。試驗(yàn)選用體況、大小基本一致的育肥羊共100只，隨機(jī)分配到地面組和發(fā)酵床組。在試驗(yàn)期間，兩組羊舍均自然通風(fēng)、不清理糞便，發(fā)酵床不補(bǔ)噴菌劑、也不進(jìn)行翻拋，其余統(tǒng)一按照育肥羊養(yǎng)殖場(chǎng)常規(guī)管理規(guī)程進(jìn)行。

1.3樣品采集與測(cè)定

1.3.1 NH3樣品采集與測(cè)定

本試驗(yàn)NH3氣體樣品的采集參照海綿吸收法，共分為4個(gè)階段，每隔25d采集一次，每次連續(xù)采集5d。海綿吸收法浸提液中銨態(tài)氮濃度的測(cè)定采用流動(dòng)分析儀，按實(shí)測(cè)濃度計(jì)算NH3的排放速率及試驗(yàn)期間累積排放量。

1.3.2溫室氣體（N20、CH4、C02）樣品采集與測(cè)定

本試驗(yàn)溫室氣體樣品的采集參照靜態(tài)箱法，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)每隔5d采集一次，于上午9：00-11：00進(jìn)行，將采集好的氣體樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，通過(guò)氣相色譜儀測(cè)定N20、CH4、C0：濃度，并計(jì)算相應(yīng)的氣體的排放速率及試驗(yàn)期間累積排放量。

1.3.3糞便樣品的采集與測(cè)定

為了分析糞便樣品理化性質(zhì)的變化規(guī)律，分別于前期（1d）、中期（51d）和后期（101d）采集發(fā)酵床和地面0-20cm的糞便樣品，樣品采集時(shí)間為上午飼喂結(jié)束后，采用5點(diǎn)取樣法采集糞便樣品，混合均勻后保存樣品。其中，pH和含水率的測(cè)定采用新鮮糞便樣品，pH值使用pH計(jì)（FE28，LE501）進(jìn)行測(cè)定（水土比10：1），含水率的測(cè)定采用恒質(zhì)量法。糞便樣品風(fēng)干后測(cè)定其中的總氮（TN）、總磷（TP）、總鉀（TK）和有機(jī)質(zhì)等含量，測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 525-2021》進(jìn)行。其中TN測(cè)定采用凱氏定氮儀法，TP測(cè)定采用釩鉬黃分光光度法，TK測(cè)定采用原子吸收分光光度計(jì)法，有機(jī)質(zhì)測(cè)定采用重鉻酸鉀容量法。

1.3.4微生物樣品的采集與測(cè)定

本試驗(yàn)于試驗(yàn)中期（51d）分別從發(fā)酵床和地面組采集100g新鮮糞便樣品進(jìn)行微生物學(xué)分析。糞便樣品采集后置于-80℃冰箱中保存。宏基因組學(xué)分析委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，樣品提取DNA后，使用Illumina

NovaSeq/Hiseq

Xten（ Illumi-na，美國(guó)）測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏基因組測(cè)序。通過(guò)Fastp對(duì)樣品原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用MEGAHIT對(duì)Cleandata進(jìn)行拼接組裝，然后使用Prodigal v2.6.3c對(duì)拼接結(jié)果中的contig進(jìn)行ORF預(yù)測(cè)。選擇核酸長(zhǎng)度≥100bp的基因，并將其翻譯為氨基酸序列。然后采用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類構(gòu)建非冗余基因集。同時(shí)，使用SOAPaligner軟件統(tǒng)計(jì)基因豐度信息。最后，使用DIAMOND軟件將非冗余基因集與NR、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，以此獲得物種在各個(gè)分類水平上的物種注釋信息及基因?qū)?yīng)的KEGG功能信息。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理與統(tǒng)計(jì)，采用Origin 2021軟件制圖，并用SPSS 26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析（a=0.05）。

2結(jié)果與分析

2.1漏縫地板發(fā)酵床對(duì)育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程氣體排放特征的影響

2.1.1氣體排放速率

本試驗(yàn)比較分析了發(fā)酵床和地面兩個(gè)處理在整個(gè)育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的NH3排放速率，由圖1可以看出漏縫地板發(fā)酵床能夠顯著降低育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的NH3排放速率（Plt;0.05）。試驗(yàn)期間，地面組的NH3排放速率為40.56-136.11mg·m-2·h-1，而發(fā)酵床組的NH3排放速率為21.64-58.92mg·m-2·h-1，發(fā)酵床的NH3排放速率峰值約為地面組的43.29%。環(huán)境溫度對(duì)地面組NH3排放速率的影響較大。育肥羊養(yǎng)殖的第一、二階段（2022.09.18-2022.10.25）的環(huán)境溫度為15.1-23.9℃，這一時(shí)期的NH3排放速率為86.19-136.11mg·m-2·h-1。然而，在第三、四階段（2022.11.18-2022.12.25），由于環(huán)境溫度降低為-2.1-11.2℃，地面組的NH3排放速率下降至40.56-86.08mg·m-2·h-1。相比而言，發(fā)酵床組的NH3排放速率一直處于較低水平，在各個(gè)階段NH3排放速率相差較小，受環(huán)境溫度的影響較小。

試驗(yàn)期間測(cè)定分析了地面和發(fā)酵床兩個(gè)試驗(yàn)處理在整個(gè)育肥羊養(yǎng)殖期間的溫室氣體（N20、CH4和C02）排放速率。首先，漏縫地板發(fā)酵床使得育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的N20排放速率顯著升高（Plt;0.05），試驗(yàn)期間發(fā)酵床組的N20排放速率為1.18-21.95mg·m-2．h-1，而地面組幾乎無(wú)N20的排放（0-0.20mg·m-2·h-1），發(fā)酵床組N20排放速率峰值約為地面組109倍。相反，微生物發(fā)酵床的CH4排放速率顯著降低（Plt;0.05），地面組的CH4排放速率為0.35-2.31mg·m-2·h-1．而發(fā)酵床組的CH4排放速率僅為0.02-1.02mg·m-2·h-1。地面組和發(fā)酵床組CH4排放速率峰值均出現(xiàn)在10月8日，分別為2.31mg·m-2·h-1和1.02mg·m-2·h-1，發(fā)酵床組的CH4排放峰值約為地面組的44.16%。

此外，試驗(yàn)過(guò)程中兩個(gè)試驗(yàn)處理的C02排放速率也顯著不同（Plt;0.05），見(jiàn)圖2c，地面組的C07排放速率為14.39-610.57mg·m-2·h-1，而發(fā)酵床組的CO2排放速率為163.00-1369.26mg·m-2．h-1，發(fā)酵床組的C02排放峰值是地面組的2.2倍，尤其是在10月3日一10月23日期間，發(fā)酵床的C02排放速率一直維持在1200mg·m-2·h-1左右，約為地面對(duì)照組的3.5倍，這段時(shí)間的環(huán)境溫度為14.7-21.3℃，有利于發(fā)酵床內(nèi)微生物的新陳代謝。

2.1.2氣體累積排放量

本研究計(jì)算了兩個(gè)試驗(yàn)處理在整個(gè)育肥羊養(yǎng)殖周期的NH3、N20、CH4和C02的累積排放量，如表1所示。發(fā)酵床組的NH3、C02、N20和CH4的氣體累積排放量與地面組之間存在極顯著差異（Plt;0.01）。與地面組相比，發(fā)酵床組的NH3和CH4累積排放量均極顯著降低（Plt;0.01）。地面組在整個(gè)試驗(yàn)期間的NH。和CH4累積排放量分別為208.58g·m-2和74.94mg·m-2，而發(fā)酵床組NH3和CH4累積排放量?jī)H為86.36g·m-2和26.66mg·m-2，減排率分別為58.60%和64.42%。其次，漏縫地板發(fā)酵床育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的N20和C02累積排放量顯著增加，其N20和C02累積排放量分別為994.30mg·m-2和52.13g·m-2，分別是地面組的190.84倍和3.67倍。

2.2漏縫地板發(fā)酵床對(duì)糞便樣品理化性質(zhì)的影響

本研究分別于試驗(yàn)的前、中、后期采集兩個(gè)試驗(yàn)處理的糞便樣品，并分析其理化性質(zhì)，見(jiàn)表2。在試驗(yàn)開(kāi)始的第1天，除TP外，發(fā)酵床和地面處理的糞便理化性質(zhì)具有顯著差異（Plt;0.01），造成這一差異的原因有二，一是發(fā)酵床墊料中有稻殼、鋸末和秸稈等，這些物質(zhì)會(huì)影響發(fā)酵床糞便的初始理化性質(zhì)；二是在監(jiān)測(cè)試驗(yàn)開(kāi)始前，進(jìn)行了7d的預(yù)喂養(yǎng)試驗(yàn)，這也會(huì)導(dǎo)致地面和發(fā)酵床兩個(gè)試驗(yàn)處理糞便初始理化性質(zhì)的不同。不過(guò)，從整體來(lái)看，試驗(yàn)前、中和后期，兩個(gè)試驗(yàn)處理的各理化指標(biāo)呈現(xiàn)相同的變化規(guī)律，以含水率為例，兩個(gè)試驗(yàn)處理的含水率逐漸升高，發(fā)酵床初始的含水率為24.9%，到試驗(yàn)結(jié)束時(shí)為40.7%，分析含水率變化的原因主要與環(huán)境溫度相關(guān)。需要指出的是，雖然兩個(gè)試驗(yàn)處理的TN含量在試驗(yàn)期間逐漸降低，但發(fā)酵床的TN含量降低幅度更高，由初始的3.9%降低為2.7%，而地面對(duì)照的只降低了0.7%，推測(cè)這主要與微生物氮轉(zhuǎn)化生成N20、N2密切相關(guān)。

2.3漏縫地板發(fā)酵床育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的微生物學(xué)群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)比分析

基于宏基因組學(xué)測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)發(fā)酵床組及地面組樣品的細(xì)菌微生物群落組成進(jìn)行分析，在門(mén)水平上，如圖3a，兩個(gè)試驗(yàn)處理主要的微生物菌門(mén)有厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），約占細(xì)菌總豐度的96.70%-98.89%。其中Firmicutes為地面組的第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比為77.91%；而Actinobacteria為發(fā)酵床組的第一優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，占比為46.45%，屬于該菌門(mén)的微生物大多有基內(nèi)菌絲，能夠促進(jìn)糞便的分解。此外，發(fā)酵床組的Bacteroidota和Proteobacteria占比分別為12.88%和5.57%，高于地面組（5.83%和0.85%）。由圖3b可知，在屬水平上，地面組的第一優(yōu)勢(shì)菌屬為陌生柱狀桿菌屬（Atopo.stipes），占比為19.72%，其次為厭氧球菌屬（Anaerococcu.s）和氣球菌屬（Aerococcu.s）相對(duì)豐度分別是11.25%和5.11%。上述微生物均是典型的動(dòng)物腸道微生物，因此在糞便中被普遍檢出，與地面不同的是，發(fā)酵床組的第一優(yōu)勢(shì)菌屬是鹽水球菌屬（Salinicoccu.s），占比16.67%。鹽水球菌具有優(yōu)異的耐鹽性能，其成為糞便中優(yōu)勢(shì)菌屬主要與育肥羊養(yǎng)殖時(shí)添加大量的鹽導(dǎo)致糞便中鹽含量較高有關(guān)。此外，鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、棒狀桿菌屬（Corlrnebacterium）、短狀桿菌屬（Brachv一bacterium）和擬諾卡氏菌屬（Nocardiop.si.s）等也是發(fā)酵床組的優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度分別為9.90%、9.00%、6.00%和5.38%。上述微生物中，Sphingobacterium能夠降解環(huán)境中的微生物，并且具有根際促生作用，是土壤中的有益微生物。Nocardiops屬于經(jīng)典的絲狀放線菌類群，廣泛存在于高鹽堿土壤生境中，其基絲異常發(fā)達(dá)，會(huì)斷裂成桿狀或球狀，多為長(zhǎng)或短的分枝，在試驗(yàn)開(kāi)展過(guò)程中，發(fā)酵床糞便能夠形成大量的白色菌絲體，由此可以看出微生物發(fā)酵床的應(yīng)用能夠促進(jìn)糞便中有益菌群的大量繁殖。

2.3.2物種差異比較分析

發(fā)酵床組和地面組糞便樣品的微生物組成差異如圖4所示，在門(mén)水平上（圖4a），發(fā)酵床組糞便樣品的Actinobacteria、Bacteroidota和Proteobacteria的相對(duì)豐度分別為46.45%、12.88%和5.57%，極顯著高于地面組（6.65%、5.83%和0.85%）（Plt;0.001），而Fir-micutes則主要分布在地面組，相對(duì)豐度為77.91%。上述結(jié)果與兩個(gè)試驗(yàn)處理的微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)比分析結(jié)果一致。在屬水平上（圖4b），發(fā)酵床組中Salini-COCCMs、Sphingobacterium、Corynebacterium、BrachVbac-terium和Nocardiop.sis的相對(duì)豐度分別為16.67%、9.90%、8.95%、5.8%和5.38%，極顯著高于地面組（0.43%、0.0008%、0.69%、0.48%和0.04%）（Plt;0.001），而Atopo.stipe.s、Anaerococcu.s、Aerococcu.s則主要分布在地面組，相對(duì)豐度分別是19.72%、11.25%和5.11%。

2.4漏縫地板發(fā)酵床育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的碳氮轉(zhuǎn)化關(guān)鍵功能基因分析

2.4.1氮轉(zhuǎn)化功能基因分析

在微生物發(fā)酵床育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程中，糞便堆存會(huì)排放大量的NH3和N20，這些氣體的排放均涉及氮轉(zhuǎn)化且與微生物代謝活動(dòng)密切相關(guān)。本研究繪制了微生物發(fā)酵床的氮代謝通路（圖Sa），并對(duì)比分析了兩個(gè)試驗(yàn)處理中與NH3和N20排放相關(guān)的差異基因，見(jiàn)圖Sb。結(jié)果表明，發(fā)酵床組編碼甲酰胺酶基因fmdA相對(duì)豐度高于地面組，表明發(fā)酵床組的氨化作用較活躍。此外，在發(fā)酵床組中，編碼羥胺還原酶基因hcp、編碼硝酸鹽還原酶基因narG、編碼亞硝酸鹽還原酶基因nirK、編碼一氧化氮還原酶基因norB、編碼一氧化二氮還原酶基因no.sZ等與硝化、反硝化相關(guān)基因均顯著高于地面組（Plt;0.001），這說(shuō)明發(fā)酵床組硝化、反硝化作用較為活躍。此外，在谷氨酰胺合成過(guò)程中，谷氨酸脫氫酶GDH2、谷氨酸合酶gltB等在發(fā)酵床組的相對(duì)豐度均顯著高于地面組（Plt;0.001）。由此可以看出，發(fā)酵床組的硝化、反硝化、谷氨酸合成等氮轉(zhuǎn)化過(guò)程較為活躍，使得向大氣中排放的NH3減少，但同時(shí)導(dǎo)致了大量N20的生成。

2.4.2碳轉(zhuǎn)化關(guān)鍵功能基因分析

微生物發(fā)酵床在育肥羊養(yǎng)殖糞便堆存也會(huì)排放一定濃度的CH4和C02，這些氣體的排放與碳轉(zhuǎn)化過(guò)程密切相關(guān)。首先，糞便中的有機(jī)物在厭氧環(huán)境中會(huì)被厭氧微生物分解生成一定濃度的CH4，厭氧產(chǎn)CH4過(guò)程如圖6a所示，根據(jù)底物類型的不同，CH4的厭氧生物合成主要有3種途徑：C02還原（Hydrogenotro-phic）、乙酸裂解（Acetoclastic）和甲基營(yíng)養(yǎng)（Methylo-trophic），基于宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)參與CH4代謝途徑的關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行分析，如圖6b所示，在發(fā)酵床糞便樣品中，涉及上述3種CH4生成途徑關(guān)鍵酶的基因的相對(duì)豐度均顯著低于地面組（Plt;0.001）。例如，乙酸裂解途徑中的編碼乙酰激酶的基因ackA、編碼磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的基因pta、編碼乙酰輔酶A脫羰基酶的基因cdhE、編碼四氫甲蝶呤S-甲基轉(zhuǎn)移酶的基因mtrH、編碼甲基輔酶M還原酶的基因mcrA在發(fā)酵床組相對(duì)豐度分別為1.03%、0.47%、0.01%、0.02%和0.01%，顯著低于地面組（1.58%、1.22%、0.02%、0.07%和0.10%）（Plt;0.001）。此外，發(fā)酵床組及地面組有關(guān)甲烷氧化關(guān)鍵酶的基因（pmoA、mmoX）均未表達(dá)。這說(shuō)明傳統(tǒng)地面養(yǎng)殖由于育肥羊的不斷踩實(shí)，容易形成厭氧環(huán)境，導(dǎo)致了地面組厭氧產(chǎn)CH4過(guò)程的發(fā)生，相反，漏縫地板發(fā)酵床的糞便在地板以下，保持通風(fēng)能夠保證微生物所需的好氧環(huán)境，避免了厭氧產(chǎn)CH4相關(guān)微生物的增殖。

由于發(fā)酵床中微生物的代謝活動(dòng)，會(huì)使得糞便堆體中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)物并釋放C02，其中，碳水化合物代謝是微生物分解糞便中有機(jī)物的主要途徑。本研究基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行碳代謝模塊注釋分析，對(duì)編碼各代謝通路關(guān)鍵酶的基因進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如圖7所示，首先，在有機(jī)物分解方面，其中主要參與促進(jìn)丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵基因aceE、IDH1等在發(fā)酵床組的相對(duì)豐度均顯著高于地面組（Plt;0.001）。在C02生成方面，發(fā)酵床組編碼甲酸脫氫酶的基因fdoC相對(duì)豐度也顯著高于地面組（Plt;0.001），甲酸經(jīng)甲酸脫氫酶作用也會(huì)產(chǎn)生大量的C02。編碼琥珀酰輔酶A合成酶基因sucD、編碼3-羥酰輔酶A脫氫酶基因fadN、編碼丙二酸半醛脫氫酶基因mm.sA等基因在發(fā)酵床組的相對(duì)豐度顯著高于地面組，表明發(fā)酵床組丙酸代謝、丁酸代謝和磷酸肌醇代謝較活躍，這也與發(fā)酵床較高的C02排放密切相關(guān)。

3討論

漏縫地板發(fā)酵床能夠有效降低育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的NH3排放，可以使得育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的NH3減排率高達(dá)58%以上。微生物發(fā)酵床能夠?qū)崿F(xiàn)NH3減排的原因主要是由于發(fā)酵床中的微生物代謝活動(dòng)促進(jìn)了氮轉(zhuǎn)化，使得糞便中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮后，能夠進(jìn)一步的發(fā)生硝化和反硝化作用，削弱了NH3向大氣的揮發(fā)過(guò)程。糞便樣品的宏基因組學(xué)分析結(jié)果也證實(shí)了這一推斷，發(fā)酵床糞便樣品中的Salinicoccus、Co-rynebacterium和Brachybacterium相對(duì)豐度均顯著高于地面組，這些微生物不僅耐鹽，而且與硝化過(guò)程有關(guān)，實(shí)現(xiàn)了銨態(tài)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化。此外，基因組學(xué)分析同樣能夠得出相同的結(jié)論，與地面組相比，發(fā)酵床組hcp、CDH2、gltB相對(duì)豐度顯著高于地面組（Plt;0.001），說(shuō)明發(fā)酵床組硝化及谷氨酸合成過(guò)程較活躍，促進(jìn)NH4+-N/NH3的轉(zhuǎn)化。

雖然微生物發(fā)酵床使得育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程的NH3排放降低，但也造成育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程較高的N20排放。N20生成主要與硝化和反硝化過(guò)程有關(guān)。發(fā)酵床中的優(yōu)勢(shì)菌屬有Nocardiopsis，其主要參與反硝化作用，會(huì)導(dǎo)致N20的生成。宏基因組分析結(jié)果表明發(fā)酵床糞便中narG、nirK、norB、nosZ等基因相對(duì)豐度顯著高于地面組（Plt;0.001），同樣表明發(fā)酵床糞便中反硝化過(guò)程較活躍。因此推斷微生物發(fā)酵床育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程中的N20主要來(lái)自于反硝化過(guò)程，未來(lái)可進(jìn)一步采取措施控制微生物發(fā)酵床N20的排放。為實(shí)現(xiàn)微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖育肥羊過(guò)程中N20減排，可以考慮在微生物發(fā)酵床墊料中添加如硝化、反硝化抑制劑等進(jìn)一步驗(yàn)證N20減排效果。

漏縫地板微生物發(fā)酵床養(yǎng)殖育肥羊還能夠顯著降低養(yǎng)殖過(guò)程中的CH4排放。傳統(tǒng)的地面養(yǎng)殖過(guò)程中，育肥羊的不斷踩實(shí)會(huì)導(dǎo)致厭氧環(huán)境的生成，從而造成一定濃度的CH4排放，而微生物發(fā)酵床中糞便在地板以下，具有較好的通風(fēng)環(huán)境，因此不易產(chǎn)生厭氧環(huán)境，進(jìn)而會(huì)抑制CH4的生成。宏基因組學(xué)結(jié)果顯示，地面組Atopo.stipe.s相對(duì)豐度顯著高于發(fā)酵床組（Plt;0.05），有研究指出Atopo.stipes通過(guò)葡萄糖和纖維二糖等碳水化合物提供能量會(huì)促進(jìn)乙酸鹽生成。此外作為地面組優(yōu)勢(shì)菌屬的Anaerococcus在厭氧環(huán)境下可以促進(jìn)CH4的生成?；贙EGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)兩組中涉及產(chǎn)甲烷途徑基因進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果顯示地面組產(chǎn)甲烷過(guò)程較活躍。

由于微生物發(fā)酵床中活躍的微生物活動(dòng)，使得微生物發(fā)酵床中的C02累積排放量顯著高于地面組（Plt;0.01）。王國(guó)華等研究表明發(fā)酵床豬舍C02的排放通量高于實(shí)心地面豬舍（約1.4倍），與本試驗(yàn)得出相同的試驗(yàn)結(jié)論。基于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，涉及到有機(jī)物代謝中的丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝相關(guān)酶的功能基因在發(fā)酵床組顯著表達(dá)。丙酮酸經(jīng)過(guò)脫羧生成乙酰輔酶A，再進(jìn)入三羧酸循環(huán)被徹底氧化成水和C02，這從微生物學(xué)角度證實(shí)了微生物發(fā)酵床中較高的C02排放。

綜上所述，漏縫地板發(fā)酵床可以實(shí)現(xiàn)育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程N(yùn)H3和CH4減排，但會(huì)促進(jìn)N20和C02的排放，未來(lái)應(yīng)探究硝化、反硝化抑制劑應(yīng)用于發(fā)酵床的氣體協(xié)同減排潛力，進(jìn)一步推動(dòng)微生物發(fā)酵床在育肥羊養(yǎng)殖行業(yè)的推廣應(yīng)用。

4結(jié)論

（1）采用漏縫地板發(fā)酵床顯著降低育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程中NH3排放。微生物發(fā)酵床中與氮轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物Salinicoccu.s、CorVnebacterium、Brachybacterium為優(yōu)勢(shì)菌屬，活躍的氮轉(zhuǎn)化過(guò)程削弱了NH3向大氣中揮發(fā)，降低了NH3排放。

（2）漏縫地板微生物發(fā)酵床中的N20累積排放量顯著高于地面組。宏基因組分析結(jié)果表明，發(fā)酵床中編碼硝酸還原酶基因narG、亞硝酸鹽還原酶基因nirK、編碼一氧化氮還原酶基因norB、編碼一氧化二氮還原酶基因nosZ等基因的相對(duì)豐度均顯著高于地面組，活躍的硝化和反硝化過(guò)程導(dǎo)致了N20的大量排放。

（3）采用漏縫地板發(fā)酵床降低了育肥羊養(yǎng)殖過(guò)程中CH4的排放，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵床良好的通風(fēng)環(huán)境抑制了與CH4厭氧生成相關(guān)的C02還原、乙酸裂解和甲基營(yíng)養(yǎng)相關(guān)的微生物活動(dòng)。

（4）漏縫地板微生物的C02累積排放量要遠(yuǎn)高于地面，KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)碳代謝模塊注釋結(jié)果表明，發(fā)酵床中的丙酮酸代謝、三羧酸循環(huán)等過(guò)程，會(huì)使得發(fā)酵床組C02排放量顯著增加。