關(guān)鍵詞：稻鱔種養(yǎng)；氨氧化微牛物；高通量測序；土壤理化性質(zhì)；微生物群落

硝化作用是指將氨（NH3）通過氨氧化微生物氧化為亞硝酸鹽（N02），并進(jìn)一步氧化為硝酸鹽（N03）的過程。硝化過程是全球氮循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)，在維持氮素平衡中起著關(guān)鍵作用。長期以來，人們一直認(rèn)為氨氧化過程是由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）驅(qū)動完成的。AOA通常被認(rèn)為是土壤中最豐富的氨氧化微生物。然而，隨著完全氨氧化微生物（Comammox）的發(fā)現(xiàn)，硝化作用和氨氧化微生物的研究再次成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。此后，在各種系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了Comammox，如農(nóng)業(yè)土壤、森林土壤、淡水柄息地和污水處理廠。研究表明，AOA、AOB和Comammox的豐度、群落多樣性和結(jié)構(gòu)的變化與施肥條件、土壤類型、種植作物和土壤理化因子等有關(guān)。Wang等在弱酸性（5.8

相較于傳統(tǒng)水稻栽培模式，稻魚種養(yǎng)模式具有高效、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)價值較高等優(yōu)點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)，稻魚種養(yǎng)能有效提高土壤肥力，并能提高土壤微生物豐度和多樣性。馬微微等通過對田間管理下的稻魚互作的土壤營養(yǎng)成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在收獲期，全氮、全磷的含量都有顯著的提高；周榆淇等發(fā)現(xiàn)，在長期淹水條件下稻魚種養(yǎng)顯著提高了土壤全氮和有機(jī)質(zhì)含量，并一定程度增加了微生物碳的含量；Zheng等發(fā)現(xiàn)，稻鱔種養(yǎng)模式提高了土壤真菌多樣性，降低了優(yōu)勢種比例。王蓉等發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)水稻種植模式相比，稻蝦種養(yǎng)模式顯著提高了土壤氨氧化微生物（AOA和AOB）豐度，顯著降低了AOB的a多樣性。針對稻鱔種養(yǎng)模式，以往研究大多關(guān)注其對土壤養(yǎng)分含量和真菌多樣性的影響，而對氨氧化微生物影響的研究鮮有報道，氨氧化微生物對其的響應(yīng)機(jī)制尚不明確。

本研究以水稻一綠肥輪作系統(tǒng)為研究對象，探究稻鱔種養(yǎng)模式對土壤中心區(qū)域與溝渠邊緣區(qū)域的理化性質(zhì)和氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性等指標(biāo)的影響，揭示稻鱔種養(yǎng)對不同稻田區(qū)域氨氧化微生物群落的影響，為更好地理解稻鱔種養(yǎng)模式養(yǎng)分循環(huán)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗地概括

試驗于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合實驗站（30°53'N．121°23'E）的稻田種養(yǎng)長期定位試驗小區(qū)開展，該地年平均氣溫為15.8℃，年平均降水量為1178.0mm。土壤質(zhì)地為黏壤土，種植水稻品種為花優(yōu)14，試驗小區(qū)2016年初始土壤理化指標(biāo)為：pH7.45，有機(jī)質(zhì)（SOM）16.43g·kg-1，總氮（TN）1.05g·kg-1，總磷（TP）1.14g·kg-1，速效氮（AN） 74.47mg·kg-1，速效磷（AP）34.31mg·kg-1。

1.2試驗設(shè)計

本試驗從2016年5月水稻季開始，每年按照同樣試驗條件實施。設(shè)置兩個處理，即常規(guī)稻田處理和稻鱔種養(yǎng)處理（常規(guī)施肥加“L”形渠溝，在其中投放黃鱔）。小區(qū)為完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，每個處理3個重復(fù)，試驗小區(qū)為3mx4m，各小區(qū)之間使用土工膜隔離。稻鱔種養(yǎng)結(jié)合小區(qū)結(jié)構(gòu)見圖1。分別在處理小區(qū)的中心區(qū)域和溝渠邊緣區(qū)域取樣：常規(guī)稻田中心區(qū)域（CCS）、常規(guī)稻田溝渠邊緣區(qū)域（CMS）、稻鱔種養(yǎng)中心區(qū)域（ICS）和稻鱔種養(yǎng)溝渠邊緣區(qū)域（IMS）。每個處理施肥量保持一致，施用純氮225kg·hm-2，純磷112.5kg·hm-2，純鉀255kg·hm-2，所用肥料分別為尿素（含氮量46%）、過磷酸鈣（含P205 12%）、硫酸鉀（含K20 34%）。在稻田溝渠投放鱔魚苗，鱔魚苗質(zhì)量20-25g，體長27-31cm，投放量100kg·hm-2。稻鱔種養(yǎng)結(jié)合小區(qū)不添加餌料，黃鱔以蚯蚓、昆蟲、水生浮游動物等自然餌料為食。

1.3土壤理化性質(zhì)測定方法

于2020年4月水稻種植之前采集土壤樣本。采用S型采樣方法，每個采樣區(qū)域（CCS、CMS、ICS、IMS）采集5個土壤樣本（0-20cm），并將其合并為一個樣本?；旌虾蟮耐寥罉悠穬Υ嬖谒芰洗校⒓磶Щ貙嶒炇?。清除土樣中的碎石、植物和動物殘骸。部分土樣風(fēng)干后進(jìn)行篩選（孔徑2mm），測定理化性質(zhì)，另一部分樣品儲存在-80℃冰箱中，待進(jìn)行DNA提取和高通量測定。

土壤pH使用電位法測定（水土比為2.5：1）；土壤SOM使用重鉻酸鉀氧化法測定；土壤TN使用凱氏定氮法測定；土壤TP使用硫酸一高氯酸消化法測定；土壤AN使用NaCI直接提取法測定；土壤AP使用分光光度計法測定；土壤硝化勢（PNR）使用氨氧化快速檢測法測定。

1.4土壤樣品的DNA提取及高通量測序

使用Omega E．Z．MA．@土壤DNA試劑盒（D5625-02）按照說明提取土壤DNA。AOB -amoA、AOA-amoA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的引物對分別為amoAIF/amoA2R、ArchamoAF/Arch-amoAR、comaA-244F/comaA-659R和comaB -244F_A/comaB_659R_A。PCR反應(yīng)體系為25uL，其中包括2uL稀釋5倍的DNA模板和23uL反應(yīng)液。反應(yīng)液的組成如下：SYBR Premix Ex Taq （2x）：12.5uL; ROXReference; DveⅡ（50x）：0.5uL;前向引物1uL;反向引物1uL；超純水8uL。擴(kuò)增條件為：在98℃下初始變性30s，然后在98℃變性27個循環(huán)15s，在58℃／55℃/52℃／52℃（AOB/AOA/Comammox Clade-A/Comammox Clade-B）退火30s，在72℃下延伸30s/30s/45

s/45s（AOB/AOA/Comammox Clade-A/Comam-mox Clade-B），最后在72℃延伸7min。使用Nano-Drop ND-1000 UV-Vis分光光度計檢測PCR產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量。擴(kuò)增成功后，將PCR產(chǎn)物送至派森諾生物（上海）進(jìn)行mesiq平臺高通量測序分析。

首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接為一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾，有效序列可依據(jù)序列首位兩端的barcode和引物序列來區(qū)分樣品得到，將序列方向進(jìn)行校正，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。通過對序列分類處理，進(jìn)行Operational Taxonomic

Units（OTU）分組。在97%的相似性水平下對OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析。使用Usearch7.1軟件平臺，按照97%的相似性將非重復(fù)序列（不包括單一序列）進(jìn)行OTU聚類。在聚類過程中，排除嵌合體，從而得到代表每個OTU的序列?；贠TU的分類，進(jìn)行a多樣性和B多樣性的分析。使用貝葉斯算法分析97%相似性水平下的OTU代表序列，以獲取每個OTU的物種分類信息。在不同的分類水平（包括域、界、門、綱、目、科、屬和種）下統(tǒng)計樣本的群落組成。

1.5數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0進(jìn)行Tukey HSD檢驗單因素方差分析（ANOVA），確定各處理理化性質(zhì)之間的差異顯著性。采用Mothur（版本v．1.30.1）基于OTU計算AOAamoA、AOB amoA、Comammox

Clade -A和ComammoxClade-B的豐富度和多樣性指數(shù)；使用Origin 2020的Correlation Plot插件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析；使用QIIME2計算BraV-Curtis距離矩陣，使用Origin 2020的Redundancy AnaIVsis插件進(jìn)行多樣性分析；使用R構(gòu)建相關(guān)性矩陣（lrlgt;0.6和Plt;0.001），使用Gephi軟件繪制氨氧化微生物的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2結(jié)果與分析

2.1稻鱔種養(yǎng)對土壤理化性質(zhì)的影響

各處理土壤理化性質(zhì)如表1所示。各處理水稻土壤pH的范圍在7.68-7.97之間，呈弱堿性，IMS和ICS的pH顯著低于CCS和CMS（Plt;0.05），說明黃鱔的活動可降低試驗小區(qū)土壤pH。CCS與CMS之間的SOM和TN含量存在顯著差異，而ICS與IMS之間無顯著差異，說明黃鱔可以平衡土壤區(qū)域間的養(yǎng)分含量，使土壤養(yǎng)分更加均勻。稻鱔種養(yǎng)模式的AN、TP和AP含量相較于常規(guī)稻田處理無顯著差異。稻鱔種養(yǎng)模式相比常規(guī)稻田處理顯著提高了土壤PNR，加速了土壤氮循環(huán)速率。

2.2稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物a多樣性的影響

稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物a多樣性的影響如圖2所示，氨氧化微生物豐富度使用Chaol和Ob-served_species指數(shù)表示，多樣性使用Shannon和Simpson指數(shù)表示。與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著增加了AOA、Comammox Clade-A和Comam-mox Clade-B的豐富度（Plt;0.05），顯著降低了AOB的豐富度（Plt;0.05），ICS和IMS之間的氨氧化微生物豐富度無顯著差異。與常規(guī)稻田處理相比，IMS顯著提升了AOA的多樣性（Plt;0.05），顯著降低了AOB的多樣性（Plt;0.05）。各處理間Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的群落多樣性無顯著性差異。

土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物Chaol和Shannon指數(shù)的相關(guān)性分析如圖3所示。pH與AOA、Comam-mox Clade-A的Chaol指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），SOM與AOB的Chaol和Shannon指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05），與Comammox Clade-A和ComammoxClade-B的Chaol指數(shù)則呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。AN與AOB的Chaol指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。PNR與AOA的Chaol和Shannon指數(shù)、ComammoxClade-A和Comammox Clade-B的Chaol指數(shù)呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與AOB的Chaol和Shannon指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.05）。

2.3稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤氨氧化微生物的主成分分析和各處理之間群落差異P值分別如圖4和表2所示。AOA、AOB、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的PC01的解釋量分別為65.2%、36.5%、50.2%和35.9%，PC01和PC02的總解釋量分別為87.6%、68.6%、71.5%和56.4%。CMS和CCS的氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)相似，無顯著區(qū)分，但I(xiàn)MS和ICS除Comammox Clade-A群落結(jié)構(gòu)相似外，AOA、AOB和Comammox Clade-B的群落結(jié)構(gòu)均有顯著差異（Plt;0.05）。同時，與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)結(jié)合處理的AOA、AOB、Comam-mox Clade-A和Comammox Clade-B的群落結(jié)構(gòu)均有差異（Plt;0.05）。

在稻鱔種養(yǎng)模式下，土壤各氨氧化微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)如圖5和表3所示。結(jié)果顯示，相比于常規(guī)水稻種植模式，稻鱔種養(yǎng)模式提高了氨氧化微生物群落穩(wěn)定性，其中AOB尤為明顯。稻鱔種養(yǎng)模式的氨氧化微生物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)數(shù)高于常規(guī)水稻模式（表3）。稻鱔種養(yǎng)模式的AOB、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)高于常規(guī)水稻模式，但AOA的邊數(shù)低于常規(guī)水稻模式。稻鱔種養(yǎng)模式提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的網(wǎng)絡(luò)模塊化度，但降低了AOB的模塊化度。

3討論

稻鱔種養(yǎng)可改善土壤理化環(huán)境，減少化肥投入，增加產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益。一般情況下，由于黃鱔活動范圍有限，在稻田土壤邊緣區(qū)域活動較強(qiáng)，對稻田整體影響不均勻，有可能導(dǎo)致土壤養(yǎng)分在區(qū)域間產(chǎn)生差異。因此，本文旨在研究稻鱔種養(yǎng)模式下，黃鱔的生理活動對溝渠邊緣和中心區(qū)域的土壤理化性質(zhì)和氨氧化微生物群落的影響，為闡明稻鱔種養(yǎng)模式的養(yǎng)分供給特征提供科學(xué)支撐。

本研究結(jié)果表明，在土壤呈弱堿性（pH為7.68-7.97）的情況下，相較于常規(guī)稻田，稻鱔種養(yǎng)模式土壤中pH顯著下降，土壤有機(jī)質(zhì)和全氮分布更加均勻，土壤硝化勢顯著增加，土壤全磷、速效氮和速效磷的含量無顯著變化，這與袁泉等的研究結(jié)果相似，結(jié)果表明在稻鱔模式下，黃鱔的生理活動會加速土壤養(yǎng)分的釋放，并且黃鱔的體液和排泄物等物質(zhì)可改善土壤理化環(huán)境。值得注意的是，稻鱔種養(yǎng)模式的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域在土壤理化性質(zhì)方面沒有顯著差異。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，Comammox在土壤中的數(shù)量比AOA和AOB更多，在酸性和堿性土壤中都占據(jù)優(yōu)勢。但在本研究中，AOA的豐富度顯著高于其他氨氧化微生物。因為本試驗長期處在淹水狀態(tài)，土壤含氧量較低，而AOA更適應(yīng)在低氧環(huán)境中生存。在本研究中，相較于常規(guī)稻田處理，稻鱔種養(yǎng)模式提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的豐富度，降低了AOB的豐富度，需要注意的是，這種影響在中心區(qū)域和邊緣區(qū)域之間沒有顯著差異。稻鱔種養(yǎng)模式的中心區(qū)域相比于常規(guī)稻田處理提高了AOA的群落多樣性，降低了AOB的群落多樣性。雖然水稻土壤長期處于淹水狀態(tài)，但黃鱔的活動會增加土壤的通氣性，而氨氧化微生物屬于好氧菌，所以其活動一定程度上促進(jìn)了氨氧化微生物的生長。基因組分析發(fā)現(xiàn)，AOB存在著一段Rh型銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Rh-type ammonium transporter）基因，相比于AOA中發(fā)現(xiàn)的MEP型銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（MEP-type ammonia transport-ers），Rh型銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對銨的親和力較低。而在本研究中，稻鱔種養(yǎng)模式并沒有顯著提高土壤速效氮含量，故一定程度上影響了AOB的豐富度和多樣性。

土壤理化性質(zhì)和生物相互作用是塑造各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的主要因素。土壤理化性質(zhì)對氨氧化微生物的群落豐度和多樣性的變化有著直接或間接的影響。土壤pH是氨氧化微生物群落的重要驅(qū)動因素，影響土壤養(yǎng)分的含量和有效性以及微生物的生長和活性。本研究中土壤pH的范圍在7.68-7.97，與AOA和Comammox Clade-A的Chaol指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)。這與氨氧化微生物對pH的響應(yīng)機(jī)制有關(guān)，AOA和Comammox依靠對鉀的吸收，產(chǎn)生反向膜電位，從而在酸性土壤中維持體內(nèi)pH平衡，表現(xiàn)出對pH的耐受性。土壤速效氮含量也是影響氨氧化微生物豐度的重要環(huán)境因子，一般認(rèn)為，NH4-N是氨氧化微生物代謝的直接底物。Kits等的研究表明，Comammox的氨半飽和常數(shù) -63nmol，AOA的K-0.13umol， AOB的Km（NH3） -0.14-1.90mmol。AOB的K更大，表明其對氨氮的耐受性較高，因此通常AOB的豐度與NH4-N含量呈正相關(guān)，這與以往的研究結(jié)論一致。本研究未測定土壤NH4-N含量，但由于稻田長期淹水，導(dǎo)致土壤中的NH4-N在土壤速效氮含量中占比較高，所以速效氮含量可以在一定程度上反映出土壤NH4-N含量，因此在相關(guān)性分析中，速效氮與AOB的Chaol指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與AOA和Comammox的Chaol指數(shù)呈負(fù)相關(guān)。土壤的硝化作用是將土壤中的氮素轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的過程，其中土壤硝化勢是衡量這個過程的重要指標(biāo)。而氨氧化微生物群落的多樣性是影響土壤硝化勢的重要因素。在本研究中，AOA和Comammox的群落多樣性與土壤硝化勢呈顯著正相關(guān)，而AOB的群落多樣性與土壤硝化勢呈顯著負(fù)相關(guān)。這表明AOA和Co-mammox能夠促進(jìn)土壤的硝化速率，而AOB則可能抑制了土壤的硝化速率。這是由于與AOB相比，AOA和Comammox更適宜在缺氧的環(huán)境中生存，從而對土壤硝化勢有促進(jìn)作用。

氨氧化微生物的B多樣性和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)是研究氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)重要的工具和方法，能夠揭示氨氧化微生物群落的組成差異和相互作用模式。本研究中，與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著改變了氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)，并且在稻田中心區(qū)域和溝渠邊緣區(qū)域均加強(qiáng)了氨氧化微生物網(wǎng)絡(luò)的模塊化度。模塊化度是微生物網(wǎng)絡(luò)分析中常用的一種度量指標(biāo)。通常情況下，模塊化度越高，說明微生物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部關(guān)聯(lián)越緊密，發(fā)育程度越完善。稻鱔種養(yǎng)模式增加了氨氧化微生物群落的信息和能量交流，使其擁有更緊密的內(nèi)部連接，這可能是因為黃鱔的活動加速了土壤中養(yǎng)分的釋放和通氣狀況，從而直接或間接改變了氨氧化微生物群落和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

本研究為理解稻鱔種養(yǎng)結(jié)合對土壤氨氧化微生物群落的影響提供了理論依據(jù)，未來需要進(jìn)一步研究不同農(nóng)業(yè)管理措施對土壤氨氧化微生物群落的影響機(jī)制及不同氨氧化微生物之間的關(guān)系，為優(yōu)化農(nóng)業(yè)管理提供科學(xué)依據(jù)。

4結(jié)論

（1）與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著降低了土壤pH，減小了中心區(qū)域和邊緣區(qū)域之間的有機(jī)質(zhì)與總氮含量差異，使土壤養(yǎng)分分布更加均勻，并增加了土壤硝化勢，促進(jìn)了土壤氮循環(huán)。

（2）與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的豐富度，顯著降低了AOB的豐富度；同時，顯著提高了邊緣區(qū)域AOA的群落多樣性，但降低了邊緣區(qū)域AOB的群落多樣性；

（3）土壤pH、有機(jī)質(zhì)和速效氮是影響土壤氨氧化微生物群落的關(guān)鍵環(huán)境因子；AOA和Comammox群落促進(jìn)了土壤硝化勢，而AOB抑制了土壤硝化勢。

（4）共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示稻鱔種養(yǎng)模式顯著改變了氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)，加強(qiáng)了氨氧化微生物群落之間的信息交流，擁有更緊密的內(nèi)部連接。