摘 要：【目的】含有束狀蛋白（fasiclin）結(jié)構(gòu)域的類成束狀阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins，F(xiàn)LAs）在巨桉細(xì)胞壁的次生生長(zhǎng)和合成中起著重要作用。為了獲得更多有價(jià)值的信息并探索其功能，對(duì)巨桉FLA基因家族的全基因組進(jìn)行分析。【方法】以巨桉全基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過(guò)Expasy、MEME、MEGA7.0、TBtools等生物信息學(xué)工具對(duì)EgrFLAs基因家族的核酸序列的特征、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)量等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。【結(jié)果】巨桉共有21個(gè)EgrFLAs基因，其中包括3個(gè)新發(fā)現(xiàn)的EgrFLAs基因，這些基因不均勻地分布在巨桉11條染色體中的9條上。所有鑒定到的EgrFLAs基因均含有束狀蛋白結(jié)構(gòu)域，聚為4個(gè)群組，其中D組包含最多的基因成員。在EgrFLAs基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了大量的順式元件，包括發(fā)育相關(guān)、水楊酸、茉莉酸甲酯等相關(guān)響應(yīng)元件。不同組織的表達(dá)譜分析表明除EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3外，聚在A組的EgrFLA5和EgrFLA7也參與了次生生長(zhǎng)。在巨桉不定根形成過(guò)程中，EgrFLA1和EgrFLA3通過(guò)表達(dá)量逐漸增加的方式參與誘導(dǎo)不定根形成。經(jīng)SA和MeJA處理后，EgrFLA1和EgrFLA2的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明EgrFLA1和EgrFLA2在巨桉的發(fā)育和脅迫反應(yīng)中可能具有多種作用?！窘Y(jié)論】在巨桉中鑒定FLA基因21個(gè)，包括新發(fā)現(xiàn)的3個(gè)基因。在EgrFLAs基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了大量發(fā)育和激素相關(guān)的順式元件。EgrFLA1、EgrFLA2、EgrFLA3、EgrFLA5和EgrFLA7作為巨桉次生生長(zhǎng)發(fā)育中的候選基因，將為進(jìn)一步的巨桉分子育種提供寶貴的資源。

關(guān)鍵詞：巨桉；類成束狀阿拉伯半乳糖蛋白；次生生長(zhǎng)；基因家族；基因表達(dá)；發(fā)育

中圖分類號(hào)：S792.39；S718.46 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2024）09-0127-11

基金項(xiàng)目：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（CAFYBB2020ZB004）；“十四五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2021YFD2200102-05）。

Identification and analysis of FLA gene family members in Eucalyptus grandis

YU Ruen1， ZENG Bingshan2， FAN Chunjie2

（1. College of Biological Science and Technology， Beijing Forestry University， Beijing 100083， China； 2. Key Laboratory of State Forestry Administration on Tropical Forestry， Research Institute of Tropical Forestry， Chinese Academy of Forestry， Guangzhou 510520， Guangdong， China）

Abstract：【Objective】The fasciclin-like arabinogalactan proteins （FLAs） known as containing fasciclin （FAS） domains， were identified as important roles in secondary growth and synthesis of the cell wall in eucalyptus. A whole genome study of the FLA gene family of Eucalyptus grandis was performed in this study to gain more valuable information and explore their function.【Method】Basing on the whole genome data of eucalyptus， the characteristics of nucleic acid sequence， gene structure， physicochemical properties of protein， conserved domain of protein， phylogenetic relation of family and expression quantity of FLA gene family were analyzed and predicted by Expasy， MEME， MEGA7.0， TBtools and other bioinformatics software.【Result】21 EgrFLAs genes including 3 newly identified EgrFLA genes were presented in eucalyptus， which unevenly distributed in 9 of 11 chromosomes. All identified FLAs contained fasciclin domain， which were clustered into 4 subgroups， with group D including the most gene members. A large number of cis-elements including development elements， salicylic acid， methyl jasmonate related elements were identified in promoters of EgrFLAs genes. Expression profiles in various tissues， adventitious root formation and different stress treatments were also performed. The expression profiles of different tissues showed that except for EgrFLA1， EgrFLA2 and EgrFLA3， EgrFLA5 and EgrFLA7 clustered into group A were also identified to be involved in secondary growth. The expression of EgrFLA1 and EgrFLA3 gradually increased during adventitious root formation in vitro of eucalyptus. The EgrFLA1 and EgrFLA3 were mainly involved in adventitious rootinducing process. The expression of EgrFLA1 and EgrFLA2 significantly altered after SA and MeJA treatments， which meant EgrFLA1 and EgrFLA2 were potentially versatile roles in development and response to stress in eucalyptus.【Conclusion】21 EgrFLAs genes including 3 newly identified EgrFLA genes were presented in Eucalyptus. A large number of cis-elements including development element， phytohormone related elements were identified in promoters of FLAs genes. EgrFLA1， EgrFLA2， EgrFLA3， EgrFLA5 and EgrFLA7 were used as candidate genes in secondary growth and development of eucalyptus， which will provide valuable resources for further molecular breeding in eucalyptus.

Keywords： Eucalyptus grandis， fasciclin-like arabinogalactan proteins， secondary growth， gene family， gene expression， development

類成束狀阿拉伯半乳糖蛋白（fasciclin-like arabinogalactan proteins，F(xiàn)LAs）是阿拉伯半乳聚糖蛋白（arabinogalactan-proteins， AGPs）的一個(gè)亞類，其特征是由AGP結(jié)構(gòu)域和束狀蛋白結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域最先在果蠅中發(fā)現(xiàn)，之后在包括細(xì)菌、酵母、動(dòng)物和植物在內(nèi)的各種生物中發(fā)現(xiàn)。在植物中，F(xiàn)LAs通常包含一個(gè)或兩個(gè)束狀蛋白結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)保守的中心YH基序和兩個(gè)高度保守且長(zhǎng)度約為10個(gè)氨基酸的H1和H2基序[1]。此外，一個(gè)N端信號(hào)肽和一個(gè)C端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）膜錨蛋白主要附著在細(xì)胞表面，在植物的大多數(shù)FLAs中總是同時(shí)出現(xiàn)[2]。

對(duì)植物中FLAs的研究表明，它們可能參與離體根和莖的再生、花的發(fā)育以及對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)。擬南芥Arabidopsis thaliana中FLA1和FLA2可能參與了離體不定根的誘導(dǎo)和發(fā)育[3]，F(xiàn)LA3主要在花藥中表達(dá)，進(jìn)一步研究證實(shí)其參與了小孢子和雄性配子體的發(fā)育[4]。此外，AtFLA4被發(fā)現(xiàn)參與細(xì)胞擴(kuò)增和干旱相關(guān)的脅迫信號(hào)反應(yīng)。FLA9還與種子發(fā)育和脅迫反應(yīng)有關(guān)。近年來(lái)，大量的研究發(fā)現(xiàn)FLAs在植物次生細(xì)胞壁形成和特性中發(fā)揮重要作用。如FLA11、FLA12在維管組織中高表達(dá)，影響細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成，進(jìn)而調(diào)控莖的抗拉強(qiáng)度和生物力學(xué)。在棉花中，過(guò)表達(dá)GhFLA1可以顯著增加纖維長(zhǎng)度并改變細(xì)胞壁的組成[5]。而在亞麻中，一些FLAs顯示出具有調(diào)節(jié)纖維伸長(zhǎng)和細(xì)胞壁增厚的潛在功能[6-7]。在木本植物中，PtFLA6參與木質(zhì)部中木質(zhì)素和纖維素的生物合成，進(jìn)一步影響楊樹的次生細(xì)胞壁組成[8-9]。同樣，作為AtFLA11和AtFLA12的同源基因，EgrFLA1和EgrFLA2主要在莖中表達(dá)，影響巨桉的纖維素沉積和纖維素微纖維角度，甚至影響莖稈力學(xué)。另一樹種亮果桉Eucalyptus nitens中的EniFLA1、EniFLA2和EniFLA3與EgrFLA1和EgrFLA2高度相似，也證實(shí)了它們可以影響次生細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和莖的生物力學(xué)[10]。

由于其重要性，F(xiàn)LA基因已在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[11]。隨后在水稻Oryza sativa[12-13]、小麥Triticum aestivum[13]、煙草Nicotiana benthamiana[14]、棉花Gossypium raimondii[15]和白菜Brassica rapa[16]中的FLAs基因逐漸被鑒定出來(lái)。在木本植物中，楊樹Populus trichocarpa的FLA的全基因組也被鑒定。巨桉具有速生、優(yōu)質(zhì)、豐產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[17]，相關(guān)研究也進(jìn)行了巨桉FLA基因的鑒定，共鑒定出18個(gè)FLAs基因。然而，對(duì)其理化特性、基因結(jié)構(gòu)和基序及其在各組織或發(fā)育階段的相關(guān)表達(dá)仍未進(jìn)行詳細(xì)分析。同時(shí)，在以往的研究中，有幾個(gè)FLAs基因缺失。本研究進(jìn)行了一個(gè)全面的巨桉FLAs全基因組分析，構(gòu)建了多種植物FLAs基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹，研究了FLAs基因在不同組織和莖節(jié)間的表達(dá)模式、不定根誘導(dǎo)過(guò)程和脅迫反應(yīng)，為進(jìn)一步開展桉樹分子育種提供有價(jià)值的候選基因。

1 材料與方法

1.1 巨桉FLA基因家族的鑒定

首先，從Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozomenext.jgi.doe.gov/）下載巨桉的全基因組數(shù)據(jù)。然后從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（https：// www.arabidopsis.org/）下載所有的AtFLAs的蛋白序列。同時(shí)，從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pfam.xfam.org/）中獲取FLA蛋白的Pfam序列（PF02469），利用HMMER 3.0軟件的hmmsearch程序?qū)LA保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行鑒定（E<0.000 1）[18]。同時(shí)，去除無(wú)AGP糖基化區(qū)域的基因。將所有獲得的巨桉FLA氨基酸序列通過(guò)Pfam（https：//pfam.xfam.org/）、Smart（https： //smart.embl-heidelberg.de/）及NCBI網(wǎng)站CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrps）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域確認(rèn)。最后，將同時(shí)含有FAS結(jié)構(gòu)域和AGP糖基化區(qū)域的序列鑒定為FLA蛋白。此外，為確保獲得巨桉所有FALs，對(duì)結(jié)構(gòu)缺陷明顯的基因再次進(jìn)行基因模型預(yù)測(cè)，并通過(guò)在線軟件Softberry（https：// www.softberry.com/berry.phtml？topic =fgenesh & group=programs&su-bgroup=gfind）對(duì)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行校準(zhǔn)推測(cè)[19]。

1.2 巨桉FLA家族蛋白理化性質(zhì)的鑒定

對(duì)所有鑒定的EgrFLA蛋白，通過(guò)在線軟件ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析基因家族成員的分子量、等電點(diǎn)、蛋白長(zhǎng)度等。通過(guò)TMHMM Server v.2.0（https：//services.healthtech. dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域鑒定。此外，SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/）[20]和big-PI Plant Predictor（http：//mendel.imp.ac.at/gpi/plant_server.html）分別用于預(yù)測(cè)信號(hào)肽和GPI修飾位點(diǎn)[21]。

1.3 巨桉FLA家族蛋白進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MEGA7軟件中的Muscle對(duì)巨桉、水稻、楊樹和擬南芥的FLAs進(jìn)行多序列比對(duì)。然后，采用極大似然法（maximum likelihood estimation， MLE）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap的值設(shè)置為1 000[22]。此外，通過(guò)在線軟件iTOL（https：//itol. embl.de/）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的可視化。

1.4 巨桉FLA家族蛋白染色體定位及共線性分析

從巨桉參考基因組中提取各染色體上的FLAs基因位置。應(yīng)用MCScanX軟件檢測(cè)物種內(nèi)的復(fù)制基因?qū)23]。使用TBtools繪制染色體位置圖和共線性分析圖[24]。采用KaKs_CalculatorL 3.0軟件計(jì)算FLA基因?qū)Φ姆峭x突變率（nonsynonymous mutation rate，Ka）、同義突變率（synonymous mutation rate，Ks）和Ka/Ks值[25]。

1.5 巨桉FLA家族蛋白基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

從巨桉基因組中提取內(nèi)含子和外顯子的長(zhǎng)度和位置，然后通過(guò)MEME （https：//meme-suite.org/ meme/tools/meme）分析保守基序，Motif數(shù)量設(shè)為10。利用TBtools v1.105軟件對(duì)巨桉FLA基因的基因結(jié)構(gòu)和基序位置進(jìn)行可視化分析。同時(shí)，利用GSDS2.0 （https：//gsds.gao-lab.org/）軟件繪制保守域的位置圖。用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)來(lái)鑒定保守FLS結(jié)構(gòu)域，用Jalview2.10.3軟件繪制相應(yīng)的圖[26]。

1.6 巨桉FLA家族蛋白順式作用元件分析

為了獲得上游潛在的調(diào)控基因或轉(zhuǎn)錄因子，檢測(cè)了FLA基因啟動(dòng)子的順式作用元件。提取巨桉FLA基因的所有上游2 000 bp DNA序列，并將所有序列提交到PlantCARE網(wǎng)站（https：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件的預(yù)測(cè)[27]。

1.7 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析基因表達(dá)特性

在各組織中，根、葉、木質(zhì)部、韌皮部、先端和莖節(jié)間取自6月齡1 m的苗木，花取自3年生巨桉。2月齡嫩枝分別進(jìn)行200 mmol NaCl、100 μmol茉莉酸甲酯（Methyl Jasmonate，MeJA）和100 μmol水楊酸（Salicylic acid，SA）處理。處理后0、1、6、24、168 h采集葉片。以培養(yǎng)20 d的離體繁殖植株為不定根誘導(dǎo)樣品。在不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)0、1、6、24、48、72、96、168 h和20 d后收集莖基部材料。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)。從前期的研究[28]（https：//bar.utoronto.ca/～asher/eplant_eucalyptus/）中收集轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，使用Tbtools生成熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨桉FLA基因的全基因組鑒定

為了鑒定巨桉中的EgrFLAs成員，對(duì)21個(gè)AtFLAs家族成員進(jìn)行BLAST搜索，保留了含有FAS結(jié)構(gòu)域和AGP糖基化區(qū)域的序列，在巨桉基因組中鑒定出21個(gè)FLAs基因家族成員，命名為EgrFLA1～EgrFLA21（表1）。該結(jié)果比之前報(bào)道的多了3個(gè)成員，分別命名為EgrFLA19（Eucgr. H00590.1）、EgrFLA20（Eucgr.K00086.1）和EgrFLA21（Eucgr.L03441.1）[19]。理化性質(zhì)分析表明，蛋白質(zhì)長(zhǎng)度為117～481 aa。其中EgrFLA21分子量最低，為13 241.24 kDa；EgrFLA9分子量最高，為72 623.31 kDa。21個(gè)EgrFLAs家族成員的蛋白等電點(diǎn)（pI）為5.04（EgrFLA4）～9.75（EgrFLA1）。21個(gè)EgrFLAs的大多數(shù)成員的親水性平均系數(shù)（Grand average of hydropathicity，GRAVY）值大于零，表明這些基因?yàn)槭杷曰颉?/p>

2.2 巨桉FLA基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、順式作用元件及系統(tǒng)發(fā)育分析

為了進(jìn)一步研究EgrFLAs家族成員的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用MEGA、MEME和TBtools獲得了EgrFLAs家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹、蛋白質(zhì)保守基序組成和結(jié)構(gòu)域。得到的10個(gè)Motif用不同的顏色表示。Motif 1、Motif 2、Motif 3和Motif 5在EgrFLAs中廣泛存在（圖1）。然而，EgrFLA18只包含Motif 2，EgrFLA21只包含Motif 8。巨桉EgrFLAs的所有成員都具有束狀蛋白結(jié)構(gòu)域。此外在EgrFLA13中單獨(dú)鑒定到rad23超家族結(jié)構(gòu)域。

基因啟動(dòng)子中的順式作用元件對(duì)于研究EgrFLAs家族成員的生物學(xué)功能和調(diào)控模式具有重要意義。在19個(gè)順式調(diào)控元件中，光響應(yīng)性順式調(diào)控元件所占比例最大（40.72%），激素相關(guān)元件（生長(zhǎng)素、脫落酸、赤霉素、水楊酸、茉莉酸甲酯）所占比例次之（37.29%）。其他類別如脅迫相關(guān)元件、發(fā)育元件、分生組織表達(dá)元件等，占總數(shù)的21.99%。有6個(gè)基因參與對(duì)刺激的防御和反應(yīng)，包括EgrFLA2、EgrFLA5、EgrFLA9、EgrFLA14、EgrFLA16和EgrFLA18?？梢钥闯?，9個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域都有低溫響應(yīng)元件。順式作用元件的結(jié)果表明，EgrFLAs可以響應(yīng)多種激素和脅迫進(jìn)一步參與植物的多種生理生化過(guò)程（圖2）。

為了揭示EgrFLAs家族成員之間的進(jìn)化關(guān)系，利用包括21個(gè)EgrFLAs、21個(gè)AtFLAs、35個(gè)PtrFLAs和27個(gè)OsFLAs在內(nèi)的104個(gè)FLA蛋白序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。將21個(gè)EgrFLAs基因家族成員分為4個(gè)亞組，分別為A、B、C、D組。其中分布在A組的基因最多，擬南芥和楊樹所占比例最大。EgrFLAs家族成員中只有兩個(gè)基因分布在B組，分別為EgrFLA5和EgrFLA9。與單子葉植物水稻相比，巨桉中的EgrFLAs基因與楊樹和擬南芥中的FLA基因親緣關(guān)系更近，它們?cè)谙到y(tǒng)發(fā)育樹上總是緊密聚集在一起（圖3）。

2.3 巨桉FLA基因的染色體定位及共線分析

為了更好地了解EgrFLAs在巨桉染色體上的基因組分布機(jī)制，基于巨桉的基因組序列構(gòu)建了EgrFLAs的染色體定位圖譜。結(jié)果（圖4）表明，21個(gè)EgrFLAs家族成員位于染色體1、2、3、6、7、8、10、11號(hào)和scaffold_3184上，主要集中在染色體1和7號(hào)上。然而，在染色體3、10號(hào)和scaffold_3184上只有一個(gè)成員。

為了進(jìn)一步分析EgrFLAs的起源和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，分析了巨桉與擬南芥（圖5a）和楊樹（圖5b）的共線性關(guān)系。在巨桉和楊樹之間的EgrFLAs基因?qū)?shù)高于巨桉和擬南芥之間的基因?qū)?shù)。一些EgrFLAs與至少兩對(duì)同源基因相關(guān)，這表明這些基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。同時(shí)，一些EgrFLAs與這2個(gè)物種沒有形成同型基因?qū)?，這表明這些基因可能是EgrFLAs所特有的。

2.4 與巨桉二次生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的FLA候選基因的鑒定

為了進(jìn)一步確定EgrFLAs在巨桉中的功能，對(duì)其在不同組織中的表達(dá)譜進(jìn)行分析。所有EgrFLAs根據(jù)其表達(dá)模式分為三類（圖6a）。FLA10、FLA13、FLA14、FLA17、FLA18、FLA19和FLA20在各組織中表達(dá)量較低或均勻不表達(dá)。其他組的FLAs基因至少在一個(gè)器官中高表達(dá)。EgrFLA6在巨桉根中特異表達(dá)。同時(shí)，先前研究中FLA1、FLA2、FLA3參與木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維發(fā)育[19]，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其主要表達(dá)在木質(zhì)部。這表明這些基因的功能在一定程度上與其表達(dá)譜相關(guān)。值得注意的是，F(xiàn)LA7和FLA12在根中表達(dá)量較高，它們可能參與了巨桉根系的形成和發(fā)育。

為了鑒定更多參與木質(zhì)部發(fā)育的FLA基因，還從莖上頂端向下分別代表初生到次生生長(zhǎng)的不同節(jié)間進(jìn)行了差異表達(dá)分析。與FLA1、FLA2、FLA3相似，EgrFLA5和EgrFLA7表達(dá)量也是從莖尖向下逐漸增加。而EgrFLA8、EgrFLA9和EgrFLA11表現(xiàn)出完全相反的表達(dá)模式。這些結(jié)果表明，這些基因可能通過(guò)正調(diào)控或負(fù)調(diào)控的方式參與木質(zhì)部的次生生長(zhǎng)和發(fā)育。此外，還發(fā)現(xiàn)不同組織中表達(dá)最低的基因被歸為同一簇（圖6b）。這表明這些基因很少調(diào)控次生生長(zhǎng)或木質(zhì)部發(fā)育。

2.5 巨桉離體不定根誘導(dǎo)相關(guān)FLA候選基因的鑒定

在巨桉組培繁殖過(guò)程中，不定根誘導(dǎo)對(duì)獲得健壯的芽苗具有重要意義。因此，有必要確定參與不定根誘導(dǎo)的候選基因。FLA13、FLA14、FLA17、FLA19和FLA20在不定根誘導(dǎo)的不同階段很少表達(dá)。FLA1、FLA2、FLA3、FLA8的表達(dá)量隨著持續(xù)時(shí)間的增加而逐漸增加，表明它們?cè)诰掼癫欢ǜT導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。同時(shí)，F(xiàn)LA6、FLA7、FLA10和FLA12在誘導(dǎo)168 h和20 d表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，主要作用于不定根伸長(zhǎng)或主要在根中表達(dá)（圖7）。這將為FLA基因在不定根的形成和發(fā)育中發(fā)揮重要作用提供線索，其具體功能鑒定有待進(jìn)一步探索。

2.6 巨桉脅迫反應(yīng)相關(guān)FLA候選基因的鑒定

為了驗(yàn)證EgrFLA在逆境下的潛在功能，還研究了鹽、MeJA和SA處理下FLA基因的表達(dá)譜（圖8）。在NaCl處理下，除了不表達(dá)的FLAs外，幾乎所有EgrFLAs都表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。值得注意的是，F(xiàn)LA1、FLA4、FLA5和FLA12在處理168 h時(shí)下調(diào)，而FLA3、FLA6、FLA7、FLA8、FLA9和FLA11在處理1 h立即下調(diào)，接著隨著處理時(shí)間的增加不斷下降，在處理168 h達(dá)到最低。在MeJA處理下，F(xiàn)LA1和FLA2的表達(dá)量隨處理次數(shù)的增加而增加，在處理168 h達(dá)到最高點(diǎn)。相反，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)LA6和FLA8呈下降趨勢(shì)。同時(shí)，F(xiàn)LA5、FLA7、FLA9和FLA12的表達(dá)量在MeJA處理1、6和24 h的短時(shí)間內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在處理168 h后呈下降趨勢(shì)。與MeJA處理不同的是， EgrFLA5、FLA7和FLA9在168 h處理下表達(dá)量達(dá)到最高，而其他FLA基因在SA處理下幾乎無(wú)明顯差異。

3 討 論

FLA基因幾乎是巨桉中最早被發(fā)現(xiàn)的基因。在應(yīng)拉木中的基因表達(dá)表明，兩種密切相關(guān)的束狀蛋白樣阿拉伯半乳聚糖蛋白EniFLA1和EniFLA2的表達(dá)參與巨桉木質(zhì)部對(duì)重力應(yīng)力的響應(yīng)，與纖維木質(zhì)部的微纖維角度有關(guān)[29]。隨后對(duì)擬南芥的功能分析表明，與EniFLA1、EniFLA2和EniFLA3關(guān)系更為密切的AtFLA11和AtFLA12主要通過(guò)影響纖維素沉積和細(xì)胞壁基質(zhì)的完整性來(lái)影響植物莖的強(qiáng)度和彈性[10]。在巨桉中的功能驗(yàn)證表明，EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3參與了巨桉木質(zhì)部導(dǎo)管和纖維的發(fā)育，尤其是木質(zhì)部纖維中纖維素微纖維角的發(fā)育，并進(jìn)一步調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁的生長(zhǎng)和性能[19]。同時(shí)，在巨桉中鑒定出18個(gè)FLA基因，并對(duì)其進(jìn)行了簡(jiǎn)單的表征。然而，基因組序列的不完善和延遲導(dǎo)致FLA基因缺失。在這項(xiàng)研究中，EucgrH00590（EgrFLA15）、EucgrK00086（EgrFLA18）和L03441（EgrFLA21）是通過(guò)全基因組搜索和進(jìn)一步驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的FLA基因。同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)特異性表達(dá)的EgrFLA15、EgrFLA18和EgrFLA21在少數(shù)組織或處理中均不表達(dá)。這可能是他們?cè)谥暗难芯恐袥]有被發(fā)現(xiàn)的另一個(gè)原因。

早期研究中發(fā)現(xiàn)EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3在木質(zhì)部纖維發(fā)育和次生細(xì)胞壁生長(zhǎng)中起著重要的作用。在本研究中也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。例如，EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3在木質(zhì)部中高表達(dá)。在巨桉中，它們的表達(dá)量從莖頂部向下隨著次生生長(zhǎng)的增加而逐漸增加，進(jìn)一步表明它們可能主要參與巨桉的次生生長(zhǎng)。同樣，與EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3密切相關(guān)的基因CsaFLA9和CsaFLA11在大麻中也表現(xiàn)出從頂端向下的表達(dá)增加模式[30]。而在柳樹S. suchowensis和楊樹P. deltoides中，它們的高同源性基因PdeFLA9和FLA29、SsuFLA7的表達(dá)水平并沒有從頂端向下部分呈正增加[31]。推測(cè)FLA基因在楊樹中的擴(kuò)增（35個(gè)FLA基因）導(dǎo)致了FLA基因的多樣性。同時(shí)EgrFLA5和EgrFLA7在木質(zhì)部高表達(dá)，在莖中從上到下依次增加，也是潛在的候選基因，可能與巨桉次生生長(zhǎng)有關(guān)。

此外，EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3在離體不定根形成過(guò)程中被明顯誘導(dǎo)表達(dá)，這在以往的研究中未見報(bào)道。雖然在組織培養(yǎng)中AtFLA1在側(cè)根發(fā)育和芽發(fā)育的早期事件中起作用[11]，但與EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3密切相關(guān)的AtFLA11和EgrFLA12沒有報(bào)道類似的功能。同時(shí)，在168 h鹽處理下，EgrFLA1表達(dá)下調(diào)，而在MeJA處理下，EgrFLA1和EgrFLA2的表達(dá)逐漸升高。此外，MeJA反應(yīng)元件存在于EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3的啟動(dòng)子區(qū)域，水楊酸反應(yīng)元件也存在于EgrFLA1和EgrFLA2的啟動(dòng)子區(qū)域。這些結(jié)果表明，EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3不僅參與調(diào)控木質(zhì)部的次生生長(zhǎng)，還參與生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)等方面的調(diào)控。因此，EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3將用于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究對(duì)巨桉中FLAs進(jìn)行了全面的全基因組分析。根據(jù)AGP結(jié)構(gòu)域和FAS結(jié)構(gòu)域共鑒定出21個(gè)EgrFLAs基因。在巨桉中有3個(gè)新發(fā)現(xiàn)的EgrFLA基因，它們不均勻地分布在11條染色體中的9條上。在FLAs基因啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了大量的順式元件，包括發(fā)育元件、植物激素相關(guān)元件等。在各組織中的表達(dá)譜顯示，除EgrFLA1、EgrFLA2和EgrFLA3外，聚集在A組的EgrFLA5和EgrFLA7也參與了次生生長(zhǎng)。此外，EgrFLA1和EgrFLA3主要參與不定根誘導(dǎo)過(guò)程。EgrFLA1和EgrFLA2在巨桉的發(fā)育和應(yīng)激反應(yīng)中具有潛在的多用途作用。總之，本研究提供了全面的生物信息學(xué)分析和表達(dá)譜分析，以探索與脅迫相關(guān)的候選基因，為進(jìn)一步的巨桉分子育種提供了寶貴的資源。

參考文獻(xiàn)：

[1] SEIFERT G J. Fascinating fasciclins： a surprisingly widespread family of proteins that mediate interactions between the cell exterior and the cell surface[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（6）：1628.

[2] ZANG L N， ZHENG T C， CHU Y G， et al. Genome-wide analysis of the fasciclin-like arabinogalactan protein gene family reveals differential expression patterns， localization， and salt stress response in Populus[J]. Frontiers in Plant Science， 2015，6：1140.

[3] BASU D， TIAN L， DEBROSSE T， et al. Glycosylation of a fasciclin-like arabinogalactan-protein （SOS5） mediates root growth and seed mucilage adherence via a cell wall receptorlike kinase （FEI1/FEI2） Pathway in Arabidopsis[J]. PLoS ONE， 2016，11（1）：e145092.

[4] HE J D， ZHAO H， CHENG Z L， et al. Evolution analysis of the fasciclin-like arabinogalactan proteins in plants shows variable fasciclin-AGP domain constitutions[J]. International Journal of Molecular Sciences，2019，20（8）：1945.

[5] HUANG G Q， GONG S Y， XU W L， et al. A fasciclin-like arabinogalactan protein， GhFLA1， is involved in fiber initiation and elongation of cotton[J]. Plant Physiology，2013，161（3）： 1278-1290.

[6] ROACH M J， DEYHOLOS M K. Microarray analysis of flax（Linum usitatissimum L.） stems identifies transcripts enriched in fibre-bearing phloem tissues[J]. Molecular Genetics and Genomics，2007，278（2）：149-165.

[7] ROACH M J， DEYHOLOS M K. Microarray analysis of developing flax hypocotyls identifies novel transcripts correlated with specific stages of phloem fibre differentiation[J]. Annals of Botany，2008，102（3）：317-330.

[8] WANG H H， JIANG C M， WANG C T， et al. Antisense expression of the fasciclin-like arabinogalactan protein FLA6 gene in Populus inhibits expression of its homologous genes and alters stem biomechanics and cell wall composition in transgenic trees[J]. Journal of Experimental Botany，2015，66（5）：1291-1302.

[9] WANG H H， JIN Y L， WANG C T， et al. Fasciclin-like arabinogalactan proteins， PtFLAs， play important roles in GAmediated tension wood formation in Populus[J]. Scientific Reports，2017，7（1）：6182.

[10] MACMILLAN C P， MANSFIELD S D， STACHURSKI Z H， et al. Fasciclin-like arabinogalactan proteins： specialization for stem biomechanics and cell wall architecture in Arabidopsis and Eucalyptus[J]. The Plant Journal，2010，62（4）：689-703.

[11] JOHNSON K L， KIBBLE N A J， BACIC A， et al. A fasciclinlike arabinogalactan-protein （FLA） mutant of Arabidopsis thaliana， fla1， shows defects in shoot regeneration[J]. PLoS ONE，2011，6（9）：e25154.

[12] MA H L， ZHAO J. Genome-wide identification， classification， and expression analysis of the arabinogalactan protein gene family in rice （Oryza sativa L.）[J]. Journal of Experimental Botany，2010，61（10）：2647-2668.

[13] FAIK A， ABOUZOUHAIR J， SARHAN F. Putative fasciclin-like arabinogalactan-proteins （FLA） in wheat （Triticum aestivum） and rice （Oryza sativa）： identification and bioinformatic analyses[J]. Molecular Genetics and Genomics，2006，276（5）：478-494.

[14] WU X Y， LAI Y C， LV L Q， et al. Fasciclin-like arabinogalactan gene family in Nicotiana benthamiana： genome-wide identification， classification and expression in response to pathogens[J]. BMC Plant Biology，2020，20（1）：305.

[15] HUANG G Q， XU W L， GONG S Y， et al. Characterization of 19 novel cotton FLA genes and their expression profiling in fiber development and in response to phytohormones and salt stress[J]. Physiologia Plantarum，2008，134（2）：348-359.

[16] LI J， WU X M. Genome-wide identification， classification and expression analysis of genes encoding putative fasciclin-like arabinogalactan proteins in Chinese cabbage （Brassica rapa L.）[J]. Molecular Biology Reports，2012，39（12）：10541-10555.

[17] 鄧海燕，申琳琳，胡中洋，等.巨桉用材林林分質(zhì)量評(píng)價(jià)與界定標(biāo)準(zhǔn)劃分[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，43（7）：65-73. DENG H Y， SHEN L L， HU Z Y， et al. Stand quality evaluation and demarcation standard division of Eucalyptus plantation[J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology， 2023，40（7）：65-73.

[18] POTTER S C， LUCIANI A， EDDY S R， et al. HMMER web server： 2018 update[J]. Nucleic Acids Research，2018，46（W1）： 200-204.

[19] MACMILLAN C P， TAYLOR L， BI Y D， et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics[J]. New Phytologist，2015，206（4）：1314-1327.

[20] PETERSEN T N， BRUNAK S， von HEIJNE G， et al. SignalP 4.0： discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature Methods，2011，8（10）：785-786.

[21] EISENHABER B， WILDPANER M， SCHULTZ C J， et al. Glycosylphosphatidylinositol lipid anchoring of plant proteins. sensitive prediction from sequence-and genome-wide studies for Arabidopsis and rice[J]. Plant Physiology，2003，133（4）： 1691-1701.

[22] KUMAR S， STECHER G， TAMURA K. MEGA7： molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution，2016，33（7）：1870-1874.

[23] WANG Y P， TANG H B， DEBARRY J D， et al. MCScanX： a toolkit for detection and evolutionary analysis of gene synteny and collinearity[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（7）：e49.

[24] CHEN C J， CHEN H， ZHANG Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data[J]. Molecular Plant，2020，13（8）：1194-1202.

[25] ZHANG Z. KaKs_Calculator 3.0： calculating selective pressure on coding and non-coding sequences[J]. Genomics Proteomics Bioinformatics，2022，20（3）：536-540.

[26] THOMPSON J D， GIBSON T J， PLEWNIAK F， et al. The CLUSTAL_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]. Nucleic Acids Research，1997，25（24）：4876-4882.

[27] ROMBAUTS S， DéHAIS P， Van MONTAGU M， et al. PlantCARE， a plant cis-acting regulatory element database[J]. Nucleic Acids Research，1999，27（1）：295-296.

[28] FAN C J， LYU M J， ZENG B S， et al. Profiling of the gene expression and alternative splicing landscapes of Eucalyptus grandis[J]. Plant Cell and Environment，2024：1-16. DOI： 10.1111/pce. 14814.

[29] QIU D Y， WILSON I W， GAN S M， et al. Gene expression in Eucalyptus branch wood with marked variation in cellulose microfibril orientation and lacking G-layers[J]. New Phytologist， 2008，179（1）：94-103.

[30] GUERRIERO G， MANGEOT-PETER L， LEGAY S， et al. Identification of fasciclin-like arabinogalactan proteins in textile hemp （Cannabis sativa L.）： in silico analyses and gene expression patterns in different tissues[J]. BMC Genomics， 2017，18（1）：741.

[31] ZHANG Y Y， ZHOU F W， WANG H， et al. Genome-wide comparative analysis of the fasciclin-like arabinogalactan proteins （FLAs） in Salicacea and identification of secondary tissue development-related genes[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2023，24：1481.

[本文編校：謝榮秀]