摘要： 【目的】分析煙草Orange 蛋白突變體的轉(zhuǎn)錄組和代謝組，為培育高類胡蘿卜素含量的煙草提供理論依據(jù)。【方法】通過CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，獲得帶有3 個堿基缺失的NtOR 基因突變株系208。采用轉(zhuǎn)錄組測序、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向方法、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用的衍生化方法和頂空進樣技術(shù)，對突變株系的差異基因和差異代謝物進行分析?！窘Y(jié)果】突變株系208 葉片中的β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)含量顯著下降。轉(zhuǎn)錄組分析顯示：突變株系208 中有10 369 個差異表達基因，其中4 178 個基因上調(diào)，6 191 個基因下調(diào)。代謝組分析顯示：突變株系208 與對照相比有160 個差異代謝物。【結(jié)論】突變株系208 中的類胡蘿卜素含量下降，色素代謝途徑中玉米黃素環(huán)氧化酶基因下調(diào)，有機酸和二萜類代謝物含量顯著升高。

關(guān)鍵詞： 煙草；類胡蘿卜素；Orange 蛋白；β-胡蘿卜素；紫黃質(zhì)

中圖分類號： S572.01 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 05?0040?08

植物類胡蘿卜素是存在于葉綠體和有色體膜中的脂溶性色素，具有多種結(jié)構(gòu)和功能[1]，主要包括胡蘿卜素（碳氫化合物） 和葉黃素（胡蘿卜素的氧化衍生物） 兩大類，其結(jié)構(gòu)由8 個類異戊二烯單位濃縮后逐步演變而成[2]。類胡蘿卜素合成代謝途徑中的中間代謝產(chǎn)物（如β-胡蘿卜素和黃體素） 參與植物的光合作用[3]，而終產(chǎn)物（如脫落酸和獨腳金內(nèi)酯） 則與植物的抗氧化能力和生長發(fā)育相關(guān)[4]。類胡蘿卜素是重要的香氣前體物質(zhì)[5]，通過酶促或非酶促氧化降解，生成紫羅酮、β-大馬酮等香味物質(zhì)，顯著影響煙葉的香氣質(zhì)量[6]。在煙葉的生長、成熟、調(diào)制、醇化和燃燒過程中，類胡蘿卜素的積累、轉(zhuǎn)化和降解將直接影響烤煙的香氣風(fēng)格和品質(zhì)[7]。因此，煙草中類胡蘿卜素及其降解產(chǎn)物含量的變化可能會對煙葉的品質(zhì)產(chǎn)生重要影響。

Orange （OR） 基因最早在花椰菜（Brassica oleraceaL. var. botrytis L.） 中被發(fā)現(xiàn)，其自發(fā)突變導(dǎo)致菜頭顏色改變，使植物器官呈現(xiàn)橙色[8]。OR蛋白是一種質(zhì)體定位的蛋白質(zhì)，含有富含半胱氨酸的鋅指結(jié)構(gòu)域，在多種植物中高度保守[9]。八氫番茄紅素合酶（phytoene synthase，PSY） 是類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，其過量積累會導(dǎo)致類胡蘿卜素含量增加[10-11]。研究表明：OR蛋白可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控PSY 活性，從而影響類胡蘿卜素的合成[12]。在多種植物中，如擬南芥（Arabidopsisthaliana）、 甘薯[Dioscorea esculenta （Lour.）Burkill] 和水稻（Oryza sativa L.），過表達OR 基因均能提高類胡蘿卜素的含量[12-14]。

CRISPR/Cas9 技術(shù)具有操作簡單、快速高效等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于植物的基因編輯中。2015 年，研究人員在普通煙草中建立了CRISPR/Cas9 技術(shù)體系，并實現(xiàn)了對NtPDS 和NtPDR6 基因的定點突變[15]。此后，CRISPR/Cas9 技術(shù)多次應(yīng)用于煙草基因功能驗證和突變體創(chuàng)制[16-18]。本研究運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)獲得了煙草NtOR 基因突變的純合株系208，并測定和分析了該突變株系成熟期葉片的類胡蘿卜素含量以及代謝組和轉(zhuǎn)錄組的變化，旨在揭示煙草NtOR 基因在類胡蘿卜素合成通路中的作用，為通過基因工程技術(shù)培育優(yōu)良煙草品種奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 編輯載體構(gòu)建和突變煙株的獲得

供試煙草品種為紅花大金元；基因編輯載體CRISPR/Cas9 來自西南大學(xué)家蠶重點實驗室，用于實現(xiàn)NtOR 基因的編輯。

1.1.1 CRISPR/Cas9 基因編輯載體的構(gòu)建

以擬南芥AtOR 基因（Arabidopsis thaliana，AT5G61670） 蛋白序列為參考，在栽培煙草參考基因組數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/） 中進行同源比對，鑒定栽培煙草的OR 蛋白序列。使用DNAMAN? 6.0 軟件進行多物種OR 蛋白序列的多重比較分析。這些物種序列包括普通煙草的祖先種林煙草（Nicotiana sylvestris，XP_009771548.1）、絨毛狀煙草（N. tomentosiformis， XP_009599295.1）、擬南芥（A. thaliana，AT5G61670）、番茄（Solanumlycopersicum，NP_001315338.1）、胡蘿卜（Daucuscarota，KZM92469.1）、澳洲棉（Gossypium australe，KAA3456878.1）、褐枝獼猴桃（Actinidia rufa，GFY84422.1）、紫蘇（Perilla frutescens，KAH6790-465.1）、菠蘿（Ananas comosus，XP_020085475.1）和芝麻（Sesamum indicum，XP_011084764.1）。

根據(jù)NtOR 基因的基因組DNA 序列，利用在線網(wǎng)站 CRISPR MultiTargeter （http：//www.multicrispr.net/index.html） 設(shè)計sgRNA 靶位點，選取得分最高的核苷酸序列（GTTCCTTCTATAGAGATATC）合成正向引物（F： 5 ′ -GATTGTTCCTTCTATAGAGATATCTGG-3′） 和反向引物（R：5′-CAAACAAGGAAGATATCTCTATAGACC-3′）。將合成的引物用雙蒸水稀釋至100 ng/μL，正、反向引物各取5 μL 混合至PCR 管中。PCR 儀的退火程序為：95 ℃ 變性2 min，每8 s 降溫0.1 ℃，至25.0 ℃。退火后形成中間為特異引導(dǎo)序列的雙鏈結(jié)構(gòu)（5′-GATTGTTCCTTCTATAGAGATATCTGG-3′，3′-CAAACAAGGAAGATATCTCTATAGACC-5′），作為目的片段。

使用BsaI 限制性內(nèi)切酶酶切CRISPR/Cas9載體，將酶切后的載體與目的片段連接，取連接產(chǎn)物10 μL 加入到Trans-T1 感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴10 min，42 ℃ 熱激90 s，迅速將感受態(tài)細胞放回冰上2 min。取轉(zhuǎn)化產(chǎn)物60 μL 均勻涂布于含有50 mg/L 卡那霉素的LB 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃ 下培養(yǎng)12～18 h。隨機挑取單菌落并提取質(zhì)粒，使用測序引物U626 （5′-GGATTGCAAGCAGGCATCAA-3′） 和U627 （5′-CGCTTCAAAAATCCCTTCCAC-3′） 進行Sanger 測序，確認目的片段已正確插入CRISPR/Cas9 載體。

1.1.2 NtOR 基因突變煙株的創(chuàng)制

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法，對構(gòu)建的CRISPR/Cas9-NtOR 編輯載體進行常規(guī)遺傳轉(zhuǎn)化和組培試驗， 并對煙草類胡蘿卜素合成相關(guān)基因NtOR 進行編輯。待分化芽出根10 d 后，取葉片進行NtOR 基因突變檢測。突變檢測使用華大基因BGISEQ-500 平臺，采用PE100 測序類型進行高通量測序，測序引物為F：5′-AAACACCTACCACTGGCCAC-3′ 和 R：5′-CATCGGAGGCCATAGATCGC-3′。挑選發(fā)生編輯的T0 代植株，收種后按代數(shù)繼續(xù)擴繁；于T1 代4 葉期取葉片進行NtOR 基因突變檢測，挑選發(fā)生純合編輯的T1 代植株并收種；再按代數(shù)擴繁，于T2 代4 葉期時再次取葉片進行NtOR 基因突變檢測，最終獲得純合無標簽的T3 代突變株系208。

1.2 代謝成分分析

1.2.1 色素分析法檢測類胡蘿卜含量

采用靶向色素分析法檢測成熟期新鮮煙葉中的類胡蘿卜含量。取成熟期中部煙葉第9～11 片中的2 片作為1 個生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。將煙葉沿主脈撕開，一半用于代謝組測序，另一半用于轉(zhuǎn)錄組測序。稱取凍干煙葉粉末20 mg，加入90% 丙酮溶液1.5 mL，冰浴超聲30 min，以14 000 r/min 離心10 min，取上清液500 μL 至平底色譜瓶。上樣至Agilent 1100 高效液相色譜儀（Agilent 公司） 進行檢測，標樣純度≥95%，葉綠素b 的檢測波長為428 nm，其他質(zhì)體色素的檢測波長為448 nm。

1.2.2 基于液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS） 技術(shù)的非靶向方法檢測代謝成分

稱取凍干煙葉粉末20 mg，加入提取試劑（75%甲醇） 1.5 mL，渦旋6～15 s 后，在30 ℃、200 r/min下振搖提取1 h。以14 000 r/min 離心10 min，取上清液800 μL 至進樣瓶進行LC-MS 分析（I-Class超高效液相色譜，英國Waters 公司）。采用ProgenesisQI 軟件處理數(shù)據(jù)，采用峰面積歸一化法計算代謝物的相對含量，最終使用SIMCA 14.1軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.3 基于氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS） 技術(shù)的衍生化方法

稱取凍干煙葉粉末20 mg，加入萃取溶劑（V異丙醇∶V乙腈∶V水＝3∶3∶4） 1.5 mL （每毫升萃取溶劑中含1 μL 內(nèi)標十三酸，即2 μg/mL），超聲1 h 后，渦旋2 次，每次30 s。以14 000 r/min離心10 min，取上清液500 μL 至2 mL 錐形玻璃進樣瓶中，并在真空下濃縮干燥。加入20 mg/mL甲氧胺吡啶溶液100 μL，渦旋2 次，每次15 s，并在37 ℃、200 r/min 下孵育90 min；加入硅烷化試劑BSTFA 100 μL，渦旋20 s 后，在60 ℃、200 r/min 下硅烷化60 min。樣品室溫靜置后進行GC-MS 分析（Agilent 6890 系列氣相色譜儀，Agilent 公司）。使用全掃描選擇離子監(jiān)測模式（Scan-SIM） 獲取數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍設(shè)置為33～600 m/z，溶劑延遲時間為5 min，掃描速度為2.59 scan·s?1，界面和離子源的溫度分別為280 和230 ℃，檢測器電壓維持在1.2 kV，電子碰撞能量為70 eV。

1.2.4 基于GC-MS 技術(shù)的頂空進樣方法

稱取煙葉粉末1 g 于20 mL 頂空進樣瓶中，壓緊瓶蓋，進行GC-MS 分析（Agilent 7890A 氣相色譜系統(tǒng)和7697A 頂空進樣器，Agilent 公司；5977 質(zhì)量選擇檢測器，MSD）。色譜柱為AgilentDB-5MS。柱溫箱初始溫度為40 ℃，以5 ℃/min增加到80 ℃，持續(xù)2 min；然后以5 ℃/min 增加到150 ℃，持續(xù)5 min；再以5 ℃/min 增加到200 ℃；最后以10 ℃/min 增加到280 ℃。上樣體積1 μL，不分流進樣；柱流量為1 mL/min；傳輸線和離子源的溫度分別為280 和230 ℃。儀器分析前，使用全氟三丁胺對質(zhì)譜儀進行調(diào)試，以獲得最佳性能。采用全掃描模式采集數(shù)據(jù)，質(zhì)譜掃描范圍設(shè)置為33～600 m/z。

1.2.5 代謝物統(tǒng)計分析方法

采用正交偏最小二乘判別分析法對檢測鑒定出的代謝產(chǎn)物進行多元統(tǒng)計分析，獲得變量重要性投影值（variable importance in project，VIP） 結(jié)合P 值篩選結(jié)果，同時滿足VIPgt;1 和Plt;0.05 的代謝物即為差異代謝物。

1.3 轉(zhuǎn)錄組分析

1.3.1 RNA 提取

使用天根生化科技（TIANGEN） 的RNAprepPure 試劑盒提取煙草葉片總RNA。所有樣品的RNA 完整性指數(shù)均大于6.4，質(zhì)量符合建庫測序要求。

1.3.2 cDNA 文庫構(gòu)建

使用適用于Illumina 測序平臺的NEBNext?Ultra? RNA 文庫制備試劑盒（NEB，美國） 構(gòu)建cDNA 文庫。使用qRT-PCR 對文庫有效濃度進行準確定量，文庫有效濃度需高于2 nmol/L，以保證文庫質(zhì)量。

1.3.3 測序質(zhì)控和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組序列比對

測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。使用TopHat2 軟件將清潔數(shù)據(jù)（clean reads）與栽培煙草參考基因組（https：//solgenomics.net/）進行比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息，并分析測序樣品特有的序列特征。

1.3.4 差異基因表達分析

使用DESeq2 軟件進行差異表達分析，以計算獲得差異表達基因?；虮磉_量的計算采用每百萬轉(zhuǎn)錄本數(shù)（transcripts per million，TPM） 法。

1.3.5 差異基因GO 分析和KEGG 富集分析

使用ClusterProfile 軟件對差異基因集進行基因本體論（gene ontology，GO） 功能分析及KEGG通路富集分析。對于KEGG 通路富集，顯著性富集的閾值設(shè)定為校正后的P 值（Padj） 小于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 獲得的煙草OR 基因編輯突變體

栽培煙草參考基因組中共獲得2 條高匹配度的蛋白序列，分別為NtOR （XP_016501308.1）和NtOR2 （NP_001312150.1）。氨基酸序列多重比對結(jié)果顯示：普通煙草OR 基因的2 個拷貝（NtOR和NtOR2） 分別來源于林煙草和絨毛狀煙草的OR基因（圖1a）。煙草的OR 蛋白序列高度保守，NtOR編碼的氨基酸序列N 端含有OR 類蛋白特有的CxxCxGxG 結(jié)構(gòu)域，與其他物種的OR 氨基酸序列相似度達79%；煙草NtOR 與番茄SlOR 的蛋白序列同源性最高，達86.22% （圖1b）。此外，煙草中的該基因由8 個外顯子和7 個內(nèi)含子組成（圖1c），表明OR 蛋白編碼基因在煙草屬內(nèi)具有高度保守性。

根據(jù)NtOR 基因的基因組DNA 序列，設(shè)計了靶向NtOR 基因的特異性靶點（圖2a）。對T0 代陽性植株的NtOR 基因進行高通量測序，經(jīng)自交純合種植，獲得了NtOR 基因發(fā)生純合編輯的T3代陽性植株（編號208）。該植株的NtOR 基因缺失了3 個堿基（TCT）（圖2a），導(dǎo)致翻譯后產(chǎn)物第25 位的亮氨酸缺失（圖2b）。

2.2 突變煙株類胡蘿卜素含量檢測

由圖3 可知：與對照煙株相比，突變株系208 煙葉中的類胡蘿卜素含量顯著降低，尤其是β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量顯著降低。這表明NtOR 基因的突變影響了煙草中β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的合成。

2.3 突變煙株的代謝成分

雖然差異倍數(shù)較小，但基于LC-MS 技術(shù)的非靶向方法仍篩選出136 個差異代謝物。由圖4可知：采用GC-MS 技術(shù)的衍生化法和頂空進樣法分別篩選出10 和14 個差異代謝物。與對照煙株相比，突變株系208 中的有機酸、二萜類、芳香烴、呋喃類等代謝物含量顯著升高，而氨基酸、生物堿和甾醇類物質(zhì)的含量則顯著降低。

2.4 突變煙株的轉(zhuǎn)錄組

由圖5 可知：與對照煙株相比，突變株系208 中共檢測到10 369 個差異表達基因，其中上調(diào)基因4 178 個，下調(diào)基因6 191 個。

由圖6 可知：差異表達基因主要富集于植物—病原菌互作途徑；類黃酮生物合成途徑、苯丙烷生物合成途徑、二萜生物合成途徑和類胡蘿卜素生物合成途徑也富集了較多的差異表達基因。類黃酮是煙草中重要的致香前體物質(zhì)，其合成、代謝在煙草香氣物質(zhì)形成中起著關(guān)鍵作用；苯丙烷生物合成途徑的產(chǎn)物和二萜類化合物也在煙草品質(zhì)的形成中發(fā)揮重要作用。因此，推測NtOR 基因的突變可能影響了類黃酮和萜類物質(zhì)的代謝，從而可能改善煙葉品質(zhì)。表明NtOR 基因?qū)φ{(diào)節(jié)煙草香氣和品質(zhì)具有重要意義。

3 討論

煙草是中國重要的經(jīng)濟作物，也是植物生物技術(shù)研究中常用的模式植物。煙草主要用于卷煙產(chǎn)品的生產(chǎn)，穩(wěn)定的香氣風(fēng)格是確保卷煙產(chǎn)品質(zhì)量和效益的前提。類胡蘿卜素作為主要的香氣前體物質(zhì)，是當前煙草香氣研究的熱點。本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了針對NtOR 基因的靶標敲除載體，并轉(zhuǎn)化至煙草中，獲得了NtOR 基因突變的純合株系208。該突變株系中，NtOR 基因缺失了3 個堿基，導(dǎo)致第25 位亮氨酸缺失。NtOR 突變導(dǎo)致香氣前體物質(zhì)β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量顯著降低，這一結(jié)果與前人研究中“OR 基因的過表達可提高β-胡蘿卜素含量”的結(jié)論[14， 19-20]相一致。在擬南芥中，AtOR 基因的過表達可促進類胡蘿卜素的積累[14， 19]；對積累少量類胡蘿卜素的白玉米品種進行AtOR 基因轉(zhuǎn)化，可將類胡蘿卜素含量提高32 倍[20]。此外，花椰菜[9， 21]、甘薯[12]和甜瓜[22]的OR 基因也均可促進類胡蘿卜素的積累。

本研究表明： 突變株系208 中， NtOR 基因編碼的氨基酸序列缺失了1 個亮氨酸，對類胡蘿卜素的積累產(chǎn)生了顯著影響。在擬南芥中過表達AtOR基因、在高粱中過表達OR 基因均可使類胡蘿卜素含量增加2 倍，而改變野生型OR 蛋白的單一氨基酸（如將90 位精氨酸替換為組氨酸或丙氨酸） 可顯著增強其促進類胡蘿卜素積累的能力[19]。組氨酸是蛋白質(zhì)活性位點或結(jié)合位點中最常見的氨基酸之一[23]，因此，在OR 中的突變可能改變或產(chǎn)生新的活性中心，或賦予該區(qū)域與某些未知蛋白質(zhì)新的相互作用能力。本研究中，突變株系NtOR 基因編碼的氨基酸序列缺失了第25 位亮氨酸，導(dǎo)致類胡蘿卜素含量降低，這可能是由于亮氨酸的缺失導(dǎo)致了活性中心或結(jié)合位點喪失，這一假設(shè)有待進一步研究驗證。

除β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量變化外，本研究還檢測到大量差異代謝物和差異表達基因，其中，玉米黃素環(huán)氧化酶表達下調(diào)，紫黃質(zhì)含量顯著下降。類胡蘿卜素不僅是致香前體物質(zhì)，還是植物體內(nèi)合成脫落酸和獨腳金內(nèi)酯的前體[3]，其含量變化必然會導(dǎo)致這2 種植物激素的含量發(fā)生變化。有研究表明：AtOR 基因的過表達通過脫落酸依賴途徑增強了擬南芥的耐旱性[24]；而甘薯中的OR 蛋白可提高其耐鹽性[13]；過表達甘薯OR 基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿植株表現(xiàn)出較強的非生物脅迫耐受性[25]。這些研究結(jié)果可能解釋了突變株系208 中差異表達基因在植物—病原菌互作途徑中的富集。此外，類黃酮生物合成途徑、苯丙烷生物合成途徑、二萜生物合成途徑和類胡蘿卜素生物合成途徑也富集了較多的差異表達基因，而類黃酮、苯丙烷的合成產(chǎn)物和二萜在煙草品質(zhì)形成中發(fā)揮著重要作用，因此，突變株系208 的煙葉品質(zhì)可能會發(fā)生顯著變化。

4 結(jié)論

本研究運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)獲得了煙草NtOR 基因突變株系。該株系的NtOR 基因發(fā)生了3 個堿基的缺失突變。與對照煙株相比，突變株系煙葉中重要的香氣前體物質(zhì)β-胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的含量顯著降低；同時，向紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)化的玉米黃素環(huán)氧化酶的表達下調(diào)。差異表達基因主要富集于植物—病原菌互作途徑。研究結(jié)果為進一步探討OR 蛋白的結(jié)構(gòu)及其活性中心的改變提供了基礎(chǔ)，也為培育抗病且類胡蘿卜素含量較高的煙草品種提供了理論依據(jù)。

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責(zé)任編輯：何承剛

基金項目：中國煙草總公司科技重大專項[110202001028 （JY-11）]；云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目（2021JC09）；云南省煙草化學(xué)重點實驗室開放課題（2021539200340248）。