摘要： 【目的】研究短小芽孢桿菌05-5402 和高地芽孢桿菌J54 應(yīng)用方式對煙葉中煙草特有亞硝胺（tobaccospecificnitrosamines，TSNAs） 含量的影響?！痉椒ā繉SNAs 降解菌種施加于生長中的白肋煙和旱煙，采收成熟的煙葉，晾制后檢測煙葉中的TSNAs 含量；利用菌種發(fā)酵烘烤后的煙葉，分析不同發(fā)酵方式對烤煙煙葉中TSNAs 含量的影響?！窘Y(jié)果】（1） 在晾曬煙的生長過程中，施加芽孢桿菌菌液能極顯著降低煙葉TSNAs 的含量，其中，05-5402 對白肋煙TSNAs 的降解效率較高，為54.75%～60.78%；而J54 對旱煙TSNAs 的降解效率較高，為53.23%～63.18%。（2） 與固態(tài)發(fā)酵相比，液態(tài)發(fā)酵模式下菌株降解TSNAs 的效果更好，05-5402 和J54 分別能顯著降低煙葉中31.99% 和35.86% 的TSNAs?！窘Y(jié)論】短小芽孢桿菌05-5402 和高地芽孢桿菌J54 能有效降低煙葉的TSNAs 含量，并且在多種處理方式下均有較好的效果。

關(guān)鍵詞： 芽孢桿菌；煙草特有亞硝胺；煙草；發(fā)酵

中圖分類號： S572.01 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 05?0048?07

煙草特有亞硝胺（tobacco-specific nitrosamines，TSNAs） 是一類特有的生物堿，對人體健康構(gòu)成重大威脅，煙葉原料中TSNAs 含量過高還會限制煙葉的可用性。目前，針對TSNAs 的研究主要集中于其4 種類型：N-亞硝基降煙堿（N′-Nitrosonornicotine，NNN）、4-N-亞硝基甲基氨-1-吡啶基丁酮[4-（N-nitrosomethylamino）-1-（3-pyridyl）-1-butanone，NNK]、N-亞硝基新煙草堿（N ′ -nitrosoanabasine，NAT） 和N-亞硝基假木賊堿（N-nitrosoanabasine，NAB）[1]，其中，NNN 和NNK 被列為I 類致癌物[2]。因此，降低煙葉的TSNAs 含量具有重要意義。研究表明：可以通過調(diào)整農(nóng)業(yè)栽培措施[3-5]和利用化工原理[6]來降低煙葉中的TSNAs 含量，而利用微生物降低TSNAs 含量的方式具有操作簡單、成本低、無污染等優(yōu)勢。

關(guān)于微生物降解煙葉中TSNAs 含量的研究已有大量報道。單宏英等[7]將熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens） AS97 施用于煙絲，其TSNAs 含量降低了45.47%；張玉芹等[8]將反硝化細(xì)菌（Agrobacterium radiobacter） B88 和B237 作用于白肋煙煙絲， 分別使TSNAs 含量下降了24.30% 和23.00%；KATSUYA 等[9]利用反硝化細(xì)菌LG77， 使白肋煙中的TSNAs 含量下降了26.61%；汪安云等[10]從白肋煙品種TRM 葉片中分離到1 株可降低TSNAs 含量的內(nèi)生芽孢桿菌，其TSNAs 的降解率為81.3%。以上研究結(jié)果表明：利用微生物降低煙葉中的TSNAs 含量是可行且有效的。

目前，降解TSNAs 的研究主要集中在煙葉的調(diào)制期，而通過降低TSNAs 的前體物來抑制其生成也是可行的。周迪等[2]和周炎等[11]研究表明：TSNAs 的含量與其前體物有較強(qiáng)的相關(guān)性。TSNAs 的2 類前體物分別是含氮化合物和亞硝酸鹽衍生物。CUI 等[12]研究表明：在煙株生長過程中幾乎不積累亞硝酸鹽；而煙葉中2 種主要含氮物質(zhì)（煙堿和蛋白質(zhì)） 卻會在煙株生長過程中持續(xù)積累[13]。已有研究表明芽孢桿菌等微生物能夠降解煙葉中的蛋白質(zhì)[14-15]。此外，張玉玲等[16]研究表明：在煙株生長過程中，噴施菌液可以降低煙葉的TSNAs 含量。因此，在煙株生長過程中利用微生物來降低TSNAs 也是可行的。

白肋煙是卷煙工業(yè)常用的晾煙品種。旱煙又稱土煙、葉子煙，屬于曬煙的一種，直接通過曬制工藝加工而成，是云南省優(yōu)質(zhì)地方性晾曬煙之一。晾曬煙具有獨特的風(fēng)格特色，是卷煙產(chǎn)品原料配方的重要部分，可以極大地改善卷煙的感官質(zhì)量，但其TSNAs 含量較高，影響后續(xù)的產(chǎn)品應(yīng)用。硃砂煙屬于烤煙的尼古丁轉(zhuǎn)化株，能夠?qū)⒋蟛糠帜峁哦∞D(zhuǎn)化為降煙堿，其TSNAs 含量通常顯著高于常規(guī)烤煙品種。因此，降低煙葉中的TSNAs 含量對卷煙生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。已有研究表明：短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus） 05-5402 和高地芽孢桿菌（B. altitudinis） J54 能夠通過發(fā)酵方式降低白肋煙中的TSNAs 含量[17-18]。然而，尚未開展其在大田期降低TSNAs 含量的應(yīng)用及發(fā)酵工藝優(yōu)化的研究?；诖?，本研究擬在前人研究的基礎(chǔ)上，從田間施用方式和發(fā)酵工藝優(yōu)化入手，深入研究這2 株芽孢桿菌降低TSNAs含量的應(yīng)用范圍和能力，為煙葉TSNAs 含量調(diào)控技術(shù)研發(fā)提供有效的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 煙株和煙葉

田間試驗所用材料為白肋煙和旱煙，2022 年種植于云南省玉溪市九溪鎮(zhèn)；發(fā)酵試驗所用材料為2022 年種植于云南省玉溪市研和鎮(zhèn)的硃砂煙，在成熟時采摘其中部煙葉并烘烤后作為發(fā)酵煙葉原料。

1.1.2 培養(yǎng)基

使用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)芽孢桿菌，其配方為：酵母粉5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10g/L，固體培養(yǎng)基再添加15% 瓊脂；烤煙原料的發(fā)酵以無機(jī)鹽培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，其配方為：K2HPO4 0.200 g/L，KH2PO4 0.800 g/L，MgSO4 0.200 g/L，CaSO4·H2O0.100 g/L，Na2MoO4 0.003 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g/L。所用培養(yǎng)基均于115 ℃ 高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備

挑選活化后的單菌落于5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，置于28 ℃、160 r/min 的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～18 h，作為一級種子液；按照1% 的接種量將一級種子液接種至50 mL LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，收集培養(yǎng)后的菌體，用無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌菌體并調(diào)節(jié)菌液OD600 至1.8～2.0，制成二級種子液。

1.2.2 田間試驗

在煙株旺長期，將二級種子液分別施于煙株葉面和根部。白肋煙的處理包括：（1） 以未施加菌液的煙株為對照組（CK）；（2） 煙葉表面噴施菌液5 mL （處理A）；（3） 煙株根部灌注菌液15 mL（處理B）；（4） 煙葉表面噴施菌液5 mL 并根部灌注15 mL （處理C）。旱煙的處理包括：（1） 以不加菌液的煙株為對照組（CK）；（2） 煙葉表面噴施菌液 125 mL （處理X）；（3） 煙株根部灌注菌液65 mL（處理Y）；（4） 煙葉表面噴施菌液125 mL 并根部灌注65 mL （處理Z）。待煙株生長至成熟期即采摘中部煙葉，按當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)工藝進(jìn)行晾制，收集晾制后的煙葉樣品。以上所有處理均設(shè)置15 個重復(fù)，采樣后隨機(jī)合并為3 個重復(fù)進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.3 烤煙原料發(fā)酵試驗

將烘烤后的煙葉研磨成粉后進(jìn)行發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵的處理包括：（1） 50% 含水量的發(fā)酵體系：稱量煙葉粉末15 g，添加無機(jī)鹽培養(yǎng)基13 mL，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，接種二級種子液2 mL；（2） 70% 含水量的發(fā)酵體系：稱量煙葉粉末15 g，添加無機(jī)鹽培養(yǎng)基33 mL，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，接種二級種子液2 mL。液態(tài)發(fā)酵體系為：稱量煙葉粉末5 g，添加無機(jī)鹽培養(yǎng)基45 mL，高壓蒸汽滅菌后冷卻至室溫，接種二級種子液2 mL。對照組則添加等量的無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替種子液，每個處理設(shè)置3 個重復(fù)。固態(tài)發(fā)酵體系將發(fā)酵瓶置于28 ℃ 恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵7 d；液態(tài)發(fā)酵體系置于28 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以160 r/min 的轉(zhuǎn)速發(fā)酵7 d。發(fā)酵完成后12 000 r/min離心收集煙葉樣品，置于65 ℃ 烘干，收集烘干的樣品進(jìn)行TSNAs 含量的測定。

1.2.4 煙葉中TSNAs 含量的測定

TSNAs 含量采用超高效液相色譜法測定。首先，使用萃取液萃取煙葉樣品，萃取液配方為：乙酸胺7.708 g， 10 ng/mL 內(nèi)標(biāo)（NNN、NNK、NAT 和NAB） 10 mL，定容至1 L。稱量烘干后的煙葉樣品1.000 g 至100 mL 萃取液中，置于220 r/min 的振蕩器中室溫萃取45 min，取2 mL上清液，經(jīng)0.2 μm 水相濾膜過濾后用UPLC-MS/MS 檢測NNN、NNK、NAT 和NAB 的含量[19]。

1.2.5 煙葉常規(guī)化學(xué)成分含量的測定

按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測定煙葉中的常規(guī)化學(xué)成分，包括總糖、還原糖、總氮、煙堿和蛋白質(zhì)。其中，總糖和還原糖含量的測定參照YC/T 159—2002；總氮含量的測定參照YC/T 161—2002；煙堿含量的測定參照YC/T 160—2002；蛋白質(zhì)含量的測定參照YC/T 166—2003。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 9.0 和Excel 2016 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和制圖；數(shù)據(jù)以3 個重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；各處理組與對照組之間的差異采用t 檢驗進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌對白肋煙常規(guī)化學(xué)成分和TSNAs含量的影響

由表1 可知：短小芽孢桿菌05-5402 主要影響白肋煙煙葉的總糖、總氮和蛋白質(zhì)含量。除葉面噴施外，其他處理的總糖含量均顯著增加；還原糖含量也呈增加趨勢，只有根部灌注處理的還原糖含量顯著升高；總氮含量呈下降趨勢；蛋白質(zhì)含量呈顯著或極顯著下降趨勢；葉面噴施和葉面噴施聯(lián)合根部灌注可以顯著或極顯著提高煙堿含量，分別較對照提高了15.17% 和33.33%。高地芽孢桿菌J54 對白肋煙煙葉常規(guī)化學(xué)成分的影響相對較小，其中，總糖含量極顯著提高；其他主要化學(xué)成分的整體差異不大，僅葉面噴施聯(lián)合根部灌注顯著提高了總氮和煙堿含量，蛋白質(zhì)含量則極顯著下降22.00%。

由圖1 可知：短小芽孢桿菌05-5402 和高地芽孢桿菌J54 均能極顯著降低白肋煙煙葉中的TSNAs 含量。其中，葉面噴施和根部灌注05-5402 可以使TSNAs 含量分別下降54.75% 和57.61%，兩者聯(lián)合施用可以使TSNAs 含量下降60.78%；而葉面噴施和根部灌注J54 可以使TSNAs含量分別下降40.93% 和26.00%，兩者聯(lián)合施用使TSNAs 含量下降41.42%。

2.2 芽孢桿菌對旱煙常規(guī)化學(xué)成分和TSNAs 含量的影響

由表2 可知：05-5402 菌液作用于旱煙時，3 種處理均能顯著或極顯著降低煙葉中總糖、還原糖和蛋白質(zhì)的含量；僅根部灌注處理可顯著提高總氮含量；3 種處理均能極顯著提高煙堿含量，其中，葉面噴施處理的煙堿含量增幅最高（51.39%），葉面噴施聯(lián)合根部灌注處理的煙堿含量增幅最小（33.49%）。使用J54 菌液作用于煙株時，3 種處理方式均能顯著或極顯著降低總糖和還原糖含量；均能顯著或極顯著提高煙堿含量，其中，葉面噴施聯(lián)合根部灌注處理的增幅最小（21.40%），與05-5402 的影響趨勢相似；對總氮含量的影響總體表現(xiàn)為增加趨勢，其中葉面噴施聯(lián)合根部灌注菌液可顯著提高總氮含量；而對蛋白質(zhì)含量的影響總體表現(xiàn)為降低趨勢，且葉面噴施和根部灌注均可顯著降低蛋白質(zhì)含量。

由圖2 可知：在旱煙生長過程中，施加芽孢桿菌菌液可極顯著降低晾制后煙葉的TSNAs含量。其中， 施用05-5402 于葉面和根部時，TSNAs 含量分別下降39.02% 和26.35%，聯(lián)合使用可以使TSNAs 含量下降46.28%；施用J54菌液于葉面和根部時， TSNAs 含量分別下降53.23% 和63.18%，聯(lián)合使用可以使TSNAs 含量下降56.27%。

2.3 芽孢桿菌發(fā)酵模式對煙葉TSNAs 含量的影響

2.3.1 固態(tài)發(fā)酵模式

由表3 可知：固態(tài)發(fā)酵體系的含水量為50%時，05-5402 和J54 均能降低烤煙煙葉中的TSNAs含量；但05-5402 僅能降低7.62% 的TSNAs，主要降低了煙葉中的NNK 和NAB 含量，降解效果不顯著；而J54 能顯著降低18.9% 的TSNAs，且主要顯著或極顯著降低了NNN 和NNK 的含量。當(dāng)固態(tài)發(fā)酵體系的含水量為70% 時，05-5402 能顯著或極顯著降低煙葉中的NNN 和TSNAs 含量，降幅分別為14.13% 和17.15%；J54 能顯著降低煙葉中5.52% 的NNN 和48.14% 的NAB，雖然NNK、NAT 和TSNAs 含量也有所下降，但未達(dá)到顯著差異水平。

2.3.2 液態(tài)發(fā)酵模式

由表4 可知：在液態(tài)發(fā)酵模式條件下，施用05-5402 后，煙葉中的NNN 和NAB 含量均顯著或極顯著下降，降幅分別為36.42% 和25.88%，整體上可以降低煙葉31.99% 的TSNAs，作用效果顯著；J54 則能顯著降低35.86% 的TSNAs，且對NNN 的作用效果明顯，能夠極顯著降低39.31%的NNN。

3 討論

含氮化合物是TSNAs 形成的重要前體，其含量的下降能夠直接減少TSNAs 生成[20]，因此，煙草次級生物堿含量減少可直接降低 TSNAs含量。汪安云[21]的研究表明：細(xì)菌能夠在晾曬煙的晾制后期顯著降低其NNN 含量，從而使TSNAs 含量降低， 同時證明了微生物對降低TSNAs 具有一定效果。史宏志等[22]證實了煙葉中次級生物堿的轉(zhuǎn)化率與NNN 及總TSNAs 含量呈極顯著正相關(guān)。這些結(jié)果與本研究一致，05-5402 和J54 可以降低煙葉中的TSNAs，且主要是NNN 含量的下降，再次證明了利用細(xì)菌降低煙葉的TSNAs 含量是可行的。

本研究表明：芽孢桿菌05-5402 和J54 均能提高白肋煙的總糖和還原糖含量，而對總氮含量則整體表現(xiàn)為下降趨勢，對蛋白質(zhì)含量的影響也以下降為主；在旱煙中，也表現(xiàn)出較強(qiáng)的降低蛋白質(zhì)含量的能力。這些結(jié)果與前人研究一致。馮志珍等[14]的研究導(dǎo)致煙葉中蛋白質(zhì)的含量下降24.46%；李梅云等[15]將細(xì)菌S8 作用于烤煙K326，導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量下降5.17%，表明芽孢桿菌可有效降低煙葉的蛋白質(zhì)和總氮含量。芽孢桿菌對旱煙中含氮化合物的影響主要表現(xiàn)為提高煙葉中的煙堿含量，對其總氮含量的作用效果則受到菌液施用方式的影響。TSNAs 也是煙葉中的含氮化合物，芽孢桿菌對降低旱煙中的TSNAs 含量仍具有積極作用。此外，施用芽孢桿菌后，煙葉的總糖含量普遍上升，在白肋煙中的還原糖含量呈上升趨勢，而在旱煙中則主要表現(xiàn)為下降。倪涵等[23]的研究表明：將芽孢桿菌作用于煙葉能夠影響其還原糖、纖維素等糖類成分的含量，與本研究結(jié)果一致。

目前關(guān)于細(xì)菌影響煙葉化學(xué)成分和TSNAs含量的調(diào)控機(jī)制的研究較少，僅有少量文獻(xiàn)進(jìn)行了解釋。葉長文等[24]研究表明：細(xì)菌降低TSNAs含量與其pncB、nadD、nadC、nirB、nirD、nirC、cysI 等基因相關(guān)，它們是降低煙葉中硝酸鹽和亞硝酸鹽的關(guān)鍵基因，而硝酸鹽和亞硝酸鹽作為合成TSNAs 的重要前體， 其含量降低會導(dǎo)致TSNAs 含量減少。鄒玲[25]的研究表明：芽孢桿菌降低煙葉TSNAs 含量與細(xì)菌胞內(nèi)的糖酵解、碳代謝、淀粉和蔗糖代謝相關(guān)?？傊?，利用芽孢桿菌05-5402 和J54 降低煙葉TSNAs 含量是可行的，但其降解調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

本研究還表明：芽孢桿菌對煙葉中TSNAs含量的影響與發(fā)酵方式及發(fā)酵體系的含水量相關(guān)。在液態(tài)發(fā)酵體系中，05-5402 和J54 分別降低了煙葉中31.99% 和35.86% 的TSNAs，遠(yuǎn)高于含水量為50% 和70% 的固態(tài)發(fā)酵體系。孫榅淑等[26]和丁睿[27]的研究也表明：含水率顯著影響TSNAs 含量。因此，推測液態(tài)發(fā)酵的方式有助于芽孢桿菌的定殖，提高菌株活性，從而達(dá)到更佳的效果。

4 結(jié)論

短小芽孢桿菌05-5402 和高地芽孢桿菌J54均能有效降低煙葉中的TSNAs 含量，但相關(guān)作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。相對于較低含水量的固態(tài)發(fā)酵體系，提高發(fā)酵體系的含水量能更有效地降低煙葉中的TSNAs 含量。通過田間噴施或直接發(fā)酵煙葉均可有效降低煙葉中的TSNAs 含量。研究結(jié)果為低TSNAs 煙葉的生產(chǎn)提供了重要的技術(shù)支持，拓寬了微生物降低煙葉TSNAs 含量的應(yīng)用范圍。

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責(zé)任編輯：何承剛

基金項目：云南省煙草化學(xué)重點實驗室開放課題（2020539200340214）；云南中煙技術(shù)中心科技項目（11300295）。