關(guān)鍵詞 無機汞；腎臟毒性；質(zhì)譜成像；代謝物；毒性機理

在環(huán)境中，汞主要以元素汞（Hg0）、無機汞（Hg（Ⅱ））和有機汞（如甲基汞）的化學形態(tài)存在[1-2]。汞經(jīng)呼吸、飲食或皮膚暴露等途徑進入機體后，過量的汞累積可能會導致汞中毒或其它潛在的健康危害[3]。這主要是由于汞易在體內(nèi)蓄積，難以被機體排出。據(jù)Farris 等[4]報道，人體經(jīng)一次性靜脈注射0.6～2.8 μg的放射性Hg（Ⅱ），暴露70 d 后，僅有約30%和25%的汞可分別通過糞便和尿液排出，其體內(nèi)半衰期可達49～120 d。因此， Hg（Ⅱ） 暴露會對腎臟、神經(jīng)、心血管、血液、免疫和生殖系統(tǒng)造成不同程度的損傷[5]。

大量研究已證實，腎臟是無機汞（Hg（Ⅱ））的主要靶器官之一[6]。Hg（Ⅱ）經(jīng)體循環(huán)系統(tǒng)到達腎臟后，主要在腎皮質(zhì)以及外髓質(zhì)區(qū)域累積，特別是近曲小管段[7]。這是由于腎小管膜轉(zhuǎn)運蛋白參與了Hg（Ⅱ）的轉(zhuǎn)運[8]，包括近端小管基底外側(cè)膜上的有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白和管腔膜上的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白[9]。最終，Hg（Ⅱ）的局部累積會對腎臟的近端小管、遠端小管和腎小球膜造成破壞，并導致刷狀邊界膜的損傷和壞死[6]。

目前，臨床診斷汞中毒引起的腎功能異常主要依賴于監(jiān)測血尿素氮（Blood urea nitrogen， BUN）和血清肌酐（Serum creatinine， Scr）等常規(guī)生化指標。然而，在實際應用中，利用這些生化指標評價腎功能仍具有一定的局限性。通常，只有當患者的腎臟功能損傷較為嚴重時上述指標才會發(fā)生顯著性變化，因此難以進行早期診斷[10]。另一方面，質(zhì)譜成像（Mass spectrometry imaging， MSI）技術(shù)可用于原位解析生物組織中分子的空間分布規(guī)律，對生物分子進行定性、定量和定位分析，并且無需復雜的樣本前處理即可實現(xiàn)生物標志物的快速和精準識別[11]。例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（MALDI-MSI）和解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（DESI-MSI）已被成功地應用于腎臟研究[12-13]。Irie 等[14]報道，經(jīng)1 mg/mL 順鉑腹腔注射3 h 后，利用MALDI-MSI即可觀察到腎臟內(nèi)的代謝異常，但傳統(tǒng)方法只能在給藥72 h 后檢出BUN 的升高。因此，應用MSI 技術(shù)能夠揭示早期或亞臨床的腎臟損傷特征，為汞暴露的腎臟毒性研究提供了一種有效手段。

近年來，在DESI-MSI 的基礎(chǔ)上， He 等[15]開發(fā)了一種具有覆蓋范圍廣、靈敏度高和動態(tài)范圍寬等特點的空氣動力輔助解吸電噴霧質(zhì)譜成像（AFADESI-MSI）技術(shù)。為探究Hg（Ⅱ）暴露造成腎臟損傷的主要特征及潛在機理，本項研究采用AFADESI-MSI 技術(shù)，考察了飲用水Hg（Ⅱ）暴露造成的小鼠腎臟損傷特征。同時，結(jié)合組織病理分析，解析了Hg（Ⅱ）對腎臟尿素循環(huán)與谷胱甘肽代謝途徑的關(guān)鍵代謝物的影響（圖1），初步探究了Hg（Ⅱ）的腎臟毒性效應與潛在的作用機理。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

AFAI-MSI 系統(tǒng)（北京維科托科技有限公司）和Orbitrap Exploris120 靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific 公司）用于MSI 分析；Microm HM525 冰凍切片機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）用于制備腎臟冷凍切片樣本；XS-37C 三目倒置生物顯微鏡（上海蒲柘光電儀器有限公司）用于腎組織切片的病理分析；EQ7000 純水儀（美國Millipore 公司）用于制備實驗用超純水。

HgCl₂（99.7%，中國化工進出口公司）；磷酸鹽緩沖液（北京索來寶科技有限公司）；乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；OCT包埋粘合劑（美國Sakura Finetek公司）；水合氯醛溶液（10%， m/V，上海源葉生物科技有限公司）；正電荷防脫載玻片（4951 PLUS-001E，美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 動物實驗

雌性BALB/c 小鼠（7～8周齡，體重（18±1） g）購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司。對小鼠進行隨機分組，每組5 只，飼養(yǎng)于12 h 光照/黑暗循環(huán)的環(huán)境中，保持溫度為（21±2） ℃，濕度為50%±5%。經(jīng)適應性喂養(yǎng)2 d 后，對暴露組小鼠進行飲用水Hg（Ⅱ）暴露。美國環(huán)境保護署（EPA）規(guī)定，飲用水中汞的最高限值為0.02 mg/L[16]。依據(jù)人類和小鼠的暴露劑量換算方法[17]，該限值換算后相當于小鼠0.25 mg/L 暴露劑量。此外，在汞的污染和極端污染地區(qū)，地下水中汞的濃度可達0.16～0.23 mg/L 和0.78～12.40 mg/L[18-19]，換算后的暴露劑量為1.98～2.82 mg/L和9.59～152.52 mg/L。因此，選擇0.3、3.0和60.0 mg/L作為暴露劑量，開展為期28 d的飲用水Hg（Ⅱ）暴露實驗。

在暴露期間，每2 d 對小鼠體重進行測量并記錄。在暴露第28 天，使用水合氯醛溶液對小鼠進行麻醉后，斷頸處死，收集腎臟樣本。腎臟樣本經(jīng)稱重后，立即置于液氮中冷凍，并放置于–80 ℃冰箱中保存。本研究已獲得中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心動物倫理委員會的批準（批準號AEWC-RCEES-2024041）。

1.3 血液生化分析

Scr采用肌酐氧化酶法測定，BUN采用尿素酶法測定，所用試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。分析過程按試劑盒的說明書進行操作。

1.4 質(zhì)譜成像

將腎臟樣本從–80 ℃冰箱取出后，置于–20 ℃冰箱過夜解凍。利用OCT 包埋膠將腎臟樣本橫向固定在冰凍切片機的切割臺上，對組織進行連續(xù)切片，并將厚度為12 mm 的組織切片置于載玻片上，保存于–80 ℃冰箱中。進行MSI 前，將切片樣本從–80 ℃冰箱轉(zhuǎn)移至–20 ℃冰箱進行過夜解凍。在開始MSI實驗前30 min， 將干燥器置于–20 ℃冰箱中預冷，繼而轉(zhuǎn)移切片樣本至干燥器內(nèi)，并在室溫條件進行真空干燥。之后，將干燥后的切片樣本固定在電移動臺上，分別采用正、負離子模式， x 軸方向以0.15 mm/s的速率進行連續(xù)掃描， y 軸方向以0.15 mm/s 的垂直臺階式分開，掃描范圍設(shè)置為100～1000 Da。最大注入時間為200 ms，正離子模式下噴霧電壓為4500 V， 負離子模式下噴霧電壓為4000 V，離子傳輸管電壓為±3000 V，溫度為350 ℃。以乙腈-水（8∶2，V/V）為溶劑，流速設(shè)置為5 μL/min；以氮氣（0.5 MPa）為載氣，流量設(shè)置為45 L/min。為扣除背景信號，選擇載玻片上的空白區(qū)域作為對照，設(shè)置質(zhì)荷比容差Δm/z=0.05，讀取離子類型、相對強度和空間位置等信息。使用Xcalibur 軟件（版本4.6.0.100，美國Thermo Fisher Scientific 公司）進行數(shù)據(jù)采集。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Xcalibur 4.6.0.100軟件將數(shù)據(jù)原始文件轉(zhuǎn)換為cdf 格式，使用Mass Imager Pro 1.0 軟件進行成像分析，并采用Origin 2021軟件繪制質(zhì)譜圖。暴露組與對照組之間的差異采用SPSS 24.0 軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA）檢驗。當plt;0.05 時，為顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。采用GraphPad Prism7.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析與繪圖。

2 結(jié)果和討論

2.1 Hg（Ⅱ）經(jīng)口暴露致腎臟損傷的組織病理特征

據(jù)報道， Hg（Ⅱ）暴露可導致腎小管上皮細胞壞死、無尿以及腎功能衰竭等癥狀[20]。實驗結(jié)果顯示，相較于對照組，經(jīng)28 d 飲用水Hg（Ⅱ）暴露后，小鼠的體重輕微降低，且呈現(xiàn)劑量依賴性，表明高劑量飲用水Hg（Ⅱ）暴露在一定程度上影響了小鼠的生長（圖2A）。當Hg（Ⅱ）暴露劑量為60 mg/L 時，腎體比升高了1.43 倍（圖2B），并且BUN（圖2C）與Scr（圖2D）分別升高了1.26 與1.30 倍。BUN和Scr是評價腎功能的重要指標，可指示腎臟損傷的發(fā)生[21-22]。上述結(jié)果說明， 60 mg/L 飲用水Hg（Ⅱ）暴露可顯著破壞腎功能，造成腎臟損傷。然而，當暴露低劑量Hg（Ⅱ）時，并未觀測到上述指標的顯著變化，難以判斷腎臟的損傷程度，因此需要使用更靈敏和更準確的評價方法。

蘇木精-伊紅（Hamp;E）染色法是一種經(jīng)典的組織損傷評價方法，常被應用于毒理學和醫(yī)學研究，可對器官的組織結(jié)構(gòu)特征進行分析。為揭示低劑量Hg（Ⅱ）暴露造成的腎臟損傷，首先采用Hamp;E 染色法對3 mg/L Hg（Ⅱ）暴露后的小鼠腎臟進行組織病理檢查，如腎小管和腎小球等結(jié)構(gòu)的變化，為后續(xù)的MSI 分析提供依據(jù)。如圖3A～3H 所示，相較于對照組，暴露組的腎小球與髓質(zhì)區(qū)域均未發(fā)生明顯的結(jié)構(gòu)改變，但暴露組的腎小管上皮細胞變得扁平，有從基底膜上脫落的跡象，管腔輕微擴張，腎小管較多刷狀緣脫落，局灶基底膜斷裂。此外，暴露組的腎間質(zhì)出現(xiàn)水腫，腎小管間質(zhì)血管發(fā)生擴張充血，皮質(zhì)區(qū)域還出現(xiàn)淋巴細胞浸潤。進一步，對皮質(zhì)區(qū)域損傷的組織形態(tài)進行了定量分析（圖3I）。結(jié)果表明，相較于對照組，暴露組的腎臟損傷較大，具有統(tǒng)計學意義（plt;0.05），詳細的評分標準見電子版文后支持信息表S1。據(jù)文獻報道， Hg（Ⅱ）的腎臟毒性主要表現(xiàn)為近端小管直段的損傷，嚴重時可擴展至近端小管彎曲段以及遠端小管[23]。早期病變伴隨著近端小管刷狀邊界膜喪失，并導致尿中出現(xiàn)堿性磷酸酶和谷酰轉(zhuǎn)肽酶。當近端小管損傷嚴重時，丙氨酸氨基肽酶和N-乙酰-β-D-氨基酸葡萄糖苷酶也會隨尿液排出。此外，隨腎小球濾過率的下降，還會發(fā)生蛋白尿[6]。

綜上，飲用水Hg（Ⅱ）暴露會造成腎小管及間質(zhì)的輕微病變，可能與Hg（Ⅱ）導致的氧化應激、炎癥反應及細胞死亡等多種機制相關(guān)[6]。此外，腎小管管腔擴張和間質(zhì)水腫亦可能與Hg（Ⅱ）對腎臟代謝途徑的干擾有關(guān)，這種管腔擴張和間質(zhì)水腫會破壞腎臟功能，影響腎臟的濾過和排泄能力。

2.2 Hg（Ⅱ）暴露對腎臟中尿素代謝物的空間分布的影響

腎臟是機體的主要代謝器官之一，而內(nèi)源性分子的代謝紊亂在多種腎臟疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有不可忽視的作用，因此，研究腎臟組織中內(nèi)源性代謝物的變化對揭示腎臟損傷的機制及病變過程具有重要的參考價值。尿素循環(huán)是維持體內(nèi)氨平衡的關(guān)鍵代謝途徑（圖4A），其中間產(chǎn)物的變化能夠反映腎臟功能狀態(tài)[24]。尿素和肌酐常被視為評價腎臟功能的關(guān)鍵生物標志物，如腎臟的過濾、重吸收及排泄能力，反映腎小球濾過率的變化等[6]。機體還通過尿素循環(huán)生成精氨酸（Arginine）、瓜氨酸（Citrulline）和鳥氨酸（Ornithine）等內(nèi)源氨基酸，用于蛋白合成、代謝調(diào)節(jié)和信號調(diào)控等生物過程。例如，精氨酸是尿素循環(huán)過程的重要中間產(chǎn)物，可通過精氨酸脫酸酶的水解作用代謝為尿素（Urea）和鳥氨酸，后者在精氨酸琥珀酸合成酶和精氨酸琥珀酸裂解酶的共同作用下轉(zhuǎn)化為肌酸（Creatine）。繼而，肌酸在肌酸激酶活性的作用下轉(zhuǎn)化為肌酐（Creatinine）。當腎臟功能受損時，腎小球的濾過能力下降，會導致血液的肌酐水平上升[25]。同時，作為亞精胺（Spermidine）的主要前體，精氨酸在精氨酸酶的催化作用下，會被轉(zhuǎn)化為鳥氨酸和尿素，隨后鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶作用下進一步轉(zhuǎn)化為腐胺（Putrescine），最終腐胺通過ATP 活化反應生成亞精胺。

在Hamp;E 染色法分析組織病理的基礎(chǔ)上，MSI 法可進一步解析腎臟內(nèi)關(guān)鍵代謝物的空間分布特征，在分子水平上提供更豐富的腎臟損傷信息。本研究基于AFADESI-MSI 技術(shù)對Hg（Ⅱ）暴露影響尿素循環(huán)的規(guī)律進行了初步探究。如圖4B 所示，在正常小鼠的腎臟中，精氨酸主要分布于皮質(zhì)及腎盂區(qū)域，而Hg（Ⅱ）暴露導致髓質(zhì)區(qū)域的精氨酸含量顯著升高，其中，髓質(zhì)、皮質(zhì)和腎盂區(qū)域的信號強度分別升高了2.74、1.12 和1.69 倍（表1 和電子版文后支持信息圖S2）。亞精胺主要分布于皮質(zhì)及外髓質(zhì)區(qū)域，Hg（Ⅱ）暴露引起皮質(zhì)區(qū)域亞精胺的含量增加，其中，皮質(zhì)、腎盂、內(nèi)髓質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域分別增加5.33、4.35、1.64 和1.75 倍。肌酸和肌酐均主要分布在皮質(zhì)和腎盂區(qū)域， Hg（Ⅱ）暴露引起兩者的空間分布變化類似，主要為腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的含量增加。相較于對照組， Hg（Ⅱ）暴露后，在皮質(zhì)、腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的肌酸含量分別增加1.30、3.57 和4.42 倍，而肌酐分別增加1.16、3.70 和4.56 倍。上述結(jié)果說明，腎臟中精氨酸水平升高會造成其下游代謝物亞精胺、肌酸和肌酐的腎臟累積。此結(jié)果與文獻[26-27]報道結(jié)果一致，即急性Hg（Ⅱ）暴露會引起尿素、肌酐等腎功能標志物水平顯著升高。另有研究表明，經(jīng)1 mg/kg Hg（Ⅱ）暴露28 d后，大鼠體內(nèi)的肌酐、血清尿素和血尿素氮水平會顯著上升[25]。此外， Hg（Ⅱ）暴露還會抑制體內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性，這可能與鳥氨酸及亞精胺濃度升高有關(guān)，進而影響腎臟功能[27]；Hg（Ⅱ）還可能作用于有機陽離子轉(zhuǎn)運體2 和多藥及毒素外排轉(zhuǎn)運蛋白，造成腎臟的肌酐排出受限，導致其在體內(nèi)累積[26]。值得注意的是，盡管利用血生化法分析時， 3 mg/L 暴露組的血清肌酐濃度未顯著變化，但MSI 結(jié)果證實腎臟組織中肌酐的含量顯著上升，特別是在腎盂和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域。上述結(jié)果表明，相較于常用的血生化測試， MSI 法能夠更靈敏地檢測出腎臟損傷的生物標志物變化，同時提供豐富的空間分布信息，有助于腎臟損傷的精準診斷與健康風險評價。

2.3 Hg（Ⅱ）暴露對腎臟的谷胱甘肽代謝的影響

在機體正常代謝過程中，含巰基（–SH）的生物分子（氨基酸、多肽和蛋白酶）發(fā)揮了關(guān)鍵作用，包括維持氧化還原穩(wěn)態(tài)、信號傳遞與調(diào)控和催化生化反應等。例如，作為關(guān)鍵的抗氧化分子，還原性谷胱甘肽（GSH）可被谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），同時將過氧化氫（H2O2）還原成水（H2O），維持機體的氧化還原穩(wěn)態(tài)（圖5A）。半胱氨酸（Cys）是GSH 合成的主要來源[28-29]。在谷胱甘肽合成酶的作用下，Cys 可與谷氨酸（Glu）發(fā)生反應，生成γ-谷氨酸半胱氨酸（γ-GCS），進而在谷氨酰胺合成酶的作用下與甘氨酸（Gly）結(jié)合，最終形成GSH。由于汞具有較高的電子親和力，而巰基中的硫原子具有較高的電負性，兩者成鍵（–S–Hg–）的穩(wěn)定常數(shù)可達10²⁰～10³⁰[20，30-32]。在腎臟轉(zhuǎn)運過程中，Hg（Ⅱ）會與Cys 反應生成Cys-Hg-Cys，還會與GSH 反應生成GS-Hg-SG，這些復合物可通過腎小球過濾轉(zhuǎn)移至近端小管的管腔以及基底，參與Hg（Ⅱ）的體內(nèi)轉(zhuǎn)運與代謝過程[23，33]。因此，為揭示Hg（Ⅱ）的腎臟毒性機理，采用AFADESI-MSI 技術(shù)研究了Hg（Ⅱ） 暴露對谷胱甘肽及其主要代謝物的影響。

如圖5B所示，在正常小鼠的腎臟中，GSH 和GSSG 主要分布于腎髓質(zhì)區(qū)域。Hg（Ⅱ）暴露會引起GSH和GSSG含量分別增加1.38 和1.48 倍。同時，Hg（Ⅱ）暴露可能促進GSH 被氧化為GSSG，這可能是GSSG水平增加高于GSH 的原因。據(jù)報道，Hg（Ⅱ）暴露可導致小鼠腎臟組織中GSH 的上升[34]。由于GSH 在抵抗ROS 介導的組織損傷過程中起重要作用，因此腎臟組織中GSH 水平升高可能對氧化損傷具有保護作用，以清除Hg（Ⅱ）誘導生成的ROS[35]。此外，Cys 主要分布在腎盂、皮質(zhì)和外髓質(zhì)區(qū)域， Hg（Ⅱ）暴露后，這些區(qū)域的Cys 含量分別增加了2.36、1.31 和2.13 倍（表2）。據(jù)報道， Hg（Ⅱ）暴露能促進Cys 的合成，可能是因為Hg（Ⅱ）可與Cys 中的巰基結(jié)合，造成蛋白酶失活，進而破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)[35-36]。綜上，GSH、GSSG 和Cys 含量的增加可能是腎臟細胞對Hg（Ⅱ）暴露的一種氧化應激響應，證實Hg（Ⅱ）可通過擾亂氧化還原穩(wěn)態(tài)造成腎臟損傷。

3 結(jié)論

本研究利用MSI 技術(shù)解析了飲用水中Hg（Ⅱ）暴露對小鼠腎臟的尿素循環(huán)及谷胱甘肽相關(guān)代謝產(chǎn)物空間分布與含量的影響。Hamp;E 組織病理分析表明，經(jīng)3 mg/L Hg（Ⅱ）暴露28 d 后，腎小管管腔輕微擴張，上皮細胞扁平，間質(zhì)中度擴張充血，同時出現(xiàn)淋巴細胞浸潤等病變。進一步采用AFADESI-MSI 分析發(fā)現(xiàn)， Hg（Ⅱ）暴露引起腎臟組織中精氨酸、亞精胺、肌酸和肌酐等腎損傷標志代謝物水平顯著上升，干擾了谷胱甘肽的正常代謝。上述結(jié)果說明， Hg（Ⅱ）可通過造成氧化應激損傷破壞腎臟功能，干擾正常的尿素循環(huán)。同時，相較于血生化分析，MSI 法可更靈敏地檢出腎臟損傷的生物標志物變化，如肌酐。相較于以往的研究，本研究采用MSI 技術(shù)對典型代謝物進行解析，有助于深入理解Hg（Ⅱ）的腎臟毒性特征與作用機理，為汞中毒的臨床診斷提供了新的視角。在后續(xù)研究中，將繼續(xù)采用MSI 技術(shù)識別Hg（Ⅱ）暴露的潛在生物標志物，并揭示Hg（Ⅱ） 造成腎臟損傷可能的分子機制。