摘 要 羽毛是鳥類研究、監(jiān)測和管理中常用的非損傷性材料，可從中提取DNA和激素進行遺傳和生理分析。然而，作為高度角化的組織，羽翈中的DNA和激素含量極低，提取較為困難。本研究開發(fā)一種能夠從羽翈中同時提取總DNA和糖皮質(zhì)激素的方法，命名為DH-CoEx。以丹頂鶴（Grus japonensis）、綠孔雀（Pavo muticus）為代表的大型鳥類廓羽、尾上覆羽和以栗鹀（Emberiza rutila）、小鹀（E. pusilla）為代表的小型鳥類飛羽、絨羽進行測試和評估。結(jié)果顯示：DH-CoEx能有效從完全角化的羽翈中同時提取出總DNA及糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）；從5 mg樣本中提取的線粒體DNA（mtDNA）拷貝數(shù)達到104量級，可支持長達1 350 bp的片段擴增；所提取的核DNA（nuDNA）質(zhì)量足以進行長達200 bp的微衛(wèi)星等位基因分型，成功率為98. 11% ～ 99. 60%；提取的皮質(zhì)醇含量達到了傳統(tǒng)單一提取激素方法的水平，足以進行相關(guān)生理學(xué)分析。以上結(jié)果說明，DH-CoEx是一種簡易、高效和適用性廣泛的方法，實現(xiàn)了角化材料總DNA和糖皮質(zhì)激素的共提取，可以支持mtDNA和微衛(wèi)星等分子標(biāo)記的分析和應(yīng)激激素的分析，極大地提高了羽毛的利用率，具有廣泛的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：羽毛；DNA；糖皮質(zhì)激素；共提??；非損傷性采樣

中圖分類號：Q953

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0800 - 11

DOI：10.12375/ysdwxb.20240413

羽毛作為一種非損傷性樣本，可從中獲得DNA、RNA和激素，新鮮羽毛在羽軸基部的髓質(zhì)中甚至含有活細(xì)胞，因此被廣泛用于物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析、性別確定、遺傳多樣性分析、生理狀況分析以及細(xì)胞分離［1?8］，在鳥類生態(tài)和保護相關(guān)研究中發(fā)揮重要作用。羽毛由高度角化的細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞在角化過程中DNA、RNA會發(fā)生大規(guī)模降解，只有極少量的核DNA（nuDNA）和線粒體DNA（mtDNA）因被角蛋白包被而得到保留，這些殘留的mtDNA因拷貝數(shù)多且完整性相對較好，可以通過PCR擴增得到線粒體基因序列［9］，而nuDNA則不盡如人意。nuDNA不僅高度破碎化，拷貝數(shù)很少，其PCR擴增成功率往往很低，且還經(jīng)常出現(xiàn)等位基因缺失和非特異擴增等問題［10?13］，所以，羽毛提取的DNA較少用于核基因分析中，主要原因是在提取過程中nuDNA不能很好地裂解堅固的角化組織和充分釋放DNA，同時對微量且高度片段化的DNA回收效率不高。

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid）是鳥類生理調(diào)節(jié)的關(guān)鍵激素，對適應(yīng)環(huán)境、行為變化和能量管理至關(guān)重要，是生理分析的重要指標(biāo)之一［14］。血液中的激素可通過毛細(xì)血管滲透到毛囊細(xì)胞，最后擴散到羽毛中［15］。因此，通過分析脫落羽毛中的糖皮質(zhì)激素，可以無應(yīng)激地監(jiān)測鳥類的生理狀態(tài)，提高應(yīng)激相關(guān)研究實驗數(shù)據(jù)的可信性［16］。近年來，從羽毛中提取激素不斷取得成功［17］。然而，糖皮質(zhì)激素的提取與DNA的提取是完全獨立的工作，在很多研究中只能分開提取，對于稀缺的羽毛樣本消耗很大。因此，需要設(shè)計一種激素-DNA共提取方法。

提取糖皮質(zhì)激素時，首先需要對羽毛組織進行充分裂解，釋放糖皮質(zhì)激素，然后采用異丙醇提取，而這一過程也同時釋放了DNA，異丙醇能促進DNA在水溶液中沉淀，便于其分離和純化［18］。因此，相同的裂解液經(jīng)過異丙醇處理后，可以采用分步法分別獲得激素和DNA?；诖?，本研究建立一種能從羽翈中同時提取總DNA和糖皮質(zhì)激素的方法，命名為DNA-激素共提取法（DNA and hormone co-extraction，簡稱“DH-CoEx”）。該方法不僅為羽毛中DNA和激素的共同提取提供了新方法，且顯著提高了羽毛樣本的利用效率和信息挖掘潛力。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

共采集羽毛樣本79份，其中綠孔雀（Pavo muti?cus）36份，編號GP-01 ～ GP-36，代表大型陸禽；丹頂鶴（Grus japonensis）22 份，編號DDH-01 ～ DDH-22，代表大型涉禽；栗鹀（Emberiza rutila）和小鹀（E. pu?silla）代表小型鳥類，其中栗鹀14份，編號LW-01 ～LW-14，小鹀7 份，編號XW-01 ～ XW-07。此外，還采集了4份肌肉樣本，每種鳥類各1份。綠孔雀樣本是從云南省玉溪市新平縣和峨山縣交界處的野外拾取，丹頂鶴樣本是由秦皇島野生動物園、唐山動物園和溫州動物園提供，栗鹀和小鹀樣本均由黑龍江省齊齊哈爾市森林公安部門提供。綠孔雀羽毛為已脫落3 ～ 4 a的陳舊尾上覆羽［19］，其余羽毛皆為自然脫落的胸部或背部廓羽和絨羽，脫落后較短時間內(nèi)即收集和實驗。全部羽毛均在牛皮紙信封中自然干燥，常溫保存。肌肉樣本置于-20 ℃冷凍保存。

1. 2 DH-CoEx 的建立

1. 2. 1 DH-CoEx的原理

DH-CoEx 通過使用Tris-NaCl-Ca2+ 緩沖液替代TNE（Tris-NaCl-EDTA）緩沖液，從而提高了角化組織裂解的熱穩(wěn)定性和催化效率，實現(xiàn)了DNA和激素的高效釋放。為防止Ca2+影響PCR實驗，消化后加入EDTA螯合Ca2+。同時，增加蛋白酶K和DTT用量，使消化時間縮短至3 ～ 4 h，以確保角蛋白充分裂解，保持酶活性。在提取DNA和激素時，先加氯仿使角蛋白變性并通過高速離心去除蛋白組分，再用異丙醇萃取糖皮質(zhì)激素并促進DNA沉淀。最后，磁珠吸附DNA實現(xiàn)分離，而糖皮質(zhì)激素因異丙醇的萃取作用保留在溶液中，可使用常規(guī)方法回收。

1. 2. 2 羽毛樣本的預(yù)處理

從每個羽毛樣本上撕取羽翈5 ～ 10 mg放入1. 5 mLEP管中，用2%SDS溶液浸泡30 min，然后用純凈水沖洗，在75%乙醇中浸泡5 min，置于無菌培養(yǎng)皿中自然干燥。

1. 2. 3 樣本的消化及DNA-激素共提取

精準(zhǔn)稱取5 mg 預(yù)處理過的羽翈樣本移至無菌的1. 5 mL EP 管中，依次加入350 μL Tris-NaCl-Ca2+緩沖液、75 μL蛋白酶K（20 mg/mL）、75 μL DTT（200 mg/mL）和40 μL SDS（15%）。漩渦震蕩30 s，在56 ℃水浴鍋中消化3 ～ 4 h。隨后加入20 μL EDTA溶液（0. 5 mol/L），再次震蕩，繼續(xù)水浴1 h后取出提純。具體步驟如下。

（1）取400 μL氯仿加入上述1. 5 mL EP管中，輕輕搖勻30 s，靜置3 min，12 000 r/min離心15 min。

（2）吸取上清液于新的1. 5 mL EP管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻30 s，向管中加入40 μL磁珠（中科雷鳴，中國），旋渦震蕩1 min，室溫靜置3 min，其間顛倒混勻2或3次。將試管置于磁力架上分離磁珠，并吸取剩余溶液至新的EP管中以提取激素。

（3）從磁力架上取下EP管，向管中加入600 μLBuffer W1（AxyPrep，中國），輕輕搖勻30 s，將EP 管置于磁力架上進行磁力分離，吸棄廢液。

（4）從磁力架上取下EP管，向管中加入600 μLBuffer W2（AxyPrep，中國），輕輕搖勻30 s，將EP 管置于磁力架上進行磁力分離，吸棄廢液。重復(fù)步驟4。

（5）為徹底去除廢液，將EP管以2 000 r/min離心30 s，再次置于磁力架上進行磁力分離，吸棄廢液。室溫開蓋晾干5 ～ 10 min，至乙醇完全揮發(fā)。

（6）取下EP 管，加入100 μL 65 ℃ ddH2O，振蕩混勻，56 ℃水浴15 min，每隔2 ～ 3 min輕搖混勻10 s。將EP管從水浴鍋中取出，5 000 r/min離心1 min，置于磁力架上進行磁力分離，小心吸取上清（目的DNA溶液）至新的1. 5 mL EP管中，置于冰箱-20 ℃保存。

（7）使用固相提取（SPE）法對步驟（2）得到的溶液進行激素提?。?0?21］，并在鳥皮質(zhì)醇ELISA檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國）中定容。

1. 3 DH-CoEx 的可用性評估

1. 3. 1 可擴增mtDNA片段長度的評估

以綠孔雀和丹頂鶴mtDNA為模版，設(shè)計PCR引物用以擴增不同長度的目標(biāo)片段（表1）。擴增反應(yīng)在50 μL 體系中進行，包括2 × EasyTaq PCR Super?Mix（全式金生物技術(shù)有限公司，中國）25 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA 模板5 μL，ddH2O18 μL。使用9700 型PCR 擴增儀（GeneAmp，美國）擴增。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，按照對應(yīng)的退火溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。從每個擴增反應(yīng)中分別取4 μL擴增產(chǎn)物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳緩沖液為1 × TAE，95 V下電泳25 min。隨后，使用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen，中國）純化回收，并進行雙向Sanger測序，測序序列進行BLAST同源性比對。

1. 3. 2 mtDNA提取量的評估

采用Ngatia et al.［22］的方法，對DH-CoEx提取的79份羽翈樣本中的mtDNA進行定量分析。為保證擴增的準(zhǔn)確性和高效性，重組質(zhì)粒的構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制均使用4種鳥類的肌肉DNA。用于綠孔雀T-A克隆和qPCR的引物為G-2，擴增的mtDNA片段長度為293 bp；用于丹頂鶴、栗鹀和小鹀T-A 克隆和qPCR的引物為GJ-2，擴增的mtDNA 片段長度為201 bp。熒光定量PCR反應(yīng)在10. 0 μL體系中進行，包括1. 0 μL DNA 提取液，5. 0 μL TB Green PremixExTaqⅡ（TaKaRa，日本），上、下游引物各0. 4 μL及3. 2 μL去離子水。擴增程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 s，反應(yīng)用BTK-96實時熒光定量PCR分析儀（無錫百泰克生物技術(shù)有限公司）完成。通過計算每份樣本中mtDNA的拷貝數(shù)來評估DH-CoEx在不同鳥類羽翈中的提取效果。使用獨立樣本t 檢驗對不同新鮮度和不同體型鳥類的羽毛樣本進行顯著性差異分析，數(shù)據(jù)處理均在IBM SPSSStatistics 25軟件中進行。

1. 3. 3 微衛(wèi)星分型可靠性的評估

為驗證DH-CoEx 提取的羽翈DNA 在微衛(wèi)星擴增及分型中的可行性，對綠孔雀（GP-01 ～ GP-36）、丹頂鶴（DDH-01 ～ DDH-22）、栗鹀（LW-01 ～ LW-14）和小鹀（XW-01 ～ XW-07）共79份羽翈進行28個微衛(wèi)星分型，其中綠孔雀和丹頂鶴各11個，栗鹀和小鹀共6個。引物序列［23?25］、位點和退火溫度見表2。PCR 反應(yīng)在15. 0 μL 體系中進行，包括2 × RapidTaq Master Mix（北京全式金生物技術(shù)有限公司，中國）5. 0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0. 4 μL，DNA 模板（15 ng/μL）9. 0 μL，BSA 0. 2 μL。使用9700型PCR擴增儀（GeneAmp，美國）擴增。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，按照對應(yīng)的退火溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸10 min。擴增子經(jīng)2. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過ABI3130測序儀進行毛細(xì)管電泳分離，并用GeneMarker處理信號［26］，獲得基因型數(shù)據(jù)。通過軟件GIMLET估算上游等位基因擴增丟失（upperallele dropout）的比例，并使用獨立樣本t 檢驗對不同新鮮度和不同體型鳥類的羽毛樣本進行顯著性差異分析，數(shù)據(jù)處理均在IBM SPSS Statistics 25軟件中進行。

1. 3. 4 糖皮質(zhì)激素提取量的測定

在考慮實驗室條件和成本效益的基礎(chǔ)上，采用皮質(zhì)醇含量作為糖皮質(zhì)激素水平的代表。通過鳥類皮質(zhì)醇ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，中國），依照說明書步驟測定1. 2. 3節(jié)中提取的皮質(zhì)醇含量。檢測樣本包括GP-01 ～ GP-10、DDH-01 ～DDH-06、LW-01 ～ LW-14 和XW-01 ～ XW-07。為降低實驗誤差，每個樣本進行2 次重復(fù)，并計算平均值。使用獨立樣本t 檢驗對不同新鮮度和不同體型鳥類的羽毛樣本進行顯著性差異分析，數(shù)據(jù)處理均在IBM SPSS Statistics 25軟件中進行。實驗所用材料包括微孔酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品（S0 ～ S5質(zhì)量濃度依次為0、10、20、40、80、160 ng/mL）、樣本稀釋液、檢測抗體-HRP、20 × 洗滌緩沖液、底物A、底物B、終止液及封板膜等。

2 結(jié)果

2. 1 可擴增mtDNA 片段長度

以DH-CoEx 獲取的綠孔雀和丹頂鶴羽毛DNA進行不同長度的mtDNA片段的擴增實驗。結(jié)果顯示：綠孔雀樣本成功擴增出196、293、351、416 bp的片段；丹頂鶴樣本擴增出201 ～ 1 350 bp 長度的片段。在紫外線燈下，所有擴增產(chǎn)物均顯示出單一且明亮的條帶，并未因片段長度的增加而亮度降低（圖1）。擴增產(chǎn)物序列通過BLAST同源性比對，確認(rèn)了其正確性。

2. 2 4 種鳥類羽翈mtDNA 提取量的比較

選取丹頂鶴作為大型鳥類的代表，栗鹀和小鹀作為小型鳥類的代表，檢驗鳥類體型大小和羽毛新鮮程度對DH-CoEx提取效率的影響。熒光定量PCR分析表明（圖2A），從每5 mg丹頂鶴羽翈樣本（DDH-01 ～ DDH-22）中提取的mtDNA平均拷貝數(shù)為（3. 24 ×104 ± 4. 87 × 104），栗鹀（LW-01 ～ LW-14）和小鹀（XW-01 ～ XW-07）的平均拷貝數(shù)分別是（7. 49 × 104 ±7. 68 × 104）和（5. 86 × 104 ± 7. 20 × 104）。盡管大型鳥類的提取效果略低于小型鳥類，但t 檢驗未檢測到顯著差異（P = 0. 112）。

綠孔雀羽毛樣本脫落時間為3 ～ 4 a前，代表陳舊羽毛，丹頂鶴羽毛樣本則為近期脫落，代表新鮮羽毛。熒光定量PCR分析顯示，每5 mg綠孔雀羽毛樣本（GP-01 ～ GP-36）中，平均提取到mtDNA拷貝數(shù)為（3. 09 × 104 ± 5. 47 × 104）；每5 mg 丹頂鶴（DDH-01 ～ DDH-22）羽毛樣本中，平均提取到mtDNA拷貝數(shù)為（3. 24 × 104 ± 4. 87 × 104）。兩組數(shù)據(jù)之間無顯著差異（P = 0. 442，圖2B），表明羽毛的新鮮程度對DH-CoEx的DNA提取效果影響甚微。

2. 3 微衛(wèi)星分型

對4種鳥類79份羽毛樣本DNA進行28個微衛(wèi)星位點分型，其中綠孔雀11個，丹頂鶴11個，栗鹀和小鹀共6個。結(jié)果顯示：綠孔雀羽翈DNA（GP-01 ～GP-36）的分型成功率為（98. 23 ± 3. 65）%（90. 91% ～100. 00%）；丹頂鶴（DDH-01 ～ DDH-22）的分型成功率為（96. 69 ± 9. 11）%（63. 64% ～ 100. 00%）；栗鹀（LW-01 ～ LW-14）的分型成功率為（98. 81 ± 4. 46）%（83. 33% ～ 100. 00%）；小鹀（XW-01 ～ XW-07）的分型成功率為100. 00%。通過軟件GIMLET估算上游等位基因擴增丟失的比例，結(jié)果顯示4種鳥類均為0。將所有樣本的分型數(shù)據(jù)按照 lt; 150 bp、150 ～ lt;200 bp和 ≥ 200 bp進行分組，發(fā)現(xiàn)PCR擴增產(chǎn)物的長度對分型成功率具有顯著影響（表3）。當(dāng)片段長度 ≥ 200 bp時，分型成功率最低，為（97. 50 ± 2. 15）%；當(dāng)長度在150 ～ lt;200 bp 時，分型成功率提高到（98. 11 ± 2. 68）%；而當(dāng)長度 lt; 150 bp時，分型成功率達（99. 60 ± 0. 80）%。

為了評估鳥類體型對微衛(wèi)星分型的影響，以ABI3100遺傳分析儀上測得的等位基因信號的峰高為指標(biāo)，比較代表大型鳥類的丹頂鶴和代表小型鳥類的栗鹀、小鹀羽翈微衛(wèi)星分型結(jié)果。t 檢驗結(jié)果顯示，大型鳥類的信號峰顯著高于小型鳥類（P =0. 012，圖3A）。此外，對新鮮脫落的丹頂鶴羽翈樣本和脫落3 ～ 4 a的綠孔雀羽翈樣本的分型結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示，新鮮羽翈樣本的微衛(wèi)星等位基因信號峰高極顯著高于陳舊羽翈樣本（P lt; 0. 000 1，圖3B）。

2. 4 激素的提取量

采用鳥皮質(zhì)醇ELISA 檢測試劑盒測定與DNA共提取的皮質(zhì)醇的含量。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)，OD450 為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y = 99. 491x -3. 816（R2 = 0. 999 2），可以準(zhǔn)確地估算皮質(zhì)醇的含量。結(jié)果顯示：綠孔雀羽翈中提取的激素質(zhì)量濃度為34. 645 ～ 159. 506 ng/mL，丹頂鶴為74. 690 ～156. 272 ng/mL，栗鹀為41. 609 ～ 167. 216 ng/mL，小鹀為46. 584 ～ 157. 267 ng/mL。比較顯示，鳥類體型（P = 0. 617）和羽毛新鮮程度（P = 0. 896）對激素提取效果均無顯著影響（圖4）。

3 討論與結(jié)論

3. 1 DH-CoEx 的原理及創(chuàng)新

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為非損傷性材料的分析提供了更多途徑。本研究建立的DH-CoEx解決了在完全角化的羽毛中同時提取DNA和激素的問題，在獲取鳥類遺傳學(xué)和生理學(xué)信息的同時，大大降低了樣本損耗，減輕了野外鳥類研究的困難。

DH-CoEx的設(shè)計基于兩點：一是角化組織的充分裂解，實現(xiàn)DNA和激素的同時釋放。在這一過程中，使用Tris-NaCl-Ca2+緩沖液替代傳統(tǒng)的TNE緩沖液，Ca2+的引入提高了緩沖液的熱穩(wěn)定性和催化效率［27］；然而，Ca2+可能對后續(xù)PCR實驗產(chǎn)生影響，因此在消化結(jié)束后需加入EDTA來螯合掉其中的Ca2+；DH-CoEx 還增加了蛋白酶K 和DTT 用量，從消化一般組織的25 μL（25 mg/mL）和5 μL（1 mol/L）［28］分別提高了2. 4倍和3. 0倍，由此將消化時間縮短至3 ～ 4 h，一方面確保角蛋白的充分裂解，同時又最大限度地保持酶的活性。二是DNA和激素的提取互不影響。筆者首先向裂解液中加入了氯仿，把角蛋白變性，因為氯仿在水溶液中的溶解度極低，不會對目的產(chǎn)物的提取產(chǎn)生影響。因此，通過高速離心把蛋白組分去除，然后在水相中加入異丙醇，先對糖皮質(zhì)激素進行萃取，使之溶于異丙醇中［29］，同時可以促進DNA從溶液中析出［18］，為二者的進一步分離奠定基礎(chǔ)。當(dāng)向溶液中加入磁珠后，DNA即被高效地吸附到其表面，從而在磁場中順利地被分離出來，而糖皮質(zhì)激素因異丙醇的萃取作用被保留在剩余的溶液中，進而通過常規(guī)方法得到分離［20?21］。后續(xù)的DNA和激素檢測均驗證了這一策略的可行性。

羽毛中的DNA含量很低，在后續(xù)的PCR擴增中對外源性污染十分敏感［30］。羽毛是多級分支的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，包括羽軸雙側(cè)著生的羽枝、羽枝雙側(cè)著生的羽小枝、羽小枝上著生的纖刺、小鉤和腹齒等，且數(shù)量極多［31］，可附著大量微生物和外源性細(xì)胞等污染源。因此，在樣本的預(yù)處理階段，DH-CoEx 使用2% 的SDS溶液浸泡羽翈樣本30 min，利用其陰離子表面活性劑的特性，有效去除羽翈上附著的污染物。當(dāng)然也有其他羽毛清洗方法，如使用有機溶劑（如氯仿和甲醇混合溶液、氯仿及乙醚）、堿性溶液（如氫氧化鉀、氫氧化鈉）等［32?38］，筆者認(rèn)為2%的SDS溶液處理30 min雖然時間稍長，但清洗效果較為理想，且操作比較簡便。

3. 2 DH-CoEx 的實用性

在完全角化的材料中，mtDNA雖也受到嚴(yán)重降解，但其總拷貝數(shù)較多，因此采用PCR擴增和分析角化材料中的mtDNA 片段早已是輕而易舉的工作［1，39］。用DH-CoEx 從5 mg 羽翈中提取的總DNA中，mtDNA的拷貝數(shù)在104數(shù)量級，且并未受鳥類體型的影響（P = 0. 112，圖2A），以及脫落時間的明顯影響（P = 0. 442，圖2B）。綠孔雀的尾上覆羽為松散的羽枝，用DH-CoEx提取DNA可以擴增196 ～ 416 bp的片段。但筆者未對更長的片段進行嘗試，因此416 bp并不是其最長限度。丹頂鶴羽翈較為緊實，從中獲得的DNA可以擴增1 350 bp的mtDNA片段，這也只是測試的最長片段，而不是其最大限度。無論怎樣，DH-CoEx從完全角化的羽毛中提取的DNA既包括短片段，也包括長片段，可用于廣泛的mtDNA分析。

在羽毛的角化進程中，發(fā)生了大量的基因組降解［9］，從羽翈中獲得的nuDNA高度碎片化，且產(chǎn)量極低。因此，角化材料的核基因分析成為生態(tài)學(xué)研究的挑戰(zhàn)。使用DH-CoEx從松散型羽翈（綠孔雀尾上覆羽）、緊致型羽翈（丹頂鶴廓羽）和小型鳥（栗鹀和小鹀）的羽毛中提取DNA，均可用于微衛(wèi)星分型，但分型效果受3種因素影響：一是擴增片段的長度，當(dāng)長度lt; 150 bp時，成功率可達98. 41% ～ 100. 00%，當(dāng)擴增片段長度為150 ～ lt;200 bp 時，成功率為96. 21% ～ 100. 00%，當(dāng)擴增片段 ≥ 200 bp 時，則為95. 59% ～ 100. 00%（表3）；二是受羽毛類型的影響，大型鳥類的羽毛微衛(wèi)星信號峰高顯著高于小型鳥類（P = 0. 012，圖3A）；三是受羽毛新鮮程度的影響。新鮮羽毛樣本的成功率極顯著高于陳舊羽毛樣本（P lt; 0. 000 1，圖3B）。無論怎樣，在所有79份樣本的28個微衛(wèi)星位點分析中，均未檢測到等位基因擴增丟失，表明在200 bp以下的nuDNA擴增是完全可行的。在實踐中，如果采用DH-CoEx 提取DNA，選擇lt; 150 bp 的微衛(wèi)星標(biāo)記，羽翈的利用是完全可行的。

此外，DH-CoEx從羽翈中獲取的糖皮質(zhì)激素（皮質(zhì)醇）在綠孔雀、丹頂鶴、栗鹀和小鹀樣本中分別為20. 76 ～ 95. 70 ng/mg（34. 645 ～ 159. 506 ng/mL）、44. 82 ～ 93. 78 ng/mg（74. 690 ～ 156. 272 ng/mL）、24. 96 ～ 100. 32 ng/mg（41. 609 ～ 167. 216 ng/mL）和27. 96 ～ 94. 38 ng/mg（46. 584 ～ 157. 267 ng/mL），均顯著高于Koren et al.［40］采用自動固相萃取系統(tǒng)提取的水平（0. 004 4 ～ 0. 075 5 ng/mg）。這可能得益于本研究使用了大量的蛋白酶K和高濃度DTT，把角蛋白完全裂解，使激素得以充分釋放。同時，先行加入異丙醇進行萃取，也確保了在提取DNA的同時，使激素得到有效保留。筆者發(fā)現(xiàn)，鳥類體型大小、羽毛新鮮程度對激素提取無顯著影響（圖4），說明DHCoEx在羽毛激素研究中具有廣泛的適用性。

然而，受工作量限制，本研究僅采用少數(shù)物種、少數(shù)羽毛類型和脫落時間較短的羽毛，所做的各項檢測和比較也較為簡單，但也基本涵蓋不同大小、不同緊致程度和不同脫落時間等條件，特別是以覆羽和廓羽等野外最常見的羽毛類型為主要研究對象，具有較好的代表性。實測結(jié)果證明，DH-CoEx是一種簡潔高效的技術(shù)，能在角化材料中同時提取總DNA和糖皮質(zhì)激素，可為mtDNA、微衛(wèi)星等分子標(biāo)記分析以及應(yīng)激激素檢測提供支持，這一方法顯著提高了羽毛的研究和應(yīng)用價值。毛發(fā)、角、蹄、蛇蛻、龜甲、爪和鱗甲等其他角化材料在本研究中并未涉及，但其基本屬性與羽毛一致，也可成為DH-CoEx的潛在應(yīng)用對象。

參考文獻：

［1］ RUDNICK J A， KATZNER T E， BRAGIN E A， et al. Speciesidentification of birds through genetic analysis of naturally shedfeathers［ J］. Molecular Ecology Notes， 2007， 7（5）： 757-762.

［2］ GRIFFITHS R， TIWARI B. Sex of the last wild Spix’s macaw［J］. Nature， 1995， 375： 454.

［3］ RUDNICK J A， KATZNER T E， BRAGIN E A， et al. Using natu?rally shed feathers for individual identification， genetic parentageanalyses， and population monitoring in an endangered eastern im?perial eagle （Aquila heliaca） population from Kazakhstan ［J］.Molecular Ecology， 2005， 14（10）： 2959-2967.

［4］ RUDNICK J A， KATZNER T E， BRAGIN E A， et al. A noninvasivegenetic evaluation of population size， natal philopatry，and roosting behavior of non-breeding eastern imperial eagles （Aq?uila heliaca） in central Asia［ J］. Conservation Genetics， 2008， 9（3）： 667-676.

［5］ SEGELBACHER G， H?GLUND J， STORCH I. From connectiv?ity to isolation： genetic consequences of population fragmentationin capercaillie across Europe ［J］. Molecular Ecology， 2003， 12（7）： 1773-1780.

［6］ DE VOLO S B. Genetic studies of northern goshawks （Accipitergentilis）： genetic tagging and individual identification from feath?ers， and determining phylogeography， gene flow and populationhistory for goshawks in north America［D］. Colorado： ColoradoState University， 2008.

［7］ SEKI S I. Application of molted feathers as noninvasive samplesto studies on the genetic structure of pigeons （Aves： Columbidae）［J］. Journal of Forest Research， 2006， 11（2）： 125-129.

［8］ CHEN C F， FOLEY J， TANG P C， et al. Development， regenera?tion， and evolution of feathers ［J］. Annual Review of Animal Bio?sciences， 2015， 3： 169-195.

［9］ OLSEN M E， BENGTSSON C F， BERTELSEN M F， et al. DNAfrom keratinous tissue： part Ⅱ： feather ［J］. Annals of Anatomy，2012， 194（1）： 31-35.

［10］ WHITAKER J P， COTTON E A， GILL P. A comparison of thecharacteristics of profiles produced with the AMPFlSTR? SGMPlusTM multiplex system for both standard and low copy number（LCN） STR DNA analysis［J］. Forensic Science International，2001， 123（2/3）： 215-223.

［11］ 凃政， 陳松， 李萬水， 等. 脫落毛發(fā)及毛干DNA的STR分型研究［ J］. 刑事技術(shù)， 2011（5）： 3-7.

TU Z， CHEN S， LI W S， et al. STR genotyping of tolegen hairsand hair shafts ［J］. Forensic Science and Technology， 2011（5）： 3-7.

［12］ 鄧建強， 劉寶琴， 蔡繼峰， 等. 兩種全基因組擴增技術(shù)對單根毛發(fā)DNA檢驗效能的研究 ［J］. 中國熱帶醫(yī)學(xué)， 2012， 12（4）： 389-392.

DENG J Q， LIU B Q， CAI J F， et al. The value of two whole ge?nome amplification protocols for single shed hair genotyping ［J］.China Tropical Medicine， 2012， 12（4）： 389-392.

［13］ 陳松， 胡蘭. 低拷貝模板STR分型及其存在的問題［ J］. 中國法醫(yī)學(xué)雜志， 2003， 18（5）： 314-316.

CHEN S， HU L. STR typing of low copy template and its exist?ing problems ［J］. Chinese Journal of Forensic Medicine， 2003，18（5）： 314-316.

［14］ DAVENPORT M D， TIEFENBACHER S， LUTZ C K， et al.Analysis of endogenous cortisol concentrations in the hair of rhe?sus macaques ［J］. General and Comparative Endocrinology，2006， 147（3）： 255-261.

［15］ HENDERSON G L. Mechanisms of drug incorporation into hair［J］. Forensic Science International， 1993， 63（1/2/3）： 19-29.

［16］ KOREN L， MOKADY O， KARASKOV T， et al. A novelmethod using hair for determining hormonal levels in wildlife［J］. Animal Behaviour， 2002， 63（2）： 403-406.

［17］ FREEMAN N E， NEWMAN A E M. Quantifying corticosteronein feathers： validations for an emerging technique［ J］. Conserva?tion Physiology， 2018， 6（1）： coy051.

［18］ WAGNER A， SILVA-SANTOS A R， ROSA S S， et al. Primarypurification of plasmid DNA using differential isopropanol pre?cipitation ［J］. Methods in Molecular Biology， 2021， 2197：151-165.

［19］ 鄭作新. 中國鳥類系統(tǒng)檢索［ M］. 3版. 北京： 科學(xué)出版社，2002.

ZHENG Z X. Systematic retrieval of birds in China ［M］. 3rded. Beijing： Science Press， 2002.

［20］ 孫利東， 許秀麗， 袁飛， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶和雞肉中4 種激素本底值 ［J］. 食品科學(xué)， 2017， 38（22）： 291-297.

SUN L D， XU X L， YUAN F， et al. High performance liquidchromatography-tandem mass spectrometry method for simultane?ous determination of background values of 4 hormones in milkand chicken［ J］. Food Science， 2017， 38（22）： 291-297.

［21］ 張再永， 馬俊美， 李強， 等. 通過式固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定豬肉和牛肉中9種類固醇激素［J］. 肉類研究， 2020， 34（7）： 58-63.

ZHANG Z Y， MA J M， LI Q， et al. Determination of 9 steroidhormones in pork and beef samples by filtration solid phaseextraction-ultra performance liquid chromatography-tandem massspectrometry［J］. Meat Research， 2020， 34（7）： 58-63.

［22］ NGATIA J N， LAN T M， MA Y， et al. Distinguishing extant el?ephants ivory from mammoth ivory using a short sequence of cyto?chrome b gene［ J］. Scientific Reports， 2019， 9： 18863.

［23］ 樊翠平. 中國圈養(yǎng)白頭鶴及丹頂鶴種群遺傳多樣性分析［D］. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2017.

FAN C P. Genetic diversity of the hooded crane and the redcrownedcrane in China in captivity［D］. Harbin： Northeast For?estry University， 2017.

［24］ 杜焓瑜. 綠孔雀種質(zhì)純度鑒定技術(shù)研究及圈養(yǎng)種群遺傳多樣性分析［D］. 哈爾濱： 東北林業(yè)大學(xué)， 2020.

DU H Y. A study of genetic purity inference of green peafowland an analysis of genetic diversity of captive population［D］.Harbin： Northeast Forestry University， 2020.

［25］ 樊亞楠. 黑頂麻雀婚外配行為及其發(fā)生機制［D］. 蘭州： 蘭州大學(xué)， 2017.

FAN Y N. Extra-pair copulation behavior and mechanism in thesaxaul sparrow（Passer ammodendri）［D］. Lanzhou： LanzhouUniversity， 2017.

［26］ LIU C S J， HULCE D， LI X， et al. GeneMarker? genotypingsoftware： tools to increase the statistical power of DNA fragmentanalysis ［J］. Journal of Biomolecular Techniques， 2011， 22（Suppl. 1）： S35-S36.

［27］ ABEDI E， TORABIZADEH H， ORDEN L. Enhancement ofalpha-amylase’s stability and catalytic efficiency after modifyingenzyme structure using calcium and ultrasound ［J］. Food andBioprocess Technology， 2024， 17（6）： 1546-1562.

［28］ DE VOLO S B， REYNOLDS R T， DOUGLAS M R， et al. Animproved extraction method to increase DNA yield from moltedfeathers［ J］. The Condor， 2008， 110（4）： 762-766.

［29］ GHOLIB， NUGRAHA T P， AGIL M， et al. Faecal glucocorti?coid measurement as indicator stress in wild crested macaques（Macaca nigra）： the importance of validation and sample pro?cessing techniques［C］//HASAN B， ANTHONY K， SHABRI AM M， et al. The 4th annual international conference Syiah KualaUniversity （AIC-Unsyiah） 2014 in conjunction with the 9th an?nual international workshop and expo on sumatra tsunami disas?ter and recovery （AIWEST-DR）， proceedings： social science.Banda Aceh： Syiah Kuala University， 2014： 167-172.

［30］ VAN OORSCHOT R A， BALLANTYNE K N， MITCHELL R J.Forensic trace DNA： a review ［J］. Investigative Genetics，2010， 1（1）： 14.

［31］ 胡詩佳， 王利利， 彭建軍. 鳥羽顯微鑒定技術(shù)及應(yīng)用的研究及展望［J］. 四川動物， 2008， 27（4）： 699-702.

HU S J， WANG L L， PENG J J. Progress in microscopical iden?tification of bird feather［J］. Sichuan Journal of Zoology， 2008，27（4）： 699-702.

［32］ HOBSON K A， BAIRLEIN F. Isotopic fractionation and turn?over in captive garden warblers （Sylvia borin）： implications fordelineating dietary and migratory associations in wild passerines［J］. Canadian Journal of Zoology， 2003， 81（9）： 1630-1635.

［33］ CHEREL Y， HOBSON K A， BAILLEUL F， et al. Nutrition，physiology， and stable isotopes： new information from fastingand molting penguins ［J］. Ecology， 2005， 86（11）： 2881-2888.

［34］ NORRIS D R， MARRA P P， KYSER T K， et al. Tracking habi?tat use of a long-distance migratory bird， the American redstartSetophaga ruticilla， using stable-carbon isotopes in cellularblood［ J］. Journal of Avian Biology， 2005， 36（2）： 164-170.

［35］ WUNDER M B， KESTER C L， KNOPF F L， et al. A test of geo?graphic assignment using isotope tracers in feathers of known ori?gin［ J］. Oecologia， 2005， 144（4）： 607-617.

［36］ HOBSON K A， ALISAUSKAS R T， CLARK R G. Stablenitrogenisotope enrichment in avian tissues due to fasting and nu?tritional stress： implications for isotopic analyses of diet［J］. TheCondor， 1993， 95（2）： 388-394.

［37］ NATSUMEDA T， SAKANO H， TSURUTA T， et al. Immigra?tion of the common cormorant Phalacrocorax carbo hanedae intoinland areas of the northern part of Nagano Prefecture， easternJapan， inferred from stable isotopes of carbon， nitrogen and sul?phur［ J］. Fisheries Science， 2015， 81（1）： 131-137.

［38］ BEARHOP S， WALDRON S， VOTIER S C， et al. Factors thatinfluence assimilation rates and fractionation of nitrogen and car?bon stable isotopes in avian blood and feathers ［J］. Physiologi?cal and Biochemical Zoology， 2002， 75（5）： 451-458.

［39］ SPELLER C F， NICHOLAS G P， YANG D Y. Feather barbs asa good source of mtDNA for bird species identification in forensicwildlife investigations［ J］. Investigative Genetics， 2011， 2： 16.

［40］ KOREN L， NAKAGAWA S， BURKE T， et al. Non-breedingfeather concentrations of testosterone， corticosterone and cortisolare associated with subsequent survival in wild house sparrows［J］. Proceedings of the Royal Society B， 2012， 279（1733）：1560-1566.

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（2572020DY02）