摘要：本文篩選鑒定了梨星毛蟲蛻皮激素相關(guān)基因USP，分析了其在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果表明，USP基因核苷酸長609 bp，氨基酸長度為203 aa，蛋白質(zhì)相對分子量23.198 kD，等電點為7.83，蛋白質(zhì)二三級結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成。USP基因的表達(dá)具有組織特異性，在消化道表達(dá)最高；USP基因在梨星毛蟲各生長發(fā)育階段中除1齡幼蟲外均有不同程度的表達(dá)，USP在3齡幼蟲高表達(dá)且與其他發(fā)育階段差異顯著。研究結(jié)果為進(jìn)一步探究USP在參與調(diào)控梨星毛蟲生長發(fā)育中的機制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：梨星毛蟲；USP；生物信息學(xué)；表達(dá)模式

中圖分類號：S433.4 文獻(xiàn)識別碼：A 文獻(xiàn)編號：1005-6114（2024）06-012-04

昆蟲生長發(fā)育調(diào)控基因參與代謝、蛻皮和生殖等過程，在細(xì)胞間信號傳遞和激素調(diào)控等生命活動中起重要作用［1，2］。昆蟲蛻皮激素（ecdysone，20E）在昆蟲生長發(fā)育中起到重要的調(diào)控作用，其相關(guān)基因是典型的調(diào)控基因［3］。USP基因編碼的超氣門蛋白（Ultraspiracle，USP）能與保幼激素（Juvenile Hormone，JH）和20E結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)多個下游基因表達(dá)，影響昆蟲幼蟲期和蛹期影響昆蟲蛻皮和發(fā)育［4-6］。隨轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)步，在家蠶Bombyx mori、果蠅Drosophilid spp.等模式昆蟲的基因庫被完善的基礎(chǔ)上，多種昆蟲的生長發(fā)育調(diào)控基因被逐步鑒定出，進(jìn)一步挖掘這些基因的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特性，有助于深入理解昆蟲生長發(fā)育調(diào)控機制［7］。

梨星毛蟲Illiberis pruni隸屬鱗翅目斑蛾科，是我國北方常見的食葉類害蟲，以幼蟲階段危害梨、海棠、蘋果等薔薇科果樹［8-10］。該蟲幼蟲齡期劃分在5～7齡間，不同地區(qū)的生活史表明該蟲一年發(fā)生一代，各階段發(fā)生整齊［11］。成蟲于夏季產(chǎn)卵，2～4齡幼蟲在10月越冬，越冬代幼蟲具有食量大、體積增長快、活動能力強的特點［12］。其幼蟲階段的卷葉取食習(xí)性除直接危害寄主外，也能影響光合效率使樹勢衰弱，間接導(dǎo)致果品減產(chǎn)［13］。一直以來，多地都有梨星毛蟲相關(guān)報導(dǎo)，但該蟲在不同地區(qū)發(fā)生規(guī)律有較大差異，其蛻皮次數(shù)在不同地區(qū)亦有較大差別，反映出該蟲對外界環(huán)境較強的適應(yīng)性和生長發(fā)育機制的特殊性［14］。生長發(fā)育調(diào)控基因的鑒定和表達(dá)對于揭示昆蟲生長發(fā)育過程中的分子機制具有重要的意義。為此，本研究擬對梨星毛蟲超氣門蛋白基因USP鑒定的基礎(chǔ)上，分析其在幼蟲不同組織（頭部、體壁、消化道、脂肪體）和不同生長發(fā)育階段（卵、1～7齡幼蟲、蛹、雌雄成蟲）的表達(dá)水平，以期為進(jìn)一步研究梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因的功能提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

梨星毛蟲5、6齡幼蟲于2023年5-6月采集自青海省西寧市（36°65′05″ N，101°69′93″ E，海拔2 261 m），采回后將部分樣品在養(yǎng)蟲籠用水培梨樹枝條飼養(yǎng)至化蛹，將蛹單獨隔離至離心管中羽化，之后對成蟲性別進(jìn)行鑒定，并挑取部分雌雄成蟲在養(yǎng)蟲盒內(nèi)（10×15 cm）兩兩配對，將新鮮梨樹葉片葉背向上置于盒底部，在養(yǎng)蟲盒內(nèi)壁滴加蜂蜜水用作飼養(yǎng)成蟲，在成蟲交配后收集葉片得到卵塊，將之置于培養(yǎng)皿中定期噴水保持濕度直至孵化，在上述步驟中收集7齡幼蟲、蛹、成蟲、卵和1齡幼蟲樣品。2、3、4齡幼蟲于7-9月采自原室外發(fā)生地。觀察發(fā)現(xiàn)梨星毛蟲6齡幼蟲期間食量大且體型增長明顯，因此選定6齡幼蟲作為組織表達(dá)對象。解剖梨星毛蟲6齡幼蟲將之分為頭部、體壁、腸道和脂肪體4個部位的組織。同時收集梨星毛蟲不同發(fā)育階段樣品（卵、1～7齡的幼蟲、蛹、雌雄成蟲），每種樣品準(zhǔn)備3組生物學(xué)重復(fù)，收集后用液氮速凍分裝，之后立即置于-80℃冰箱中冷凍保存以保證樣品質(zhì)量。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

本研究根據(jù)Solarbio法操作得到梨星毛蟲卵、1～7齡幼蟲、蛹、雌雄成蟲和6齡幼蟲頭部、體壁、脂肪體、消化道的總RNA。使用超微量分光光度計檢測RNA純度，OD260/OD280值在1.8～2.2之間（OD260/OD280值的范圍在1.8～2.2之間時，表示提取的RNA純度良好）。為評估RNA的完整性和是否存在DNA污染，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾德萊，北京）進(jìn)行cDNA的第一鏈合成。將處理好的RNA樣品置于-80℃冰箱中保存，將cDNA樣品封裝后保存在-20℃的冰箱中。

1.3 引物設(shè)計與合成

從梨星毛蟲轉(zhuǎn)錄組基因序列庫中篩選獲得USP序列，內(nèi)參基因（RPS11）由青海大學(xué)昆蟲實驗室篩選獲取，引物序列通過Oligo7軟件設(shè)計并委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.4 梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因的基因序列獲取

基于幼蟲、蛹和成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以基因縮寫USP，ecdysone，ultraspiracle，20E，ECR，為關(guān)鍵詞在Unigenes數(shù)據(jù)庫中篩選出調(diào)控生長發(fā)育相關(guān)注釋的基因序列號。通過序列號在總庫獲取其核苷酸序列，將所有篩選出的核苷酸序列通過BLASTn比對在NCBI數(shù)據(jù)庫中確定候選序列。使用在線平臺ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測出USP的開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF），將USP的完整核苷酸和氨基酸序列，通過BLASTp進(jìn)一步驗證預(yù)測ORF氨基酸序列的準(zhǔn)確性，設(shè)定相似性大于70%的閾值，最終確定生長發(fā)育調(diào)控基因的氨基酸序列。

1.5 梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因的生物信息學(xué)分析

利用ExPASy-ProtParam tool（http：//web.expasy.org/protparam/）軟件對USP基因的氨基酸序列組成進(jìn)行預(yù)測、同時對其理性化性質(zhì)進(jìn)行分析。通過Signalp5.0（http：//cbs.dtu.dk/services/Signalp/）預(yù)測其信號肽。采用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa%20_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級預(yù)測；利用SWISS MODEL（https：//www.Swiss model.expasy.org/）對蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.6 梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因的RT-qPCR檢測

用梨星毛蟲不同組織和不同發(fā)育階段蟲體獲得的cDNA樣品作為模板進(jìn)行實驗。每組生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。本實驗使用ABI 7500型實時熒光定量PCR儀進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。實驗擴增體系與反應(yīng)條件參照南彥斌等人研究［15］。

1.7 統(tǒng)計分析

用2-ΔΔCt值法計算梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因在不同組織和不同發(fā)育階段中的相對表達(dá)量。使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析（ANOVA）來比較生長發(fā)育調(diào)控基因在不同組織和不同發(fā)育階段的表達(dá)量差異。用Graphpad prism10.0軟件繪制基因的組織表達(dá)譜和齡期表達(dá)譜，同時利用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物信息學(xué)分析

在梨星毛蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（幼蟲、蛹、成蟲）中篩選出5個生長發(fā)育調(diào)控基因，通過ORF finder獲取氨基酸序列并通過NCBI BLASTp驗證，核苷酸長度為609 bp，氨基酸長203 aa。利用TransDecoder軟件預(yù)測出USP的編碼區(qū)序列具有完整性。利用在線網(wǎng)站SignaIP5.0預(yù)測確定USP無信號肽。通過BLASTn驗證發(fā)現(xiàn)，USP基因與草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda USP序列相似度為91.74%。

2.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

通過ExPASy-ProtParam tool對USP基因的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果表明，USP基因氨基酸長度為203 aa，相對分子量23.198 kD，理論等電點是7.83，屬于弱堿性蛋白；蛋白質(zhì)帶正電荷和負(fù)電荷殘基數(shù)目基本相同，氨基酸不穩(wěn)定系數(shù)高于40，表明其性質(zhì)不穩(wěn)定。從脂肪系數(shù)可以看出USP基因的蛋白具有熱穩(wěn)定性?？偲骄杷远冀橛?0.5～0.5之間。因此，判定為兩性蛋白質(zhì)。

2.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA在線網(wǎng)站和SWISS MODEL網(wǎng)站同源建模預(yù)測USP基因的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無規(guī)則卷曲是二級結(jié)構(gòu)主要構(gòu)成部分，比例為42.86%，其次是α螺旋，占比38.74%，延伸鏈則為14.72%，β折疊含量較低為3.68%。USP基因的蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)顯示α螺旋均勻分布在蛋白質(zhì)各個位置，無規(guī)則卷曲環(huán)繞在蛋白周圍（圖1）。

2.4 組織表達(dá)與齡期表達(dá)分析

以6齡幼蟲頭部作為陽性對照，測定發(fā)現(xiàn)USP基因在梨星毛蟲6齡幼蟲不同組織（頭部、脂肪體、體壁和消化道）的相對表達(dá)水平不同（圖2，A）。USP在頭部、脂肪體、體壁和消化道上均有表達(dá)，且體現(xiàn)不同的表達(dá)水平。USP在消化道的相對表達(dá)量最高，表達(dá)水平與頭部、體壁差異顯著（P＜0.05）。

通過RT-qPCR測定USP在梨星毛蟲卵、1～7齡幼蟲、蛹、雌雄成蟲的相對表達(dá)水平，以雌成蟲作為陽性對照（圖2，B）。結(jié)果表明，USP表達(dá)水平在整個發(fā)育階段中差異明顯。USP在3齡幼蟲階段相對表達(dá)量最高與其他發(fā)育階段表達(dá)水平差異顯著（P＜0.05），其他階段相對表達(dá)量均低，在1、2齡幼蟲和蛹期幾乎不表達(dá)。

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物信息學(xué)方法對梨星毛蟲生長發(fā)育調(diào)控基因USP進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)USP基因的蛋白無信號肽，與白背飛虱Sogatella furcifera的USP預(yù)測結(jié)果一致［16］。結(jié)合蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)USP基因的蛋白含有大量無規(guī)則卷曲，表明其部分結(jié)構(gòu)容易改變，不穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)利于識別反應(yīng)底物，推測該蛋白可能有適應(yīng)結(jié)合配體和參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，具體機制有待于進(jìn)一步探究［17］。

時空表達(dá)譜分析結(jié)果表明，USP在梨星毛蟲幼蟲不同組織上均有表達(dá)且呈現(xiàn)不同表達(dá)水平。USP在消化道中相對表達(dá)量與其他組織呈顯著差異，這一結(jié)果與云杉芽卷蛾Choristoneura fumiferana USP基因組織表達(dá)結(jié)果相同；在消化道高表達(dá)說明USP基因可能參與到消化器官和分泌器官中多種生理過程，推測USP基因在能量代謝過程中具有重要作用［18］。USP在梨星毛蟲不同發(fā)育階段（卵、1-7齡幼蟲、蛹、雌雄成蟲）呈現(xiàn)不同表達(dá)水平，USP在3齡階段幼蟲中的表達(dá)水平均表現(xiàn)出上調(diào)趨勢，結(jié)合前人研究發(fā)現(xiàn)此階段為越冬前期，推測該基因參與了幼蟲越冬前能量代謝［19］。梨星毛蟲在6齡幼蟲階段大量取食葉片能為化蛹提供營養(yǎng)物質(zhì)積累，USP在這一階段顯著表達(dá)可能與化蛹前代謝活動有關(guān)［19］。此外，USP在梨星毛蟲雌雄成蟲中相對表達(dá)量有差異，推測USP基因?qū)Υ菩坌詣e的發(fā)育起不同作用［20］。

本研究從梨星毛蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出蛻皮激素受體蛋白USP基因，通過一系列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)USP基因的基本特性與同族基因相似，表達(dá)譜分析顯示USP基因的時空表達(dá)模式具有特異性。以上結(jié)果為進(jìn)一步揭示梨星毛蟲生長發(fā)育分子調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

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