〔摘要〕 目的 探討銀屑平丸含藥血清通過調控NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）/胱天蛋白酶-1（cysteine aspartate-specific proteinase-1，Caspase-1）信號通路改善腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）誘導的人表皮角質形成細胞焦亡的作用機制。方法 制備銀屑平丸含藥血清、阿維A含藥血清及空白血清，采用CCK-8試劑檢測空白血清對人表皮角質形成細胞存活率的影響；體外常規(guī)培養(yǎng)人表皮角質形成細胞，使用TNF-α誘導人表皮角質形成細胞建立體外銀屑病損傷模型，設置正常組、模型組、空白血清組、銀屑平丸含藥血清組、阿維A含藥血清組；ELISA 法檢測各組細胞上清液中白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）水平；RT-PCR檢測各組細胞NLRP3，功能蛋白D（gasdermin D，GSDMD）、Caspase-1 mRNA表達；Western blot 法檢測各組細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白的表達。結果 與正常組比較，空白血清干預后細胞存活率無明顯改變。與正常組比較，模型組和空白血清組細胞上清中IL-1β、IL-18水平顯著升高（P＜0.01），且NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，銀屑平丸含藥血清組及阿維A含藥血清組細胞上清IL-1β、IL-18蛋白及mRNA水平明顯下降（P＜0.01），NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表達顯著下降（P＜0.01）。結論 銀屑平丸含藥血清可下調TNF-α誘導的人表皮角質形成細胞NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白及mRNA表達，降低炎癥因子表達水平，其作用機制可能與調控 NLRP3/Caspase-1通路有關。

〔關鍵詞〕 銀屑?。汇y屑平丸含藥血清；NLRP3/Caspase-1通路；人表皮角質形成細胞；細胞焦亡

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.010

Effects of serum containing Yinxieping Pill on TNF-α-induced pyroptosis of human epidermal keratinocytes based on the NLRP3/Caspase-1 pathway

SHEN Lele， Chen Bangdi， XI Jianyuan*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the mechanism of action of serum containing Yinxieping Pill （SCYXPP） in improving pyroptosis of human epidermal keratinocytes induced by tumor necrosis factor-α （TNF-α） through regulating the NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 （NLRP3）/cysteine aspartate-specific proteinase-1 （Caspase-1） signaling pathway. Methods SCYXPP， serum containing Acitretin （SCA）， and blank serum were prepared. CCK-8 reagent was used to detect the effect of blank serum on cell viability of the human epidermal keratinocytes. Human epidermal keratinocytes were cultured in vitro under conventional conditions and TNF-α was applied to them to establish an in vitro psoriasis injury model. Then normal， model， blank serum， SCYXPP， and SCA groups were set up. The levels of interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-18 （IL-18） in the cell supernatant of each group were determined by ELISA， the mRNA expressions of NLRP3， gasdermin D （GSDMD）， and Caspase-1 in the cells of each group were examined by RT-PCR， and the protein expressions of NLRP3， GSDMD， and Caspase-1 were checked by Western blot. Results Compared with the normal group， there was no significant change in cell viability in the blank serum group. Compared with the normal group， the levels of IL-1β and IL-18 in the cell supernatant of the model and blank serum groups were significantly elevated （P<0.01）， and the mRNA and protein expressions of NLRP3， GSDMD， and Caspase-1 were significantly higher （P<0.05）. Compared with the model group， the IL-1β and IL-18 levels in the cellular supernatant of SCYXPP and SCA groups significantly decreased （P<0.01）， and the mRNA and protein expressions of NLRP3， GSDMD， and Caspase-1 were significantly reduced （P<0.01）. Conclusion SCYXPP can down-regulate the mRNA and protein expressions of NLRP3， GSDMD， and Caspase-1 in human epidermal keratinocytes induced by TNF-α， and reduce the expression levels of inflammatory factors. Its mechanism of action may be related to the regulation of the NLRP3/Caspase-1 pathway.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 psoriasis; serum containing Yinxieping Pill; NLRP3/Caspase-1 pathway; human epidermal keratinocytes; pyroptosis

銀屑病具有自身免疫性致病特征和高度免疫介導的遺傳易感性，是一種炎癥性皮膚病[1]，主要表現(xiàn)為具有銀白色鱗屑的紅斑斑塊，多位于頭皮、肘部和膝關節(jié)。銀屑病患病率在不同人群中差異很大，亞洲成人銀屑病患病率約0.4%，美國成年人的銀屑病患病率為3.2%[2]，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[3]。目前認為，銀屑病是由遺傳和環(huán)境因素誘導的免疫異常[4]，涉及角質形成細胞及各種免疫細胞，如T細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、髓系樹突狀細胞、中性粒細胞和巨噬細胞等，共同形成炎癥回路，促進銀屑病的發(fā)病和發(fā)展[5]。隨著對銀屑病發(fā)病機制的深入研究，越來越多的證據(jù)表明，細胞焦亡在銀屑病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[6-7]。

細胞焦亡是一種新型的炎癥依賴性程序性細胞死亡，包括經典的胱天蛋白酶-1（cysteine aspartate-specific proteinase-1，Caspase-1）通路和非經典的胱天蛋白酶-4/5/11（cysteine aspartate-specific proteinase-4/5/11，Caspase-4/5/11）通路[8-9]。焦亡作為一種重要的促炎機制，與癌癥、感染性疾病、自身免疫性疾病和心血管疾病密切相關，已被廣泛研究[10]。然而，細胞焦亡在銀屑病發(fā)展中的作用尚未闡明。

銀屑平丸是在國醫(yī)大師指導下確立的有效治療銀屑病的自制藥，以《醫(yī)宗金鑒》犀角地黃湯為基礎方化裁而成，由生地黃、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、赤芍、牡丹皮、丹參、紫草、女貞子、旱蓮草、山藥、白鮮皮和甘草組成。研究表明，銀屑平丸含有的有效成分可通過抗炎、免疫調節(jié)、改善微循環(huán)、促進皮膚再生等機制共同發(fā)揮作用[11-13]。其中，生地黃、半枝蓮、女貞子等藥物的有效成分與細胞焦亡過程密切相關[14-15]。課題組前期研究表明，銀屑平丸可提高尋常型銀屑病療效，復發(fā)率低，安全性高[16]。進一步的動物實驗表明，銀屑平丸可降低白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）[17]表達緩解咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損。細胞實驗證實，銀屑平丸含藥血清可抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）誘導的人表皮角質形成細胞增殖，降低TNF-α、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）及人表皮角質形成細胞相關蛋白表達[18]，但其對人表皮角質形成細胞焦亡的影響尚不清楚。本研究采用細胞培養(yǎng)的方法，建立TNF-α誘導的銀屑病細胞損傷模型，從NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）Caspase-1信號通路細胞焦亡角度探討銀屑平丸含藥血清對人表皮角質形成細胞白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-18水平及NLRP3、功能蛋白D（gasdermin D，GSDMD）、Caspase-1蛋白和mRNA的影響，探討銀屑平丸治療銀屑病的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級SD 雄性大鼠30只，體質量（200±10） g，8周齡，購自湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，動物質量合格證號：430727221101231185，動物生產許可證號：SYXK（湘）2019-0004，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)于19～24 ℃，40%～70%濕度的環(huán)境，自由飲水及進食。本實驗通過湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心倫理審查，動物實驗倫理合格批號：LLBH-202204190005。

1.2&nbsp; 細胞

人表皮角質形成細胞細胞系，貨號：BNCC340593，購自長沙市益湘生物科技有限公司。

1.3 主要藥物

銀屑平丸：湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院研制，生產批號：20191129；組成：生地黃、赤芍、淮山藥、女貞子、旱蓮草、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、甘草。60 g/瓶。

阿維A膠囊：購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，生產批號：H20010126，重慶華邦制藥有限公司生產。

1.4 主要試劑

MEM液體培養(yǎng)基（BL307A，蘭杰柯科技有限公司）；胎牛血清（FSP025，依科賽生物科技有限公司）；胰蛋白酶－EDTA消化液（0.25%）含酚紅（PB180226，武漢普諾賽生命科技有限公司）；TNF-α因子（C008，蘇州近岸蛋白質科技股份有限公司）；IL-1β、IL-18 ELISA試劑盒（2208H040，2208H042，江蘇菲亞生物科技有限公司）；mRNA逆轉錄試劑盒（CW2569，江蘇康為世紀生物科技股份有限公司）；核酸染料（PB11141，北京普利萊基因技術有限公司）；Caspase-1、NLRP3、β-actin抗體（貨號分別為22915-1-AP、19771-1-AP、66009-1-Ig，武漢三鷹生物技術有限公司）；GSDMD（ab219800，美國Abcam公司）；Goat anti-Rabbit IgG （H+L） Secondary Antibody， HRP（AWS0002，長沙艾碧維生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備

30只SD大鼠，隨機分為空白組、銀屑平丸組、阿維A組，每組10只，適應性喂養(yǎng)7 d。按照70 kg人與200 g大鼠體表面積[19]進行換算，銀屑平丸組按照3.82 g/（kg·d）灌胃給藥，阿維A組按照2.54 mg/（kg·d）灌胃給藥，空白組予以等劑量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃1 h后，以2%戊巴比妥鈉2.5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，收集于真空采血管，室溫靜置2 h，3 000 r/min（離心半徑8 cm）離心10 min，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 空白血清毒性檢測

制備細胞懸液，在96孔板中接種人表皮角質形成細胞，密度為5 000個/孔，移至培養(yǎng)箱過夜使細胞貼壁，分別給予5%、10%、20%濃度的空白血清，于24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液于培養(yǎng)箱避光孵育1 h，酶標儀檢測450 nm波長處每孔的吸光度。細胞存活率（%）=[（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）]×100%。

2.3 細胞培養(yǎng)及分組

取人表皮角質形成細胞，棄上清液，PBS清洗，加入2 mL 0.25%胰酶消化，于鏡下觀察，待變圓剛有脫落時留約0.5 mL胰酶移至培養(yǎng)箱消化，約3.5 min取出，用完全培養(yǎng)基（MEM+10%FBS+1%青-鏈霉素）終止消化，重懸細胞，將細胞懸液按比例分配至T25培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設置正常組（培養(yǎng)液含10%FBS+1%雙抗）、空白血清組（培養(yǎng)液含20%空白血清+1%雙抗）、模型組（培養(yǎng)液含10 ng/mL TNF-α+20%空白血清+1%雙抗）、銀屑平丸含藥血清組（培養(yǎng)液含10 ng/mL TNF-α+20%銀屑平丸含藥血清+1%雙抗）、阿維A含藥血清組（培養(yǎng)液含10 ng/mL TNF-α+20%阿維A含藥血清+1%雙抗）。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

2.4 ELISA法檢測細胞上清液中IL-1β及IL-18 水平

將各組細胞培養(yǎng)24 h后，收集細胞上清液，按照試劑盒步驟檢測各組IL-1β及IL-18水平。

2.5 RT-PCR法檢測NLRP3、GSDMD、Caspase-1 mRNA表達

將各組細胞培養(yǎng)24 h后，棄細胞上清液，按試劑盒說明書提取細胞總RNA以組織總mRNA為模板，進行逆轉錄，擴增。PCR引物序列見表1，引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

2.6 Western blot法檢測NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白的表達

取人表皮角質形成細胞，提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，取120 uL蛋白上清，加入30 μL 5×loading buffer混勻，沸水煮5 min，放入冰盒中速冷備用。10%SDS-PAGE電泳分離蛋白質，PVDF轉膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗（GSDMD、Caspase-1、NLRP3、β-actin稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶10 000）孵育，4 ℃過夜，HRP標記的二抗室溫孵育90 min，凝膠成像系統(tǒng)成像。

2.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用“ｘ±s”表示。實驗數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性，兩組之間采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1?; 空白血清對TNF-α誘導的人表皮角質形成細胞存活率的影響

與正常組比較，5%、10%、20%濃度空白血清干預后細胞存活率均無明顯改變。根據(jù)本研究及前期結果[18]得出，銀屑平丸含藥血清、阿維A含藥血清及空白血清濃度均選用20%進行后續(xù)研究。詳見圖1。

3.2 銀屑平丸含藥血清對細胞上清液中IL-1β及IL-18水平的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組細胞上清IL-1β 及 IL-18 水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀屑平丸含藥血清組、阿維A含藥血清組IL-1β水平降低（P＜0.05），IL-18水平顯著降低（P＜0.01）。詳見圖2。

3.3 銀屑平丸含藥血清對NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組NLRP3，GSDMD、Caspase-1蛋白表達顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，藥物干預后NLRP3、GSDMD、Caspase-1蛋白表達水平均明顯下調（P＜0.01）。詳見圖3。

3.4 銀屑平丸含藥血清對NLRP3、GSDMD、Caspase-1 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組和空白血清組NLRP3，GSDMD、Caspase-1 mRNA表達量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，銀屑平丸含藥血清組、阿維A含藥血清組NLRP3、GSDMD、Caspase-1 mRNA表達水平均明顯下調（P＜0.01）。詳見圖4。

4 討論

銀屑病是一種慢性炎癥性疾病，反復的皮膚炎癥可導致表皮紅斑和增生等特征性改變。銀屑病發(fā)病的炎癥級聯(lián)反應最初由角質形成細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞觸發(fā)。角質形成細胞是皮膚表皮機械屏障的主要組成細胞，在皮膚免疫反應的啟動、維持和調節(jié)中發(fā)揮關鍵作用[20]。研究表明[21]，角質形成細胞死亡會引發(fā)皮膚炎癥，而細胞焦亡被認為是最具炎癥性的細胞死亡途徑。經典的細胞焦亡途徑依賴炎癥小體的激活。炎癥小體是多蛋白復合物，是炎癥的主要介質。炎癥小體激活導致炎性細胞因子的釋放并誘導炎癥細胞死亡[22]。在所有炎癥小體亞型中，NLRP3與多種炎癥和自身免疫性皮膚病的關系最為密切[23-24]。研究表明，NLRP3基因多態(tài)性可能是銀屑病發(fā)病的致病或有價值的遺傳標記因素，提示NLRP3可能是銀屑病治療的潛在靶點[25]。激活后的NLRP3引起細胞因子IL-1β、IL-18成熟，并加工GSDMD來介導細胞因子的釋放[26]。GSDMD是Gasdermin蛋白家族的成員，作用于Caspase-1蛋白的下游，被切割后導致N-末端片段的釋放，N-末端片段在膜中形成孔隙，響應細胞炎癥調控[27-28]。

為了探究尋常型銀屑病的分子機制是否與人表皮角質形成細胞焦亡相關，本研究使用TNF-α誘導人表皮角質形成細胞建立體外銀屑病損傷模型，利用銀屑平丸含藥血清進行干預，以明確銀屑平丸是否通過抑制人表皮角質形成細胞焦亡治療銀屑病。TNF-α是一種關鍵的促炎細胞因子，TNF-α和胱天蛋白酶-8（cysteine aspartate-specific proteinase-8，Caspase-8）特異性切割功能蛋白C（gasdermin C，GSDMC），產生GSDMC-N末端結構域，在細胞膜上形成孔并誘導細胞焦亡[29]。本研究使用TNF-α造模，其機制主要是TNF-α可通過caspase-1/GSDMD通路激活誘導人表皮角質細胞焦亡[30]。本研究結果表明，TNF-α可能是GSDMD介導的細胞焦亡的激活劑，導致NLRP3被激活，Caspase-1釋放，GSDMD發(fā)生裂解，IL-1β、IL-18表達水平升高。通過銀屑平丸含藥血清干預后，NLRP3、GSDMD、Caspase-1表達水平顯著降低，IL-1β、IL-18釋放減少，提示銀屑平丸含藥血清可能通過抑制人表皮角質形成細胞焦亡途徑降低炎癥介質產生。

銀屑病的中醫(yī)病機可用“熱、虛、瘀”來概括，血熱日久，耗津傷血，又可導致血瘀、血虛等病因的出現(xiàn)，使營血虧虛、肌膚失養(yǎng)而發(fā)病。西醫(yī)治療常予以阿維A膠囊口服。阿維A是一種口服維甲酸，通過調節(jié)細胞增殖和分化，減少炎癥反應，從而改善銀屑病患者的皮膚病變，已被證實對銀屑病有明顯的療效[31]。因此，本研究制備阿維A含藥血清作為陽性對照組。然而，阿維A具有較多毒副作用，如致畸性、皮膚損害、胃腸道反應、血脂異常、肝損害等。銀屑平丸針對銀屑病“熱、虛、瘀”的中醫(yī)病機，以“清熱涼血、活血養(yǎng)陰”為治療大法。方中重用生地黃清熱涼血、養(yǎng)陰生津為君藥；白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉清熱解毒，赤芍、牡丹皮、丹參、紫草清熱涼血、活血化斑，與君藥同用，清熱涼血解毒之力大增，且涼血不留瘀，散瘀不傷血，共為臣藥；女貞子、旱蓮草、山藥養(yǎng)陰生津潤燥，為佐藥；白鮮皮清熱祛風止癢，引經達于肌表，甘草清熱解毒兼調和諸藥，共為使藥。本方清熱之中兼以養(yǎng)陰，涼血與活血配伍并用，使熱清血寧而無耗血動血之慮，涼血止血又無冰伏留瘀之弊。在課題組前期研究的基礎上，我們發(fā)現(xiàn)銀屑平丸通過多環(huán)節(jié)、多靶點的整體調節(jié)作用，治療銀屑病安全高效，且當含藥血清濃度為20%時，抑制細胞增殖效果最明顯[18，32-33]。本研究通過TNF-α誘導人表皮角質形成細胞建立體外銀屑病損傷模型，證實了20%銀屑平丸含藥血清對IL-1β、IL-18表達水平及NLRP3、GSDMD、Caspase-1 mRNA和蛋白表達具有抑制作用，與阿維A含藥血清組效果相當。

綜上所述，銀屑平丸含藥血清可能通過降低炎癥小體活性，抑制Caspase導致的GSDMD裂解，IL-1β、IL-18炎癥因子釋放水平降低，改善人表皮角質形成細胞炎癥狀態(tài)，抑制表皮的過度增殖，從而起到防治銀屑病的作用。

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