〔摘要〕 目的 本實驗旨在優(yōu)化圓苞車前子多酚和總黃酮提取工藝，探究圓苞車前子提取物抗氧化活性。方法 采用單因素實驗結合響應面Box-Behnken設計對圓苞車前子中多酚和總黃酮進行超聲輔助提取工藝研究，以多酚及黃酮提取率為指標，利用響應面法得出最佳提取工藝。且通過DPPH、ABTS+自由基的清除能力和總還原能力測定評價其抗氧化能力。結果 圓苞車前子多酚與總黃酮提取最佳工藝為：料液比1∶20，提取時間41 min，超聲波功率420 W，乙醇體積分數(shù)88%。該條件下，多酚的提取量為4.79 mg/g，總黃酮的提取量為23.19 mg/g?？寡趸瘜嶒灲Y果表明，圓苞車前子乙醇提取物在2.5～50 μg/mL范圍內，對DPPH、ABTS+自由基有較好的清除作用，IC50值分別為26.62 μg/mL和9.40 μg/mL；其總還原能力隨著濃度的增加而增強，且始終高于同濃度維生素C的還原能力。結論 該提取工藝穩(wěn)定、可靠，可用于圓苞車前子多酚與總黃酮的提取，且圓苞車前子乙醇提取物具有較好的抗氧化活性。

〔關鍵詞〕 圓苞車前子；超聲波輔助提?。欢喾?；黃酮；響應面法；抗氧化

〔中圖分類號〕R283.6；R285.5 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.10.012

Optimization of ultrasonic extraction process of polyphenols and total flavonoids from Plantago ovata Forssk by response surface methodology and its antioxidant activity analysis

Paiheerding Mutailifu1，3， Muaitaer Nuermaimaiti1，3， Ainiwaer Aikemu1，3， TIAN Shuge2*

1. College of Xinjiang Hetian， Hetian， Xinjiang 848000， China; 2. College of Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830017， China; 3. Xinjiang Key Laboratory of Hetian Characteristic Chinese Medicine Research， Hetian， Xinjiang 848000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To optimize the extraction process of polyphenols and total flavonoids from Plantago ovata Forssk， and explore the antioxidant activity of its extracts. Methods Single factor experiments combined with a response surface Box Behnken design were used to study the ultrasonic-assisted extraction process of polyphenols and total flavonoids from Plantago ovata Forssk. The optimal extraction process was determined using response surface methodology with the extraction rates of polyphenols and flavonoids serving as the main indicators. In addition， the antioxidant capacity of the extracts was evaluated by measuring the scavenging ability of DPPH and ABTS+ free radicals and the total reducing power. Results The optimal extraction process for polyphenols and total flavonoids from Plantago ovata Forssk were as follows： solid-liquid ratio of 1∶20， extraction time of 41 min， ultrasonic power of 420 W， and ethanol volume fraction of 88%. Under these conditions， the extraction amounts of polyphenols and total flavonoids were 4.79 mg/g and 23.19 mg/g， respectively. The antioxidant experiment results showed that the ethanol extract of Plantago ovata Forssk had good scavenging effects on DPPH and ABTS+ free radicals in the range of 2.5-50 μg/mL， with the IC50 values of 26.62 μg/mL and 9.40 μg/mL， respectively. The total reducing power increased with increasing concentration and remains higher than that of vitamin C at the same concentration. Conclusion The extraction process is stable and reliable， and can be used for the extraction of polyphenols and total flavonoids from Plantago ovata Forssk. The ethanol extract of Plantago ovata Forssk exhibits good antioxidant activity.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Plantago ovata Forssk; ultrasonic-assisted extraction; polyphenol; flavonoid; response surface methodology; antioxidation

圓苞車前子為車前科車前屬圓苞車前子（Plantago ovata Forssk）的干燥成熟種子，是亞洲、歐洲地中海地區(qū)和北非的特有植物[1-2]。圓苞車前子在印度和伊朗有廣泛分布，并用于治療痢疾、發(fā)熱、感冒、咳嗽、胃腸道功能衰竭[3]。圓苞車前子為我國傳統(tǒng)民族藥記載于《回回藥方》，具有止瀉、降熱、止痛、利尿、消腫利咽的功效[4]，維吾爾醫(yī)名稱為“伊斯普古勒”（Ispaghul），過去由巴基斯坦、印度等國進口，現(xiàn)已引種栽培于我國新疆和田、喀什地區(qū)[5-6]。圓苞車前子因其溶脹和凝膠特異性，在治療便秘、肥胖、糖尿病和高膽固醇血癥方面得到廣泛認可，作為食品補充劑用以防治糖尿病、高脂血癥，已被列入我國新資源食品名錄，在保健、食品和制藥行業(yè)被廣泛應用[7-8]。

現(xiàn)代研究表明，圓苞車前子具有護肝、降壓、抑菌、降血清膽固醇水平、治療腹瀉和提高胰島素敏感性等多種藥理作用[9-10]。TALUKDER等[11-12]報道，圓苞車前子富含多種生物活性物質，如氨基酸、脂肪酸、黃酮和酚類化合物，具有抗氧化活性。目前，關于圓苞車前子的基礎研究較薄弱，化學成分的研究集中在其主要成分糖類物質。對圓苞車前子中多酚和總黃酮以及提取工藝優(yōu)化未見文獻報道。超聲波輔助提取法設備低廉、操作流程簡易、提取時間短、多酚類和黃酮類提取率高[13]。本研究通過乙醇作為提取溶劑，應用超聲波輔助提取方法，運用響應面Box-Behnken設計探討最合適的提取工藝條件，并且研究其體外抗氧化能力，旨在為圓苞車前子的應用和挖掘提供基礎理論依據。

1 材料

1.1 藥材與試劑

圓苞車前子購自烏魯木齊維醫(yī)藥材店，由新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院中藥鑒定教研室徐海燕教授鑒定。

蘆丁標準品（純度99.4%，批號：100080-200707）購自中國藥品生物制品鑒定所；沒食子（純度：99.2%）購自成都科龍化工試劑廠；ABTS試劑和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical）購自上海阿拉丁試劑有限公司；娃哈哈純凈水；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH等均為分析純試劑。

1.2 主要儀器

800Y型粉碎機（浙江永康市鉑歐五金制品有限公司）；UV-2700型紫外分光光度計（日本島津公司）；JY99-IIDN型超聲波破碎儀（寧波新芝公司）；ME204E型分析天平（上海梅特勒公司）；Multiskan FC型酶標儀[賽默飛世爾（上海）有限公司]。

2 方法

2.1 原材料的預處理與提取工藝

將圓苞車前子粉碎后過100目藥篩備用。分別稱取粉末1.0 g，在不同乙醇濃度、料液比、超聲功率和超聲時間等條件下進行總黃酮與多酚的提取工藝研究。

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對多酚和總黃酮提取率的影響 實驗以70%乙醇設定為提取溶劑，固定超聲輔助提取時間40 min和超聲能量320 W，料液比分別選1∶15、1∶20、1∶25、1∶30及1∶35進行提取，計算圓苞車前子中多酚和總黃酮的提取量。

2.2.2 提取時間對多酚和總黃酮提取率的影響 實驗以70%乙醇設定為提取溶劑，固定料液比1∶20和超聲能量320 W，超聲提取時間選10、20、30、40、50及60 min進行提取，計算圓苞車前子中多酚和總黃酮的提取量。

2.2.3 超聲能量對多酚和總黃酮提取率的影響  實驗以70%乙醇設定為提取溶劑，固定料液比1∶20 和超聲提取時間40 min，超聲能量分別選120、220、320、420及520 W進行提取，計算圓苞車前子中多酚和總黃酮的提取量。

2.2.4 乙醇體積分數(shù)對多酚和總黃酮提取率的影響 固定料液比1∶20、超聲提取時間40 min和超聲能量420 W，選用50%、60%、70%、80%、90%及100%乙醇進行提取，計算圓苞車前子中多酚和總黃酮的提取量。

2.3 響應面試驗

以單因素實驗分析結果作為依據，應用Design-Expert 8.0.6軟件和Box-Behnken設計四因素三水平響應面設計，因素及水平設計見表1。

2.4 圓苞車前子總黃酮和多酚含量及提取率測定

2.4.1 總黃酮含量及提取率 總黃酮含量測定參照律夢偉等[14]方法，得到標準曲線為y=1.174 2x-0.002 4，R2=0.998 5。總黃酮提取率以每克圓苞車前子中含有相當于蘆丁毫克數(shù)表示，單位為mg/g，如下計算：

W（%）=×100%

式中：W表示總黃酮得率，%，c代表供試樣品的質量濃度，mg/mL；D為溶液稀釋倍數(shù)；V為測試樣品溶液的體積，mL；m為藥材取樣量，g。

2.4.2 多酚含量及提取率 多酚含量測定參照律夢偉[14]等方法，得到標準曲線為y=7.614 3x+0.328 4，R2=0.992 4?？傸S酮提取率以每克樣品中含有相當于沒食子酸毫克數(shù)表示，單位為mg/g（按1.2.4.1公式1計算）。

2.5 圓苞車前子抗氧化能力測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考清除DPPH自由基測定的方法[15]進行改良。以最佳提取條件下的提取液為原液，加乙醇稀釋得質量濃度為2.5、5、10、20、30、40、50、100 μg/mL的樣品溶液。用超純水配成同濃度的維生素C（Vc）作為陽性對照。向96孔板中加各樣品溶液（100 μL）和0.20 mmol/L DPPH試劑（100 μL），避光靜置30 min，實驗重復3次，517 nm處測吸光值，并計算DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率（%）=（1-）×100%

式中A1表示樣品溶液加DPPH的吸光值；A2表示不加DPPH樣品溶液的吸光值；A0為DPPH試劑的吸光值。

2.5.2 ABTS+自由基清除率測定 參照GONG等的[16]方法進行改良，具體操作步驟如下：等體積的7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀混合，避光反應16 h，用無水乙醇稀釋至734 nm處吸光值0.700±0.02準備ABTS工作溶液。向96孔板中加2.5～100.0 μg/mL濃度的樣品溶液（20 μL）與ABTS工作溶液（200 μL），避光靜置6 min，734 nm處測定吸光值，實驗重復三次。同樣濃度的抗壞血酸溶液作為陽性對照，并計算清除率。

ABTS+自由基清除率（%）=（1-）×100%

式中A1為樣品加ABTS工作液的吸光值；A2為樣品溶液吸光值；A0為ABTS工作液吸光值。

2.5.3 總還原能力測定 將提取液配制成不同質量濃度的待測液，參照LIU等[17]方法測定圓苞車前子乙醇提取液總還原能力。將1.0 mL不同濃度的樣品溶液與1.0 mL 1%鐵氰化鉀水溶液混合，50 ℃孵育，再加1.0 mL 10%三氯乙酸，離心15 min（5 000 r/min，離心半徑為7 cm），取其上清液2.5 mL與0.15 mL三氯化鐵（0.1%）混合，700 nm處測吸光值。物吸光值的之間升高表明還原能力的提高。同濃度Vc作為陽性對照。

2.6 數(shù)據處理

試驗均設計3次平行實驗，用Origin 2021和Design-Expert等軟件對數(shù)據進行處理及統(tǒng)計分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 單因素實驗結果

3.1.1 料液比對多酚和總黃酮提取率的影響 料液比較小時，隨之料液比的增加，圓苞車前子的多酚和總黃酮提取率也增多，當料液比為1∶25時，多酚和總黃酮的提取率均為最高，可能是圓苞車前子中多酚和黃酮物質得到了充分溶解，但繼續(xù)增加料液比，多酚和黃酮的提取率降下。同時考慮溶劑用量和能量消耗，選擇料液比為1∶25最為適宜。詳見圖1。

3.1.2 超聲時間對多酚和總黃酮提取率的影響 10～40 min內，圓苞車前子中多酚和總黃酮提取量隨著超聲時間增加而提高，超聲時間在40 min時提取率最高，在40～60 min時，多酚和總黃酮逐漸減少。詳見圖2。

3.1.3 超聲能量對多酚和總黃酮提取率的影響 多酚和總黃酮提取率隨著超聲能量增加而增加，在420 W時提取率最高。超聲能量超過420 W時提取率減小。詳見圖3。

3.1.4 乙醇體積分數(shù)對圓苞車前子多酚與總黃酮提取率的影響 隨著提取溶劑乙醇的體積分數(shù)增多，多酚與總黃酮提取率急劇提高，當乙醇體積分數(shù)達到90%時，圓苞車前子多酚與總黃酮的提取率也到達最高點，用無水乙醇提取時提取率反而直線下降。詳見圖4。

3.2 響應面實驗結果與分析

3.2.1 Box－Behnken試驗設計與結果 單因素實驗結果基礎上，用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken模型設計實驗，響應面分析方案及結果如表2所示。

3.2.2 多酚回歸方程方差分析及響應面試驗結果 對多酚得率的結果進行擬合，圓苞車前子中多酚提取率對乙醇體積分數(shù)、超聲能量、料液比和超聲時間的二次多項式回歸方程模型：Y=4.01-1.64A+ 0.081B-0.28C+0.15D-0.35AB-0.24AC-0.31AD+0.16 BC-0.57BD+0.089CD-1.16A2-0.20B2+0.13C2-0.12D2，對回歸模型進行方差分析，結果見表3。

由表3可知：該模型的F=20.44，P<0.000 1，表明所得模型極顯著，失擬項為P值為0.213>0.05，不顯著，表明方程式成立，方法可靠，并模型與數(shù)據擬合程度良好。模型的復合相關系數(shù)R2=0.9534，表明相關性較強；可以用該模型優(yōu)化圓苞車前子中多酚的提取工藝。根據F值可知所考察的因素對響應值影響力的大小順序為乙醇體積分數(shù)（A）>料液比（C）>超聲時間（D）>超聲功率（B），其中A和A2對圓苞車前子多酚化合物的分離提取有極顯著差異（P＜0.01），C和BD對圓苞車前子多酚的提取影響亦顯著（P＜0.05）。

各因素交互作用對多酚提取量影響的響應曲面如圖5所示。由圖5可知，乙醇體積分數(shù)對多酚提取率的影響大于料液比、超聲時間和超聲能量的影響，這結果與方差分析所得結論一致。

3.2.3 總黃酮回歸方程方差分析及響應面試驗結果 以總黃酮提取量作為響應值，建立二次回歸多元方程如下：Y=22.2+4.02A+1.56B+0.6C-0.87D-0.46AB-0.36AC+1.61AD-3.13BC-1.15BD+2.1CD-4.12A2-2.14B2+1.81C2-2.91D2，對回歸模型進行方差分析，結果見表4。

由表4可知，該模型的F=15.70，P<0.000 1，表明所得模型極顯著，失擬項為P值為0.195>0.05，不顯著，表明方程式成立，方法可靠，并模型與數(shù)據擬合程度良好。模型的復合相關系數(shù)R2=0.940 1，表明相關性較強；可以用該模型優(yōu)化圓苞車前子中黃酮類成分的提取工藝。根據F值可知所考察的因素對響應值影響力的大小順序為乙醇體積分數(shù)（A）>超聲功率（B）>提取時間（D）>料液比（C），其中模型一次項A和B對結果均有極顯著影響（P<0.01）；交叉項BC具有極顯著差異（P<0.01），交叉項AD和CD具有顯著差異（P＜0.05）；二次項中A2、B2、C2和D2對結果均有極顯著影響（P<0.01）。

各因素相互作用對黃酮提取率影響的響應曲面如圖6所示。其中乙醇體積分數(shù)與超聲功率，乙醇體積分數(shù)與料液比以及乙醇體積分數(shù)與超聲時間的互相作用均較強，其次料液比與超聲時間的相互作用最弱。

采用Design-Expert 8.0.6軟件Optimization的Numerical功能，得到多酚和總黃酮響應面模型優(yōu)化的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)88.57%，超聲功率420.0 W，料液比1∶20，超聲時間41.09 min。預測此條件下，最大多酚提取量4.81 mg/g，最大黃酮提取量23.26 mg/g。為便于工業(yè)生產及實際操作的可行性，確定最終工藝為乙醇體積分數(shù)88%，超聲功率420 W，提取時間41 min，料液比1∶20，在此工藝條件下，進行三次平行實驗，多酚得率的均值為4.79 mg/g（RSD=0.44%），黃酮得率均值為23.19 mg/g（RSD=0.19%），與預測值接近，表明經優(yōu)化的提取工藝可行且穩(wěn)定，可用于圓苞車前子中多酚和總黃酮的提取。

3.3 圓苞車前子提取物抗氧化活性評價

3.3.1 清除DPPH自由基的能力 如圖7所示，在多酚濃度2.5～50 μg/mL范圍內，隨著圓苞車前子乙醇提取物和Vc濃度的升高，DPPH自由基清除能力均逐漸提高呈現(xiàn)量效關系，但在測試濃度范圍內提取物對DPPH自由基的清除能力弱于同濃度Vc。當多酚濃度大于50.00 μg/mL時，隨著濃度繼續(xù)增大，清除率趨于平緩，總提取物的清除率與Vc接近，在多酚濃度為100.00 μg/mL時，Vc的清除率為87.84%，圓苞車前子提取物的清除率為84.31%。經計算得Vc和提取物的IC50值分別為14.38 μg/mL和26.62 μg/mL，可見，提取物表現(xiàn)出較好DPPH自由基清除能力，但與Vc相比，提取物對DPPH自由基清除率略弱。

3.3.2 清除ABTS+自由基能力 如圖8所示，多酚濃度2.5～50 μg/mL時，隨著圓苞車前子乙醇提取物和Vc濃度的升高，ABTS+自由基清除能力均逐漸提高呈劑量效應關系，之后其清除ABTS+自由基的能力趨于平緩，且圓苞車前子提取物溶液總抗氧化能力始終比同等濃度抗壞血酸溶液高。當Vc濃度100 μg/mL時，清除率達到最大（85.48%），IC50值為19.49 μg/mL；而圓苞車前子提取物在多酚濃度為50.00 μg/mL時，清除率達到最大（97.21%），IC50值為9.40 μg/mL；說明圓苞車前子多酚具有良好的總抗氧化能力。

3.3.3 總還原能力 由圖9可知，在5～100 μg/mL的濃度范圍內，相同濃度圓苞車前子多酚還原能力比Vc低，但提取物的還原能力與其多酚質量濃度之間呈線性增加。當圓苞車前子多酚質量濃度為50 μg/mL時，其還原能力與濃度為20 μg/mL的Vc接近，表明圓苞車前子多酚具有較強的還原能力。

4 討論

由單因素實驗結果可見，當料液比為1∶25時提取率達到最高值。可能原因是，提取溶劑體積較小時，提取溶劑與藥材的接觸面積較小，得到多酚和總黃酮較少，而后當料液比大于1∶25時，超聲波的部分能量被較多的溶劑消耗，作用于圓苞車前子的超聲波能量減弱，降低了多酚和黃酮類成分從細胞中溶出的能力，導致提取率的下降，使得多酚與總黃酮提取率下降[18]。提取時間選為40 min，提取時間過短時，樣品中的黃酮類成分沒有被完全溶出，但隨著提取時間的增加，其他雜質逐漸被溶出，或由于長時間超聲波振蕩的影響，一些不穩(wěn)定成分被破壞，導致多酚和總黃酮的得率下降[18]。此外，提取率也與超聲能量相關，一般情況下細胞內有效成分通過細胞膜及細胞壁依靠濃度差異進行滲透釋放，當提供足夠大的超聲能量時，會加速細胞壁裂縫產生和發(fā)展，促使細胞膨脹至破裂，細胞內成分直接暴露進入溶劑中，提高溶出率及溶出速率[13]。結果表明，各因素中乙醇體積對提取率的影響較大，可能是乙醇濃度繼續(xù)增大后，因溶劑極性變小使醇溶性、脂溶性或其他低級性雜質也被提取[18]，從而導致多酚和總黃酮得率下降。文獻報道不同藥材使用乙醇提取時，獲得最高提取率的乙醇體積分數(shù)存在一定差異[19-21]，這些差異可能是與藥材結構細胞致密度相關[13]。響應面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應值的影響，響應面越陡峭的一方，對多酚提取率的影響越大[22]。

通過觀察響應面圖，可判斷乙醇體積分數(shù)與超聲功率，乙醇體積分數(shù)與料液比以及乙醇體積分數(shù)與超聲時間的互相作用均較強。它們所對應的響應曲面均為較陡峭；料液比與超聲時間的相互作用最弱，因此，其響應曲面較為平緩。直觀分析結果與方差分析結果一致。本研究基于單因素試驗結果，通過Box-Behnken模型優(yōu)化圓苞車前子中多酚和總黃酮的超聲輔助提取工藝，確定乙醇體積分數(shù)88%，超聲功率420 W，提取時間41 min，料液比1∶20為最理想的提取工藝條件。此條件下，圓苞車前子多酚和總黃酮的實際提取量為分別為4.79 mg/g和23.19 mg/g，與預測值擬合效果好，表明建立的模型可靠，該提取工藝穩(wěn)定合理，是提取圓苞車前子多酚和總黃酮的可行方法。

圓苞車前子乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS+自由基的IC50分別為26.62 μg/mL和9.40 μg/mL，而Vc的IC50分別為14.38 μg/mL和19.49 μg/mL?？梢?，提取物表現(xiàn)出較好的DPPH自由基清除能力，但與Vc相比，其對DPPH自由基清除率略弱。此外，與Vc比較，該提取物具有較強的總還原能力。以上研究為圓苞車前子多酚和黃酮的生產以及圓苞車前子抗氧化活性成分應用于功能性食品開發(fā)提供理論依據。

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