摘要 為明確在廣東新發(fā)現(xiàn)的一種大豆根腐病的病原菌種類，了解其生物學(xué)特性，篩選防治該病的有效殺菌劑，采用組織分離法對罹病大豆植株的根部和莖基部的病原真菌進(jìn)行分離，并通過形態(tài)學(xué)和3 個(gè)基因（rDNA?ITS， TEF?1α， RPB2）的聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析對病原真菌進(jìn)行鑒定，再將該病原真菌接種到原發(fā)病大豆品種桂夏2 號的根部和莖基部，測定其致病性和不同培養(yǎng)基、溫度、碳氮源、pH、光照、殺菌劑對菌絲生長的影響以及病原菌分生孢子的致死溫度。結(jié)果顯示，分離到2 株具有不同特征的真菌，分別鑒定為新孢鐮刀菌（Fusarium neocos?mosporiellum）和鐮狀鐮刀菌（F. falciforme），后者是在我國廣東大豆上的首次報(bào)道；接種試驗(yàn)顯示，這2 株真菌單獨(dú)或混合接種均可引起與田間自然發(fā)生的大豆根腐病相似的癥狀；新孢鐮刀菌（F. neocosmosporiellum）在28 ℃、pH 7 條件下生長最快，可以有效利用多種碳氮源，乳糖和蛋白胨為最佳碳氮源，分生孢子致死溫度為51 ℃（水浴10 min）；鐮狀鐮刀菌（F. falciforme）在25 ℃、pH 7 條件下生長最快，碳氮源利用能力強(qiáng)，以乳糖、蔗糖和麥芽糖為最佳碳源，最佳氮源為蛋白胨，孢子致死溫度為54 ℃（水浴10 min）；不同光照處理對2 個(gè)菌株的菌絲生長無影響；殺菌劑咪鮮胺對2 個(gè)菌株的抑制作用最強(qiáng)。綜上，引起廣東新發(fā)大豆根腐病的病原真菌為新孢鐮刀菌（F. neocosmosporiellum）和鐮狀鐮刀菌（F. falciforme），而這2 種真菌適應(yīng)環(huán)境的能力強(qiáng)，對咪鮮胺敏感，該藥劑可作為防治新發(fā)大豆根腐病的首選藥劑。

關(guān)鍵詞 大豆根腐??； 鐮刀菌； 病原鑒定； 生物學(xué)特征； 多基因系統(tǒng)發(fā)育分析； 殺菌劑篩選

中圖分類號 S435.651 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）06-0229-11

大豆［ Glycine max（ Linn.） Merr］是植物優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、食用油和動(dòng)物飼料的來源，是我國非常重要的作物之一［1-2］，在東北、華南、黃淮海以及長江流域地區(qū)廣泛種植。大豆除了富含油脂和蛋白質(zhì)外，還含有多種獨(dú)特生理功能的次生代謝產(chǎn)物，如大豆異黃酮，能夠預(yù)防及治療癌癥、糖尿病、心血管疾病和骨質(zhì)疏松等疾病［3］。

大豆在生產(chǎn)過程中經(jīng)常會(huì)遭受到許多病原真菌（或卵菌）的侵害，如平頭炭疽菌（Colletotrichumtruncatum）［4］、大豆疫霉（Phytophthora sojae）［5］、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）［6］和尖孢鐮刀菌（Fusari?um oxysporum）［7］等，引起大豆多種真菌（卵菌）病害，這些病害通常會(huì)導(dǎo)致大豆的品質(zhì)和產(chǎn)量下降［8］。

2020 年9 月，在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地（廣州增城寧西）種植的桂夏2 號大豆品種上發(fā)現(xiàn)了一種新發(fā)生的根部病害，病情非常嚴(yán)重，大豆植株發(fā)病后很快就干枯死亡，對大豆生產(chǎn)和種子繁育造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失，但具體病因不明。世界各地報(bào)道和研究較多的大豆根部病害的病原菌主要是鐮刀菌屬（Fusarium spp.）的一些種［8］，這些鐮刀菌種類能夠侵染大豆根莖部皮層及維管組織，引起大豆根腐病和枯萎病，導(dǎo)致根莖部腐爛和枯萎癥狀。此次在廣東發(fā)現(xiàn)的大豆新病害的癥狀與美洲大豆猝死綜合癥（sudden death syndrome，簡稱SDS）的癥狀極為相似［9］。據(jù)報(bào)道，SDS 主要由逗號鐮刀菌（F. virguli?forme）（北美大豆SDS）和圖庫曼鐮刀菌（F. tucuma?niae）（南美大豆SDS）引起［10］，它們侵染大豆后，造成葉片葉脈間的葉肉焦黃壞死，根部及莖基部變褐腐爛，但我國目前尚無SDS 的報(bào)道，SDS 是我國對外植物檢疫對象［9］。因此，有必要確認(rèn)廣東省新發(fā)大豆根腐病的病原種類，篩選出有效的防治藥劑，以便最終能夠更有效地防治該病害。

1 材料與方法

1.1 病樣采集、病原菌的分離純化

2020 年9 月，從華南農(nóng)業(yè)大學(xué)增城教學(xué)科研基地（廣州增城寧西）采集具有典型的大豆新病害癥狀特征的罹病植株，帶回實(shí)驗(yàn)室檢查、拍照并采用常規(guī)組織分離法分離病原菌。首先沖洗干凈大豆莖基部泥土，擦干，在病健交界處切取大小為0.5 cm×0.5 cm的小塊組織，在75% 乙醇中浸泡消毒30 s，然后移入5% 次氯酸鈉溶液消毒2～3 min，再用無菌水漂洗3次，把消毒后的病健組織塊放置于無菌濾紙上吸干和風(fēng)干水分，最后移植于PDA 培養(yǎng)基中，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待菌落長出后，挑取菌落邊緣菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，2 次純化后置于PDA 斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將分離得到的病原菌接種到PDA 培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)7 d，記錄菌落顏色和形態(tài)特征并拍照。用無菌水洗下PDA 培養(yǎng)基平板中的分生孢子，制備孢子懸浮液，吸取少量孢子懸浮液于干凈載玻片上，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特征并測量分生孢子大小。參照文獻(xiàn)［11］判定病原菌的種類。

1.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

用滅菌移液槍頭刮取在PDA 培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)7 d 的病原菌菌絲體，使用真菌基因組DNA 提取試劑盒（D3390-01， Bio-tek）從菌絲中提取基因組DNA。對核糖體RNA 內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribedspacer，rDNA?ITS）、翻譯延伸因子基因（translationelongation factor 1-alpha，TEF?1α）、RNA 聚合酶Ⅱ第二大亞基基因（RNA polymerase Ⅱ second largestsubunit，RPB2）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，各序列擴(kuò)增引物信息見表1。

PCR（polymerase chain reaction）反應(yīng)總體系為25 μL［DNA 模板1 μL，正向和反向引物各1 μL，2×M5 Taq HiFi PCR mix（北京聚合美生物科技有限公司）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL］。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存、備用。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到目的條帶的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將得到的測序結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的已有數(shù)據(jù)進(jìn)行Blast 比對分析，并查找文獻(xiàn)，下載不同病原鐮刀菌的基因序列，見表2。使用 MEGA X 軟件進(jìn)行對齊和剪切，PhyloSuite v1.2.2 將各菌株按照rDNA ? ITSTEF1α-RPB2 的順序首尾串聯(lián)拼接，使用MEGA X軟件中的Maximum likelihood（ML）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 值重復(fù)1 000 次。

1.4 病原菌的致病性測定

病原菌的致病性測定采用傷根浸根法［15］。選用生長一致的兩葉期大豆苗，將大豆苗的根部沖洗后吸干水分，用消毒的剪刀剪去一些須根，用無菌水洗下PDA 培養(yǎng)基平板上的病原菌的分生孢子，制備成孢子懸浮液，將大豆幼苗根部浸泡在濃度為1×106個(gè)/mL 的孢子懸浮液中1 h，最后移栽到無菌土壤基質(zhì)，以R1、R2 單菌株接種以及R1 和R2 菌株混合接種為處理組，以無菌水接種作為對照組，每組3 次重復(fù)，接種后的大豆苗放置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)30 ℃保濕培養(yǎng)。

1.5 病原菌的生物學(xué)特性測定

1）培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響。供試培養(yǎng)基為玉米粉瓊脂（CAM）培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司）、察氏（Czapek）培養(yǎng)基（海博生物技術(shù)有限公司）、燕麥片瓊脂（OA）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、自配番茄瓊脂（TomA）培養(yǎng)基（番茄200 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL），山藥汁瓊脂（YA）培養(yǎng)基（山藥200 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）和水瓊脂（WA）培養(yǎng)基（瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL）。

用打孔器在PDA 平板上生長7 d 的病原菌菌落邊緣打下直徑為5 mm 的菌餅，分別接種于以上培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，每處理3 次重復(fù)；接菌培養(yǎng)皿在28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d 后，用十字交叉法測量菌落直徑。

2） 溫度、光照、pH 對病原菌菌絲生長的影響。培養(yǎng)溫度梯度設(shè)置為5、10、15、20、25、28、30 和35 ℃；光照條件設(shè)置為完全光照、完全黑暗和12 h 光暗交替3 種模式；pH 值設(shè)置4～11 共8 個(gè)酸堿度處理，用1% HCl 或1% NaOH 溶液調(diào)節(jié)高溫滅菌后冷卻至50 ℃左右的PDA 培養(yǎng)基；接種與測量方法同本文“1.5 1）”，每處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

3） 碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響。以察氏（Czapek）培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，參照周而勛等［16］的方法，將培養(yǎng)基中的碳源（蔗糖）以等量碳原子的麥芽糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖、山梨醇和肌醇替代；將培養(yǎng)基中的氮源（硝酸鈉）以等量氮原子的甘氨酸、酵母粉、DL-蘇氨酸、硝酸鉀、蛋白胨和氯化銨替代。每處理3 次重復(fù)，接種與測量方法同本文“ 1.5 1）”。

4） 病原菌分生孢子致死溫度的測定。將1×106個(gè)/mL 的孢子懸浮液1 mL 加入1.5 mL 的薄壁滅菌離心管中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度分別為40、45、50、55 和60 ℃。以室溫處理為對照，持續(xù)處理10 min，取出各處理的離心管并快速冷卻至室溫，涂布在PDA 培養(yǎng)基平板上，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)。每處理3 次重復(fù)，3 d后觀察是否長出菌落，從而判斷孢子是否死亡，得到分生孢子粗略的致死溫度范圍。再以粗略的致死溫度為中心溫度，以1 ℃為間隔，設(shè)置5 個(gè)溫度梯度，重復(fù)之前步驟，確定精確的致死溫度。

1.6 殺菌劑的室內(nèi)篩選

采用含藥平板菌絲生長速率法，測定各殺菌劑對病原菌的抑制效果。供試菌劑為吡唑醚菌酯乳油（25%，北京中保綠農(nóng)科技集團(tuán)有限公司）、甲基硫菌靈可濕性粉劑（70%，允發(fā)化工（上海）有限公司）、代森錳鋅可濕性粉劑（80%，四川潤爾科技有限公司）、咪鮮胺水乳劑（450 g/L，山東鑫星農(nóng)藥有限公司）。將各殺菌劑用無菌水配制成使用濃度100 倍的母液（5 個(gè)梯度的濃度），取1 mL 各殺菌劑各濃度的母液分別加入到高溫滅菌后冷卻到50 ℃左右的100 mL定量PDA 培養(yǎng)基中，充分混勻，制成含藥平板。以添加無菌水的混合溶液的PDA 培養(yǎng)基為對照。接種方法與本文“1.5 1）”一致，每處理3 次重復(fù)，28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，十字交叉測量菌落直徑，按照公式（1）計(jì)算抑菌率。

E =A - B／A - 0.5 × 100% （1）

式（1）中，A 為添加無菌水對照組菌落直徑；B 為添加殺菌劑的處理組菌落直徑，E 為菌落生長抑制率。

以殺菌劑濃度的對數(shù)值作為自變量（X），抑制率對應(yīng)的幾率值作為因變量（Y），建立毒力回歸方程，并計(jì)算各殺菌劑對病原菌的有效中濃度（median effectconcentration，EC50）。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 計(jì)算試驗(yàn)數(shù)據(jù)和構(gòu)建三維柱狀圖，運(yùn)用SPSS17.0 中的Duncan’ s 新復(fù)極差分析法進(jìn)行單因素ANOVA 分析，并以小寫字母為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異進(jìn)行標(biāo)注。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆新病害癥狀

田間大豆葉片上初期出現(xiàn)圓形或不規(guī)則形的黃色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大或愈合形成萎黃斑，葉肉焦黃壞死，僅有葉脈保持一點(diǎn)綠色組織，部分葉片卷曲皺縮，后期從葉柄上脫落；枝條發(fā)育不全，結(jié)莢少、豆粒小；莖基部和根部變褐腐爛，病斑可沿莖向上擴(kuò)展10～20 cm，髓部明顯變?yōu)樽睾稚▓D1）。

2.2 病原菌的形態(tài)特征觀察

對采集到的大豆新病害的罹病根部和莖基部進(jìn)行病原菌分離純化，共獲得2 種菌落形態(tài)的真菌菌株，分別命名為R1 和R2。

在PDA 培養(yǎng)基，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，菌株R1菌落初為白色，后為紅棕色，氣生菌絲旺盛，菌落邊緣較整齊，菌落背面為紅棕色（圖2 A，B）；分生孢子無色，卵圓形或腎形，具有0～1 個(gè)隔膜，大小為（8.68～11.08） μm×（3.23～4.79） μm（圖2C）；培養(yǎng)后期產(chǎn)生子囊殼，子囊殼深棕色，水滴狀，具有孔口和喙，子囊棒狀叢生，每個(gè)子囊內(nèi)含8 個(gè)單排子囊孢子（圖2D，E），子囊孢子豆粒狀，大小為（9.92～12.9）μm×（6.28～8.68） μm（圖2F）；在PDA 培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)大型分生孢子。

在同樣培養(yǎng)條件下，R2 菌株菌落白色，菌落邊緣不整齊，氣生菌絲旺盛（圖3A，B）；小型分生孢子無色，單胞，長橢圓形或卵形，具有0～1 隔膜，大小為（8.52～11.94） μm×（3.19～5.11） μm（圖3C）；大型分生孢子無色，鐮刀狀，具有3～4 隔膜，大小為（25.17～33.55） μm×（4.34～6.14） μm（圖3D）；暫未發(fā)現(xiàn)有性態(tài)（teleomorph）。

根據(jù)上述的形態(tài)特征，R1 和R2 菌株均符合鐮刀菌屬的特征描述［11］，將它們初步鑒定為鐮刀菌的2個(gè)種。

2.3 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

利用3 個(gè)基因的引物對ITS1/ITS4、EF1Ha/EF2Tb 和RPB2-5F2 /RPB2-7cR，對R1 和R2 菌株的3 個(gè)基因rDNA-ITS、TEF-1α 和RPB2 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到約550、750和1 000 bp的條帶（圖4）。

將PCR 產(chǎn)物送至公司測序，測序結(jié)果上傳至NCBI。分別對2 個(gè)菌株的3 個(gè)基因rDNA ? ITS、TEF1α 和RPB2 在NCBI 進(jìn)行Blast 分析，發(fā)現(xiàn)R1 菌株與新孢鐮刀菌（F. neocosmosporiellum）的相似性在99% 以上，R2 菌株與鐮狀鐮刀菌（F. falciforme）的相似性也在99% 以上?；诙嗷蚵?lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建了ITS-TEF1α-RPB2 多基因系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。從圖5 可看出，R1 菌株與新孢鐮刀菌（F. neocos?mosporiellum）聚為一支，而R2 菌株與鐮狀鐮刀菌（F.falciforme）聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果，確定R1 菌株為新孢鐮刀菌（F. neocosmos?poriellum），而R2菌株為鐮狀鐮刀菌（F. falciforme）。

2.4 致病性測定

R1 和R2 菌株單獨(dú)接種及兩者混合接種的結(jié)果顯示，在接種4 周后，3 種接種處理的大豆莖基部都表現(xiàn)出變色、腐爛癥狀，與田間癥狀一致，而對照處理無發(fā)病癥狀（圖6）。通過對比發(fā)現(xiàn)R1 菌株主要影響莖基部，而R2 菌株主要影響根系。而R1 和R2 菌株混合接種同樣出現(xiàn)相似的癥狀，顯示出復(fù)合侵染現(xiàn)象。從發(fā)病植株再次分離純化病原菌可獲得與R1和R2 菌株具有相同菌落和孢子形態(tài)的菌株。因此，根據(jù)科赫氏法則，可以確定新孢鐮刀菌和鐮狀鐮刀菌均為引起大豆新發(fā)根腐病的病原菌，可分別和復(fù)合侵染引起大豆根腐病。

2.5 病原菌的生物學(xué)特性

1）培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響。結(jié)果如圖7 所示。R1 菌株在Czapek 培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑達(dá)到6.11 cm；在PDA、YA、CAM 培養(yǎng)基上次之，菌落直徑分別為5.78、5.41 和5.33 cm；在OA 培養(yǎng)基上生長最慢，菌落直徑僅為3.61 cm。R2 菌株在Czapek 培養(yǎng)基上生長最快，菌落直徑達(dá)到7.13 cm；在CAM、PDA 和TomA 培養(yǎng)基上次之，菌落直徑分別為6.92、6.96 和6.87 cm；而在OA 培養(yǎng)基上生長最慢，菌落直徑僅為4.6 cm。

2）溫度、光照、pH 對病原菌菌絲生長的影響。結(jié)果如圖8 所示。R1 和R2 菌株在10～30 ℃范圍內(nèi)均可以生長；在5～28 ℃區(qū)間內(nèi)，菌落直徑隨溫度升高而增大，20～30 ℃生長良好，R1 菌株在28 ℃生長最快，菌落直徑為6.00 cm；R2 菌株在25 ℃生長最快，菌落直徑為7.33 cm；隨后菌落直徑隨溫度升高而減?。▓D8A）。光照對R1和R2菌株生長影響不大，菌落直徑分別為5.662 5～5.737 5 cm 和7.175 0～7.287 5cm，在α=0.05 水平下差異不顯著（圖8B）。在pH4～11，R1 與R2 菌株均能正常生長；在pH 7 時(shí)，R1 與R2 菌株生長最好，菌落直徑最大，分別為5.93 cm 和7.26 cm；在pH 4～7，菌落直徑隨pH 增大而增大，隨后隨pH 增大而減小（圖8C）。

3） 碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響。結(jié)果如圖9、圖10 所示。R1 菌株以乳糖為碳源時(shí)，菌絲生長最快，菌落直徑達(dá)到6.46 cm，以麥芽糖為碳源次之，菌落直徑為6.07 cm，以山梨醇為碳源時(shí)生長最慢，菌落直徑為5.28 cm；以蛋白胨為氮源時(shí)，菌絲生長最快，菌落直徑達(dá)到6.55 cm，其次為硝酸鈉和硝酸鉀，菌落直徑分別為6.20、6.13 cm，而以氯化銨為氮源時(shí)，菌絲生長最慢，菌落直徑為4.05 cm。R2菌株在以乳糖、麥芽糖、蔗糖為碳源時(shí)生長速率最快，菌落直徑為6.43～6.47 cm，三者處理在α=0.05 水平下無顯著差異，以甘露醇、山梨醇、肌醇為碳源時(shí)生長速率最慢，菌落直徑為5.91～6.03 cm；以蛋白胨為氮源時(shí)，菌絲生長最快，菌落直徑為7.4 cm，其次為硝酸鈉和硝酸鉀，以氯化銨為氮源時(shí)，菌絲生長最慢，菌落直徑為4.65 cm。

4）病原菌分生孢子致死溫度的測定。由表3 可知，R1 和R2 菌株的分生孢子對溫度的敏感度不同，R1 菌株的分生孢子在經(jīng)過51 ℃水浴10 min 處理后，分生孢子喪失活力，不能萌發(fā)，不能長出菌落；而R2菌株的分生孢子比R1 菌株的分生孢子對溫度更不敏感，R2 菌株的分生孢子在經(jīng)過54 ℃水浴10 min 處理后，分生孢子才喪失活力。

2.6 室內(nèi)殺菌劑篩選

對R1 和R2 菌株進(jìn)行殺菌劑室內(nèi)毒力測定，結(jié)果顯示（表4），在所選用的4 種殺菌劑中，2 個(gè)菌株對咪鮮胺表現(xiàn)最敏感，其次為吡唑醚菌酯，代森錳鋅對兩菌株的抑制作用最差。因而，咪鮮胺可作為防治新發(fā)大豆根腐病的藥劑。

3 討論

本研究報(bào)道了在廣東省內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種大豆根部病害，并將引起該病害的病原菌鑒定為新孢鐮刀菌（F. neocosmosporiellum）和鐮狀鐮刀菌（F. falci?forme）。兩菌株均侵染大豆，即能復(fù)合侵染大豆，造成大豆莖基部和根部變色腐爛。通過對比發(fā)現(xiàn)，新孢鐮刀菌主要侵染大豆莖基部，鐮狀鐮刀菌主要侵染大豆根部。葉片上出現(xiàn)的葉肉細(xì)胞焦黃壞死癥狀，可能是因?yàn)殓牭毒秩竞髸?huì)分泌一些毒素，這些毒素通過植物的輸導(dǎo)組織運(yùn)輸至植物葉片從而造成這種癥狀的發(fā)生。美洲大豆SDS［17］癥狀與本次所研究的大豆新病害癥狀有許多相似之處［9］，但也存在一些不同之處。首先是病原菌的不同，美洲大豆SDS病原菌為逗號鐮刀菌（F. virguliforme）（北美大豆SDS）和圖庫曼鐮刀菌（F. tucumaniae）（南美大豆SDS），而本研究的大豆新病害病原菌并非SDS 病原菌，而是另外2 種鐮刀菌；其次是在病程后期，SDS 在處于高溫高濕條件下莖基部會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色的菌絲體，病原菌在PDA 培養(yǎng)基上也會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色菌落［18］，侵染大豆莖的皮層及維管組織造成褐變腐爛，但髓部不受影響，依然保持白色［9］；而本研究的大豆新病害在莖基部沒有產(chǎn)生藍(lán)色菌絲體，2 個(gè)菌株在PDA 培養(yǎng)基上也不產(chǎn)生藍(lán)色菌落，侵染大豆輸導(dǎo)組織并且引起根系和莖干髓部（維管束）褐變甚至黑化。結(jié)合以上特點(diǎn)，確定本研究新發(fā)現(xiàn)的大豆根腐病并非美洲大豆SDS。

此前，蓋云鵬等［19］與潘汝謙等［20］報(bào)道了大豆新赤殼菌（Neocosmospora vasinfecta，現(xiàn)改名為新孢鐮刀菌F. neocosmosporiellum），可引起大豆和花生的莖基部腐爛；何彎彎等［21］也在花生果實(shí)上分離到可引起花生果實(shí)和種子腐爛的新孢鐮刀菌。鐮狀鐮刀菌（F. falciforme）屬于腐皮鐮刀菌復(fù)合種［ Fusariumsolani species complex（ FSSC）］ 中的一員，該病原菌寄主范圍非常廣泛，曾被報(bào)道在印度番木瓜上引起根部褐變和腐爛，發(fā)病率高達(dá)40%～50%［22］；在墨西哥，該菌也引起番茄葉片黃化、根莖腐爛［23］；該菌還能侵染西瓜，造成西瓜果實(shí)表面呈現(xiàn)黃至棕色的凹陷病斑，果實(shí)內(nèi)部腐爛［24］。但在大豆上尚未見到報(bào)道。本研究首次發(fā)現(xiàn)大豆是鐮狀鐮刀菌（F. falci?forme）的寄主之一。因此，這是在中國廣東省首次報(bào)道鐮狀鐮刀菌（F. falciforme）為害大豆，引起根腐病。此次分離的鐮狀鐮刀菌在自然條件下以無性態(tài)存在，并未觀察到有性態(tài)，其原因可能是該菌的有性生殖需要性親和的菌絲融合。

為了有效地防治該病害，筆者隨后對新孢鐮刀菌與鐮狀鐮刀菌2 個(gè)菌株的生物學(xué)特性和殺菌劑室內(nèi)篩選進(jìn)行了探究。結(jié)果表明，2 個(gè)菌株的適合生長溫度均為20～30 ℃，適應(yīng)酸堿的能力強(qiáng)，這與何彎彎等［21］的研究結(jié)果一致，碳氮源的適應(yīng)范圍廣，在所選用的7 種碳氮源上均能生長，但在供試氮源試驗(yàn)中，以氯化銨為氮源時(shí)，2 個(gè)菌株的菌落生長速率能夠與其他氮源形成顯著差異，這點(diǎn)與韓鳳英等［25］所得出的銨態(tài)氮能夠顯著降低胡蘿卜茄病鐮刀菌菌絲生長的試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，在大豆的生產(chǎn)過程中，在氮肥使用上，推薦以施用銨態(tài)氮肥為主，這樣可以降低大豆根腐病菌的生長，從而減少大豆根腐病的發(fā)生。

華南地區(qū)氣候溫暖濕潤，土壤條件復(fù)雜，而病原菌能適應(yīng)多樣的環(huán)境，有利于病原菌的生長與繁殖，農(nóng)事操作或農(nóng)田管理不當(dāng)有利于病原菌的傳播。藥劑敏感性試驗(yàn)表明，當(dāng)?shù)鼐陮λx用殺真菌劑已具有一定的抗性，咪鮮胺可用于大豆根腐病的防治。

綜上，本研究對廣東大豆新發(fā)根腐病的病原菌種類進(jìn)行了鑒定，其中一種是未報(bào)到過的病原菌—鐮狀鐮刀菌，并且闡明了病原菌的生物學(xué)特征，篩選了大豆新發(fā)根腐病的有效殺菌劑，可為進(jìn)一步研究該病害的發(fā)生和防控提供參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)References

［1］ 黃新陽，周延爭，王桂蓮，等. 國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系濟(jì)寧綜合試驗(yàn)站服務(wù)區(qū)大豆生產(chǎn)現(xiàn)狀及“十四五”期間技術(shù)需求調(diào)研報(bào)告［J］. 大豆科技， 2022 （5）：1-7.HUANG X Y， ZHOUY Z， WANG G L， et al.Research report on the current situationof soybean production in the service area of Jinan comprehensivetest station of national soybean industry technologysystem and the technical demand during the 14th Five-YearPlan period［J］.Soybean science amp; technology， 2022 （5）：1-7（in Chinese）.

［2］ 鄒文秀，韓曉增，張謙，等. 國家大豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系海倫綜合試驗(yàn)站服務(wù)區(qū)大豆生產(chǎn)現(xiàn)狀及“十四五”期間技術(shù)需求調(diào)研報(bào)告［J］. 大豆科技， 2022（2）： 29-41.ZOU W X， HAN XZ， ZHANG Q.Research report on the current situation of soybeanproduction in the service area of Hailun comprehensivetest station of national soybean industry technology system andthe technical demand during the 14th Five-Year Plan period［J］.Soybean science amp; technology， 2022（2）： 29-41 （in Chinese）.

［3］ 劉璐璐，李建飛，舒躍，等. 我國大豆生產(chǎn)消費(fèi)現(xiàn)狀及提升自給率策略［J］. 中國油料作物學(xué)報(bào)， 2022， 44（2）： 242-248.LIU L L， LI J F， SHU Y， et al.Current situation of soybeanproduction and consumption in China and strategies to improveself-sufficiency rate［J］. Chinese journal of oil crop sciences，2022， 44（2）： 242-248（in Chinese with English abstract）.

［4］ 李月，舒燦偉，饒軍華，等. 熱帶亞熱帶高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆種質(zhì)資源抗炭疽病鑒定［C］//中國植物病理學(xué)會(huì). 植物病理科技創(chuàng)新與綠色防控：中國植物病理學(xué)會(huì)2021 年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集.北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2021：401.LI Y， SHU CW， RAO J H， et al. Identification of anti-anthracnose germplasmresources with high yield and high quality soybean intropical and subtropical region［C］// Chinese Society of PlantPathology. Plant pathology science and technology innovationand green prevention and control： Proceedings of the 2021 AcademicAnnual Conference of the Chinese Plant Pathology Society.Beijing： China Agricultural Science and TechnologyPress ，2021：40（in Chinese）.

［5］ 楊瑾，汪孝璊，葉文武，等．黃淮海地區(qū)大豆種質(zhì)資源對疫霉根腐病的抗性鑒定［J］． 大豆科學(xué)，2020，39（1）：12-22．YANG J，WANG X M，YE W W，et al．Identification of soybeanresistance to Phytophthora sojae in the germplasm resourcesfrom Huanghuaihai Region of China［J］．Soybean science，2020，39（1）：12-22（ in Chinese with English abstract）．

［6］ 魏崍，李馨園，唐曉飛，等．大豆品種對立枯絲核菌的抗性研究［J］．大豆科學(xué)，2012，31（3）：457-461．WEI L，LI X Y，TANG X F，et al．Screening on soybean germplasm resistantto Rhizoctonia solani［J］．Soybean science，2012，31（3）：457-461（ in Chinese with English abstract）．

［7］ 王爽，李新民，劉春來，等. 引起黑龍江省大豆根腐病的鐮刀菌種類鑒定及致病分析［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2023，53（1）：126-128. WANG S， LI X M， LIU C L， et al. Identificationand pathogenicity of Fusarium species causing soybean rootrot in Heilongjiang Province［J］.Acta phytopathologica sinica，2023，53（1）：126-128（in Chinese with English abstract）.

［8］ 葉文武，劉萬才，王源超. 中國大豆病蟲害發(fā)生現(xiàn)狀及全程綠色防控技術(shù)研究進(jìn)展［J］. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2023，50（2）： 265-273. YE W W， LIU W C， WANG Y C. Occurrence statusand whole-process green control technologies for soybean diseasesand pests in China［J］.Journal of plant protection， 2023，50（2）： 265-273（in Chinese with English abstract）.

［9］ 杜琦，李啟新. 大豆猝死綜合癥［J］. 植物檢疫， 1998， 12（5）：31-32. DU Q， LI Q X. Soybean sudden death syndrome［J］.Plant quarantine， 1998， 12（5）：31-32（ in Chinese）.

［10］ 吳品珊，嚴(yán)進(jìn)，RUPE J C，等. 大豆猝死綜合癥病菌檢測技術(shù)研究［J］. 植物病理學(xué)報(bào)， 2005， 35（6）： 28-34. WU P S，YAN J， RUPE J C， et al.The detection techniques for suddendeath syndrome pathogens of soybean［J］.Acta phytopathologicasinica， 2005， 35（6）： 28-34（in Chinese with English abstract）.

［11］ 魏景超．真菌鑒定手冊［M］．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979． WEI J C． Handbook of fungal identification［M］．Shanghai：Shanghai Scientific amp; Technical Publishers，1979（in Chinese）．

［12］ WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al．Amplification and directsequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//INNIS M A，GELFAND D H， SNINSKY J J，WHITE T J. PCR Protocols． New York：Academic Press，1990：315-322．

［13］ O’DONNELL K，KISTLER H C，CIGELNIK E，et al．Multipleevolutionary origins of the fungus causing Panama diseaseof banana：concordant evidence from nuclear and mitochondrialgene genealogies［J］．PNAS，1998，95（5）：2044-2049．

［14］ O’DONNELL K，SUTTON D A，RINALDI M G，et al．Internet-accessible DNA sequence database for identifying fusariafrom human and animal infections［J］．Journal of clinical microbiology，2010，48（10）：3708-3718.

［15］ 徐艷輝，李燁，許向陽. 番茄枯萎病的研究進(jìn)展［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008， 39（11）： 128-134.XU Y H， LI Y， XU XY.Progress in research on Fusarium wilt of tomato［J］.Journalof Northeast Agricultural University， 2008， 39（11）： 128-134（in Chinese with English abstract）.

［16］ 周而勛，楊媚，張華，等. 菜心炭疽病菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響因素［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2002， 25（2）： 47-51.ZHOU E X， YANG M， ZHANG H， et al.Factors affectingthe mycelial growth， sporulation and conidial germinationof Colletotrichum higginsianum Sacc.［J］. Journal of NanjingAgricultural University， 2002， 25（2）： 47-51（in Chinese withEnglish abstract）.

［17］ O’DONNELL K，SINK S，SCANDIANI M M，et al．Soybeansudden death syndrome species diversity within north andSouth America revealed by multilocus genotyping［J］．Phytopathology，2010，100（1）：58-71.

［18］ 秦國勛，吳品珊，張睿. 大豆猝死綜合癥病菌研究進(jìn)展［J］. 檢驗(yàn)檢疫科學(xué)， 2006（S1）： 125-128. QIN G X， WU P S，ZHANG R.Research progress of sudden death syndrome ［J］.Inspection and quarantine science， 2006（S1）： 125-128（inChinese）.

［19］ 蓋云鵬，潘汝謙，徐大高，等. 大豆新赤殼菌莖腐病的鑒定［C］ //中國植物病理學(xué)會(huì). 中國植物病理學(xué)會(huì)2011 年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2011：65.GAI YP， PAN R Q， XU D G， et al.Identification of Neocosmosproastem rot of soybean ［C］// Chinese Society of Plant Pathology.Proceedings of the 2011 Academic Annual Conference ofthe Chinese Plant Pathology Society. Beijing： China AgriculturalScience and Technology Press，2011：65（ in Chinese）.

［20］ 潘汝謙，鄧巧文，鄧銘光，等. 花生基腐?。∟eocosmosporavasinfecta）在中國大陸的首次報(bào)道［C］ //中國植物病理學(xué)會(huì). 中國植物病理學(xué)會(huì)2011 年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社， 2011：91， et al.PAN R Q， DENG QW， DENG M G， et al.The first report of peanut rot （Neocos?mospora vasinfecta） in mainland China ［C］// Chinese Societyof Plant Pathology.Proceedings of the 2011 Academic AnnualConference of the Chinese Plant Pathology Society. Beijing：China Agricultural Science and Technology Press，2011：65（in Chinese）.

［21］ 何彎彎，馮麗娜，李振云，等．引起花生果腐病的新孢鐮刀菌及其生物學(xué)特性［J］．植物病理學(xué)報(bào)，2022，52（3）：493-498．HE W W，F(xiàn)ENG L N，LI Z Y，et al． Fusarium neocosmos?poriellum causing peanut pod rot and its biological characteristics［J］． Acta phytopathologica sinica，2022，52（3）：493-498（ in Chinese with English abstract）．

［22］ GUPTA A K，CHOUDHARY R，BASHYAL B M，et al．First report of root and stem rot disease on papaya caused byFusarium falciforme in India［J/OL］．Plant disease，2019，103（10）：2676［2023-08-29］． https：//doi. org/10.1094/PDIS-11-18-2118-PDN.

［23］ VEGA-GUTIéRREZ T A，LóPEZ-URQUíDEZ G A，ALLENDE-MOLAR R，et al.Aggressiveness and molecular characterizationof Fusarium spp．a(chǎn)ssociated with foot rot and wiltin tomato in Sinaloa，Mexico［J/OL］． Biotech，2019，9（7）：276 ［2023-08-29］. https：//doi. org/10.1007/s13205-019-1808-3.

［24］ BALASUBRAMANIAM J，GOH K S，SANI S F，et al．Fu?sarium falciforme and F. oxysporum causing postharvest fruitrot of watermelon（ Citrullus lanatus） in Malaysia：a first report［J/OL］．Crop protection，2023，163：106115［2023-08-29］．https：//doi.org/10.1016/j.cropro.2022.106115.

［25］ 韓鳳英，高婧，王勇，等．胡蘿卜茄病鐮刀菌生物學(xué)特性及藥劑敏感性研究［J］．北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，48（3）：117-122．HAN F Y，GAO J，WANG Y，et al．Research on biologicalcharacteristics and fungicides sensitivity of Fusarium solani oncarrot［J］．Journal of northern agriculture，2020，48（3）：117-122（ in Chinese with English abstract）．

（責(zé)任編輯：邊書京）

基金項(xiàng)目：廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020B020220008）