摘要 巨噬細(xì)胞是先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，但無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）卻能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并以巨噬細(xì)胞為載體入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)。為解析無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活機(jī)制，將無(wú)乳鏈球菌HN016 與RAW264.7 共孵育，提取胞內(nèi)細(xì)菌RNA 后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）、Gene Ontology（GO）及Kyotoencyclopedia of genes and genomes（KEGG）富集分析；于體外將HN016 與羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞孵育，提取胞內(nèi)細(xì)菌RNA，并利用quantitative real-time PCR（qPCR）驗(yàn)證目標(biāo)基因（包括：sip、fbsA、cylB、cylD、cylE、neuA、cpsB 和cfb）表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與無(wú)處理組相比，共篩選到1 215 個(gè)差異表達(dá)基因（DEG），其中896 個(gè)上調(diào)基因，319個(gè)下調(diào)基因。GO 富集結(jié)果顯示，DEG 在分子功能、生物學(xué)過(guò)程和細(xì)胞組分3 大類中均顯著富集。KEGG 富集結(jié)果顯示，顯著富集通路主要為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體、核糖體和群體感應(yīng)等代謝途徑。在DEG 中，篩選到無(wú)乳鏈球菌毒力相關(guān)基因27 個(gè)，包括fbsA（+8.65）、sip（+6.28）、c ylD（+4.93）和cfb（-4.65）等，并利用qPCR 驗(yàn)證RNA-seq 結(jié)果，二者數(shù)據(jù)一致。而檢測(cè)羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞內(nèi)存活細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)其目標(biāo)基因的表達(dá)水平與小鼠巨噬細(xì)胞的相似。因此推測(cè)，無(wú)乳鏈球菌在被巨噬細(xì)胞吞入后，巨噬細(xì)胞內(nèi)的有害環(huán)境增強(qiáng)了無(wú)乳鏈球菌的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，刺激了無(wú)乳鏈球菌的能量運(yùn)輸和對(duì)巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的次生代謝物代謝的能力，并且提高了毒力相關(guān)基因的表達(dá)水平。

關(guān)鍵詞 無(wú)乳鏈球菌； 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7； 胞內(nèi)存活； 次生代謝物

中圖分類號(hào) S943 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）06-0307-09

無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），也被稱為B 組鏈球菌（group B Streptococcus，GBS），是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，具有廣泛的宿主范圍，包括哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物以及魚(yú)類［1］。無(wú)乳鏈球菌不僅侵染人類，也會(huì)引起養(yǎng)殖魚(yú)類尤其是羅非魚(yú)的嚴(yán)重感染，并且能穿過(guò)血腦屏障，入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2-3］，導(dǎo)致人類和魚(yú)類的嚴(yán)重腦膜炎癥狀［4-5］。迄今為止，研究人員提出了無(wú)乳鏈球菌的3 種主要入侵策略，包括：經(jīng)細(xì)胞（transcellular）、旁細(xì)胞（paracellular）和特洛伊木馬（Trojan horse）。其中，特洛伊木馬機(jī)制是無(wú)乳鏈球菌利用被感染的宿主細(xì)胞，突破血腦屏障轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)［2，6］。

在無(wú)乳鏈球菌感染期間，宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生響應(yīng)，趨化因子招募巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到感染部位，以消除入侵的病原體［7］。在巨噬細(xì)胞中，細(xì)菌被吞入吞噬體，其中溶酶體形成高度酸性環(huán)境，并產(chǎn)生抗菌肽、活性氧和活性氮等物質(zhì)，以殺死細(xì)菌［8-9］。有研究者認(rèn)為化膿性鏈球菌（Streptococcus pyogenes）在吞噬細(xì)胞中的生存是該病原菌建立感染的一個(gè)重要機(jī)制［10］。此外，也有研究證明巨噬細(xì)胞在單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）經(jīng)血傳播到腦內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)充當(dāng)載體，然后進(jìn)一步傳播李斯特菌到腦實(shí)質(zhì)中［11］。根據(jù)已有研究報(bào)道，無(wú)乳鏈球菌能夠在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活一定時(shí)間，并利用莢膜多糖、雙組份系統(tǒng)CovS/CovR 等抵抗巨噬細(xì)胞內(nèi)的惡劣條件，提高細(xì)菌的胞內(nèi)存活率［12-13］。然而，無(wú)乳鏈球菌的胞內(nèi)存活機(jī)制目前尚未完全明了。因此，解析無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活機(jī)制，對(duì)明確無(wú)乳鏈球菌的入腦過(guò)程和致病機(jī)制至關(guān)重要。

本研究以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 為模型，利用二代測(cè)序法鑒定無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活過(guò)程中產(chǎn)生差異性表達(dá)的基因，并用羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞驗(yàn)證小鼠巨噬細(xì)胞結(jié)果，旨在為解析無(wú)乳鏈球菌的巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞

無(wú)乳鏈球菌HN016 菌株于2010 年在廣州分離自發(fā)病的羅非魚(yú)體內(nèi)，其基因組序列己上傳至Gen‐Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為CP011325.1。無(wú)乳鏈球菌用THB 液體/固體培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 由筆者所在實(shí)驗(yàn)室用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2傳代保存。

1.2 試劑

THB 培養(yǎng)基購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和青霉素-鏈霉素購(gòu)自Gibco 公司；Percoll 白細(xì)胞分離液購(gòu)自GE Healthcare公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Kit）購(gòu)自TaKaRa 公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（SYBR premix Ex TaqTM Kit）購(gòu)自北京擎科生物技術(shù)有限公司；試驗(yàn)中所用引物均由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.3 轉(zhuǎn)錄組樣品制備

將無(wú)乳鏈球菌HN016 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，PBS清洗2 遍后重懸于DMEM 培養(yǎng)基，以MOI=10 向RAW264.7 細(xì)胞孔板中加入菌液，1 500 r/min 離心5 min 使得細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸，于37 ℃、5% CO2條件下孵育1 h。孵育后，移去培養(yǎng)基，加入含青霉素（5 μg/mL）-鏈霉素（100 μg/mL）雙抗的DMEM 培養(yǎng)基孵育1 h 以殺滅胞外細(xì)菌，后用PBS 清洗2 遍，加入滅菌去離子水常溫裂解20 min，直至于顯微鏡下觀察到細(xì)胞發(fā)生膨脹破裂，釋放胞內(nèi)細(xì)菌。取適量裂解液稀釋涂板計(jì)數(shù)菌量，剩余裂解液6 000 r/min 離心10 min 收集菌體。另取等量細(xì)菌加入無(wú)細(xì)胞的孔板內(nèi)作為無(wú)處理組，同樣條件下孵育2 h 后，直接6 000r/min 離心10 min 收集菌體，于-80 ℃保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

從菌體樣品中提取總RNA，利用Nanodrop 2000對(duì)所提RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整性。去除rRNA，從總RNA 中分離出mRNA，隨后將純化得到的mRNA 片段化并作為模板，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。在進(jìn)行第二鏈合成時(shí)，dNTP 試劑中用dUTP 代替dTTP，使cDNA 第二鏈中堿基包含A/U/C/G。雙鏈的cDNA 結(jié)構(gòu)為黏性末端，加入End Repair Mix 補(bǔ)成平末端，隨后在3′末端加上1 個(gè)A 堿基，用于連接Y 字形的接頭。在PCR 擴(kuò)增前，用UNG 酶將cDNA第二鏈消化，從而使文庫(kù)中僅包含cDNA 第一鏈。經(jīng)檢測(cè)合格的文庫(kù)再通過(guò)Truseq SBS Kit（300 cycles）（Illumina）二代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 序列組裝

利用Trimmomatic 軟件，去除接頭序列、低質(zhì)量讀段序列及長(zhǎng)度過(guò)短序列，得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)。利用Rockhopper 軟件，將質(zhì)控后得到的高質(zhì)量測(cè)序序列以HN016 菌株基因組（CP011325.1）為參考進(jìn)行比對(duì)，使測(cè)序序列定位到基因組。

1.6 差異表達(dá)分析

采用RPKM（reads per kilobase of transcript permillion reads mapped）計(jì)算基因表達(dá)量。利用edgeR篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed gene，DEG），篩選標(biāo)準(zhǔn)為|log2（fold change）| ≥1 和P≤0.05。使用軟件Goatools（https：//github.com/tanghaibao/GOatools）進(jìn)行GO 富集分析；使用KOBAS（http：//kobas. cbi. pku. edu. cn/kobas3/？ t=1）進(jìn)行KEGG PATHWAY 富集分析，P≤0.05 則認(rèn)為是顯著富集。

1.7 毒力相關(guān)差異表達(dá)基因聚類分析

將篩選得到的DEG 與毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)VFDB（http：//www.mgc.ac.cn/VFs）進(jìn)行比對(duì)，篩選與無(wú)乳鏈球菌毒力相關(guān)的DEG。

1.8 羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞吞噬試驗(yàn)

（1）配制Percoll 溶液（以10 mL 體積為例）。34% Percoll 溶液：3.4 mL Percoll、5.59 mL dH2O、1 mL HBSS （10×）和25 μL Heparin （104 U/mL）；51% Percoll 溶液：5.1 mL Percoll、3.89 mL dH2O、1 mL HBSS （10×）和25 μL Heparin （104 U/mL）；（2）制備34% Percoll-51% Percoll 分層：向15 mL 離心管中加入4 mL 34% 的Percoll 溶液，然后在溶液底部緩慢加入4 mL 51% Percoll 溶液，注意不要擾動(dòng)界面；（3）取出羅非魚(yú)頭腎，用剪刀剪成1 mm3 的碎塊，將組織碎塊轉(zhuǎn)移到100 μm 細(xì)胞篩網(wǎng)中，用5mL 注射器活塞輕輕按壓組織碎塊，按壓過(guò)程中緩慢加入DMEM 培養(yǎng)基，使單個(gè)細(xì)胞通過(guò)100 μm 細(xì)胞過(guò)濾器；（4）水平離心機(jī)4 ℃ 1 500 r/min 離心30min（注意：離心機(jī)的加速度和減速度均應(yīng)設(shè)為0）；（5）收集3～4 mL 處于34% Percoll-51% Percoll 界面的白細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入15 mL 離心管，加入6 mL 含肝素鈉的DMEM 培養(yǎng)基，混勻后4 ℃ 1 500 r/min 離心10min；重復(fù)1 次；（6）加入含有2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞濃度，轉(zhuǎn)移至12 孔細(xì)胞板，28 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)，待原代巨噬細(xì)胞貼壁之后，移除懸浮細(xì)胞和培養(yǎng)液，重新加入新鮮DMEM 培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)待用；（7）無(wú)乳鏈球菌培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期后，離心并重新懸浮于含有2% FBS 的DMEM 中；（8）以MOI=10 將細(xì)菌接種于羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞，1 500 r/min 離心5 min 后于28 ℃ 5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h。孵育后，移去培養(yǎng)基，加入含青霉素（5 μg/mL）-鏈霉素（100 μg/mL）雙抗的DMEM 培養(yǎng)基孵育1 h 以殺滅胞外細(xì)菌，然后PBS清洗2 遍，加入滅菌去離子水20 min 裂解細(xì)胞，釋放胞內(nèi)細(xì)菌。（9）利用Trizol 法提取細(xì)菌RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后存于-20 ℃冰箱待用。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

差異表達(dá)基因中進(jìn)行qPCR（quantitative realtimePCR）驗(yàn)證。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Prime‐ScriptTM RT Kit）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，SYBR premix ExTaqTM Kit 進(jìn)行熒光定量PCR，內(nèi)參基因?yàn)?6SrRNA。qPCR 反應(yīng)體系（20 μL）：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR premix ExTaqTM Kit 10μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，分析方法采用2–ΔΔCt法。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAW264.7 胞內(nèi)存活細(xì)菌檢測(cè)

裂解RAW264.7 細(xì)胞后，取裂解液稀釋涂板，計(jì)數(shù)胞內(nèi)存活細(xì)菌。結(jié)果顯示，在試驗(yàn)條件下，RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)存活細(xì)菌量為3.05×105CFU/mL，吞入率為16.31%。說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌能夠被RAW264.7 細(xì)胞吞入，且能夠在胞內(nèi)存活并保持活性。

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

經(jīng)Truseq SBS Kit（300cycles）平臺(tái)測(cè)序，共獲得了36.82 G 數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組各樣本Q20 接近99%，且Q30gt;90%，表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較好，可用于后續(xù)分析（表2）。

采用DESeq 分析發(fā)現(xiàn)，在互作組和無(wú)處理組之間，共計(jì)有1 215 個(gè)DEG。相較于無(wú)處理組，互作組中有896 個(gè)基因表達(dá)量顯著上調(diào)，319 個(gè)基因表達(dá)量顯著下調(diào)（圖1）。

2.3 差異基因功能注釋與富集分析

DEG 總共匹配到19 個(gè)GO 條目，分別是生物進(jìn)程（biological process）9 類（47.37%）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）3 類（15.79%）和分子功能（molecularfunction）7 類（36.84%）（圖2）。

對(duì)所有DEG 進(jìn)行GO 富集分析，以獲得其潛在的功能注釋。GO 富集結(jié)果顯示，DEG 主要集中在生物進(jìn)程，包括細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程（cellular proteinmetabolic process，GO：0044267）、細(xì)胞酰胺代謝過(guò)程（cellular amide metabolic process，GO：0043603）、酰胺生物合成過(guò)程（amide biosynthetic process，GO：0043604）、肽類代謝過(guò)程（peptide metabolic process，0006412）（圖3）。

有1 166 條DEG 注釋到KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，分屬于115 個(gè)代謝通路，其中注釋序列數(shù)量較多的途徑分別為代謝途徑（metabolism）、遺傳信息處理（genetic informationprocessing）和環(huán)境信息處理（environmentalinformation processing）等通路（圖4）。

KEEG 富集分析顯示，表達(dá)上調(diào)的DEG 主要在ABC 運(yùn)輸工具（ABC transporters，ko02010）、核糖體（ribosome，ko03010）和群體感應(yīng)（quorum sensing，ko02024）等通路顯著性富集（圖5A）；而表達(dá)下調(diào)的DEG 主要在糖酵解/糖生成（glycolysis/gluconeogenesis，ko00010）、半乳糖代謝（galactose metabolism，ko00052）和丙酮酸代謝（pyruvate metabolism，ko00620）等通路顯著性富集（圖5B）。

2.4 毒力相關(guān)DEG聚類分析

為探究在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活期間無(wú)乳鏈球菌毒力相關(guān)基因的表達(dá)水平，將轉(zhuǎn)錄組中DEG 與毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，篩選得到27 個(gè)無(wú)乳鏈球菌毒力相關(guān)DEG，其中22 個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，5 個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖6）。這些DEG 可分為以下8 個(gè)大類：（1）毒素（toxin），包括：cylE（+3.53）、cylK（ +3.43）、cpsX（ +3.33）、neuA（ +2.92）、cylF（+2.80）、t ig/ropA（+2.68）、cylB（+2.26）、cpsB（+2.20）、cfb（-4.65）、eno（-3.68）、gapdh（-2.44）、psaA（-1.21）和cba（-1.18）；（2）黏附（adherence），包括：fbsA（+8.65）、fbsB（+7.08）、sip（+6.28）、pa?vA（+5.77）和cylX（+5.69）；（3）蛋白酶（protease），包括：cylA（+3.87）和acpC（+3.58）；（4）酶類（enzyme），包括：htrA（+4.35）和cylG（+3.34）；（5）免疫活性抗原（immunoreactive antigen），包括：cylJ（+4.24）和cylI（+3.92）；（6）抗吞噬（antiphagocytosis）：cppA（+5.50）；（7）內(nèi)毒素（endotoxin）：cylD（+4.93）；（8）免疫逃逸（immune evasion）：cylZ（+4.32）。

此外，在非差異表達(dá)基因中，比對(duì)到18 個(gè)無(wú)乳鏈球菌毒力基因，包括cpsC～cpsK、groEL、groEL、neuB、rmlA、tuf、galU、rfbD、rmlB、hylB 和rmlC（表3）。

2.5 定量驗(yàn)證

選擇上述DEG 中的8 個(gè)基因（sip、fbsA、cylB、cylD、cylE、neuA、cpsB 和cfb）分別在小鼠傳代巨噬細(xì)胞和羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞進(jìn)行定量表達(dá)驗(yàn)證。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，在RAW264.7 內(nèi)存活的無(wú)乳鏈球菌中，上述8 個(gè)基因的log2 （fold change）分別為+8.44、+7.64、+7.51、+6.14、+5.99、+5.58、+4.08 和-2.69，且表達(dá)變化趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致（圖7A）。在羅非魚(yú)原代巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的無(wú)乳鏈球菌中，上述8個(gè)基因的log2（ fold change）分別為+8.45、+8.02、+5.86、+7.93、+5.20、+6.45、+3.77 和-3.18，其變化趨勢(shì)與小鼠巨噬細(xì)胞中的相似（圖7B）。

3 討論

本研究將無(wú)乳鏈球菌HN016 菌株與小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 共孵育，待細(xì)菌被吞入后，收集胞內(nèi)細(xì)菌提取RNA 并進(jìn)行RNA-Seq。通過(guò)差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活期間出現(xiàn)大量的基因表達(dá)變化，進(jìn)一步的GO 和KEGG 功能富集分析結(jié)果表明，DEG 主要在代謝相關(guān)通路顯著性富集。這一結(jié)果與在化膿性鏈球菌、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuisi）和多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）的研究中所發(fā)現(xiàn)的一致，表明在胞內(nèi)存活期間，病原菌多數(shù)上調(diào)表達(dá)基因同代謝相關(guān)［14-16］。富集通路包括ABC 運(yùn)輸體，它可以通過(guò)離子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入/輸出來(lái)促進(jìn)細(xì)菌的代謝和毒力［17］。這一結(jié)果說(shuō)明無(wú)乳鏈球菌可能通過(guò)改變新陳代謝通路來(lái)利用外界資源以及適應(yīng)變化的環(huán)境條件。

此外，我們還將DEG 與無(wú)乳鏈球菌毒力因子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)了27 個(gè)毒力相關(guān)DEG。其中，篩選到的毒力基因cfb 負(fù)責(zé)編碼28.4 ku 的蛋白分子CAMP 因子，CAMP 一直被認(rèn)為是一種重要的致病因子：當(dāng)給兔或小鼠注射純化的CAMP 時(shí)，會(huì)導(dǎo)致兔或小鼠立即死亡［18-19］。目前，對(duì)CAMP 致病機(jī)制的理解包括其低聚物能夠在宿主膜上形成離散孔，以及它與糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白的結(jié)合從而促進(jìn)細(xì)胞裂解［20］。該基因的下調(diào)表達(dá)表明，在無(wú)乳鏈球菌進(jìn)入巨噬細(xì)胞的早期階段（1 h），無(wú)乳鏈球菌不會(huì)立即分泌CAMP 來(lái)裂解細(xì)胞，得以在細(xì)胞中潛伏一段時(shí)間，以“特洛伊木馬”形式突破血腦屏障，進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在無(wú)乳鏈球菌中，neuA 與neuB、neuC、neuD 一同編碼唾液酸酶。唾液酸酶能夠特異性地催化和激活無(wú)乳鏈球菌莢膜多糖表面的唾液酸，從而抑制補(bǔ)體替代途徑中C3b 在細(xì)菌表面的沉積。這種抑制能夠?qū)е戮奘杉?xì)胞和中性粒細(xì)胞的吞噬作用下降，進(jìn)而提高無(wú)乳鏈球菌在宿主體內(nèi)的存活率［21-22］。我們推測(cè)，neuA 的顯著上調(diào)表達(dá)是無(wú)乳鏈球菌在與巨噬細(xì)胞孵育期間抗吞噬作用的結(jié)果。此外，在篩選到的27 個(gè)毒力基因中包含5 個(gè)黏附相關(guān)基因，分別是fbsA、fbsB、sip、pavA 和cylX。其中，F(xiàn)bsA 主要被認(rèn)為可以促進(jìn)黏附，而FbsB 被證明是入侵人體細(xì)胞所必需的［23-24］。而這些黏附相關(guān)基因的顯著上調(diào)表達(dá)，原因可能在于細(xì)菌與巨噬細(xì)胞孵育時(shí)間較短，即有些基因在黏附入侵過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，入侵細(xì)胞后還未來(lái)得及回調(diào)。除DEG 中的毒力相關(guān)基因外，我們?cè)诜遣町惐磉_(dá)基因中也比對(duì)到了18 個(gè)毒力基因，其中有9 個(gè)毒力基因（cpsC～cpsK），它們屬于莢膜多糖合成操作子，而由cps 基因簇編碼的莢膜多糖是無(wú)乳鏈球菌的主要毒力因子［25］。有研究者通過(guò)對(duì)cps 基因簇的插入誘變，構(gòu)建了1 個(gè)非包囊突變體（Δcps），Δcps 在羅非魚(yú)感染過(guò)程中表現(xiàn)出毒力的明顯減弱［26-27］。在本研究中，這9 個(gè)cps 基因雖然全部呈上調(diào)趨勢(shì)，但其差異并不顯著，我們推測(cè)是由于孵育時(shí)間較短，無(wú)乳鏈球菌還未來(lái)得及完全上調(diào)cps 基因簇的表達(dá)水平。因此，在后續(xù)的研究中，可以增加多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)，從而更加全面系統(tǒng)地展現(xiàn)無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活期間轉(zhuǎn)錄組水平的變化情況。

本研究通過(guò)RNA-Seq，初步揭示了被小鼠巨噬細(xì)胞吞入后無(wú)乳鏈球菌轉(zhuǎn)錄組的變化，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)壓力影響著無(wú)乳鏈球菌的1 215 個(gè)基因的表達(dá)，這些DEG 顯著富集于一些與代謝、生物合成相關(guān)的GO 類別和KEGG 途徑，這些途徑與無(wú)乳鏈球菌的生命活動(dòng)密切相關(guān)。推測(cè)無(wú)乳鏈球菌在被巨噬細(xì)胞吞入后，巨噬細(xì)胞內(nèi)的有害環(huán)境增強(qiáng)了無(wú)乳鏈球菌的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，刺激了無(wú)乳鏈球菌的能量運(yùn)輸和對(duì)巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的次生代謝物代謝的能力，并且提高了毒力相關(guān)基因的表達(dá)水平。本研究結(jié)果可為進(jìn)一步解析無(wú)乳鏈球菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn) References

［1］ ELLIOTT J A，F(xiàn)ACKLAM R R，RICHTER C B. Wholecellprotein patterns of nonhemolytic group B，type Ib，streptococciisolated from humans，mice，cattle，frogs，and fish［J］. JClin Microbiol，1990，28（3）：628-630.

［2］ COUREUIL M，LéCUYER H，BOURDOULOUS S，et al.A journey into the brain：insight into how bacterial pathogenscross blood-brain barriers［J］.Nat Rev Microbiol，2017，15（3）：149-159.

［3］ DANEMAN R，PRAT A. The blood-brain barrier［J/OL］.Cold Spring Harb Perspect Biol， 2015，7（1）：a020412［2024-04-11］.https：//doi.org/10.1101/cshperspect.a020412.

［4］ SEALE A C，BIANCHI-JASSIR F，RUSSELL N J，et al.Estimatesof the burden of group B streptococcal disease world‐wide for pregnant women，stillbirths，and children［J］.Clin InfectDis，2017，65（suppl 2）：200-219.

［5］ EVANS J J， KLESIUS P H， SHOEMAKER C A. An overviewof Streptococcus in warm water fish［J］. Aquaculture，2006， 7： 10-13.

［6］ BENMIMOUN B，PAPASTEFANAKI F，PéRICHON B，et al.An original infection model identifies host lipoprotein importas a route for blood-brain barrier crossing［J/OL］. NatCommun，2020，11：6106［2023-04-11］. https：//doi. org/10.1038/s41467-020-19826-2.

［7］ SHABAYEK S，SPELLERBERG B. Acid stress responsemechanisms of group B streptococci［J/OL］.Front Cell InfectMicrobiol，2017，7：395［2023-04-11］. https：//doi. org/10.3389/fcimb.2017.00395.

［8］ FLANNAGAN R S，COSíO G，GRINSTEIN S.Antimicrobialmechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies［J］.Nat Rev Microbiol，2009，7（5）：355-366.

［9］ RUSSELL D G，VANDERVEN B C，GLENNIE S，et al.The macrophage marches on its phagosome：dynamic assaysof phagosome function［J］. Nat Rev Immunol，2009，9（8）：594-600.

［10］ KAPLAN E L，CHHATWAL G S，ROHDE M. Reducedability of penicillin to eradicate ingested group A streptococcifrom epithelial cells：clinical and pathogenetic implications［J］.Clin Infect Dis，2006，43（11）：1398-1406.

［11］ DREVETS D A，JELINEK T A，F(xiàn)REITAG N E. Listeriamonocytogenes-infected phagocytes can initiate central nervoussystem infection in mice［J］.Infect Immun，2001，69（3）：1344-1350.

［12］ NIZET V，KIM K S，STINS M，et al.Invasion of brain microvascularendothelial cells by group B streptococc［i J］.Infect Immun，1997，65（12）：5074-5081.

［13］ CUMLEY N J，SMITH L M，ANTHONY M，et al. TheCovS/CovR acid response regulator is required for intracellularsurvival of group B Streptococcus in macrophages［J］.InfectImmun，2012，80（5）：1650-1661.

［14］ HERTZéN E，JOHANSSON L，KANSAL R，et al.IntracellularStreptococcus pyogenes in human macrophages display analtered gene expression profile［J/OL］. PLoS One，2012，7（4）：e35218［2023-04-11］. https：//doi. org/10.1371/journal.pone.0035218.

［15］ JIN H，WAN Y，ZHOU R，et al.Identification of genes transcribedby Haemophilus parasuisin necrotic porcine lungthrough the selective capture of transcribed sequences（SCOTS）［J］.Environ Microbiol，2008，10（12）：3326-3336.

［16］ GUO D C，LU Y，ZHANG A Q，et al.Identification of genestranscribed by Pasteurella multocida in rabbit livers throughthe selective capture of transcribed sequences［J］. FEMS MicrobiolLett，2012，331（2）：105-112.

［17］ DAVIDSON A L， DASSA E， ORELLE C， et al. Structure，function， and evolution of bacterial ATP-binding cassettesystems［J］. Microbiol Mol Biol Rev， 2008， 72（2）：317-364.

［18］ LANG S H，PALMER M. Characterization of Streptococcusagalactiae CAMP factor as a pore-forming toxin［J］. J BiolChem，2003，278（40）：38167-38173.

［19］ SKALKA B，SMOLA J. Lethal effect of CAMP-factor andUBERIS-factor：a new finding about diffusible exosubstancesof Streptococcus agalactiae and Streptococcus uberis ［J］.Zentralbl Bakteriol A，1981，249（2）：190-194.

［20］ HENSLER M E，QUACH D，HSIEH C J，et al.CAMP factoris not essential for systemic virulence of group B Strepto?coccus［J］.Microb Pathog，2008，44（1）：84-88.

［21］ HAFT R F，WESSELS M R，MEBANE M F，et al.Characterizationof cpsF and its product CMP- N-acetylneuraminicacid synthetase，a group B streptococcal enzyme that can functionin K1 capsular polysaccharide biosynthesis in Escherichiacoli［J］.Mol Microbiol，1996，19（3）：555-563.

［22］ WANG E L，WANG K Y，CHEN D F，et al.Molecular cloningand bioinformatic analysis of the Streptococcus agalactiaeneuA gene isolated from tilapia［J］. Genet Mol Res，2015，14（2）：6003-6017.

［23］ SCHUBERT A，ZAKIKHANY K，PIETROCOLA G，et al.The fibrinogen receptor FbsA promotes adherence of Strepto?coccus agalactiae to human epithelial cells［J］. Infect Immun，2004，72（11）：6197-6205.

［24］ GUTEKUNST H，EIKMANNS B J，REINSCHEID D J.The novel fibrinogen-binding protein FbsB promotes Strepto?coccus agalactiae invasion into epithelial cells［J］. Infect Immun，2004，72（6）：3495-3504.

［25］ YAMAMOTO S，MIYAKE K，KOIKE Y，et al. Molecularcharacterization of type-specific capsular polysaccharide biosynthesisgenes of Streptococcus agalactiae type Ia［J］.J Bacteriol，1999，181（17）：5176-5184.

［26］ ZHANG D F，KE X L，LIU Z G，et al.Capsular polysaccharideof Streptococcus agalactiaeis an essential virulence factorfor infection in Nile tilapia （Oreochromis niloticus Linn.）［J/OL］. J Fish Dis，2018：jfd. 12935［2023-04-11］. https：//doi.org/10.1111/jfd.12935.

［27］ CIESLEWICZ M J，CHAFFIN D，GLUSMAN G，et al.Structural and genetic diversity of group B streptococcus capsularpolysaccharides［J］. Infect Immun，2005，73（5）：3096-3103.

（責(zé)任編輯：邊書(shū)京）

基金項(xiàng)目：嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室科研項(xiàng)目（NT2021008）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)（CARS-46）