摘要 為探求牛支原體凍干菌的有效保護(hù)性物質(zhì)，利用四因素四水平正交試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)凍干后牛支原體HB150 的活菌數(shù)，篩選并評(píng)價(jià)脫脂乳、蔗糖、甘露醇、葡聚糖、海藻糖、尿素、BSA、賴(lài)氨酸等物質(zhì)對(duì)牛支原體凍干后活菌率的影響，并最終確定不同保護(hù)制劑的最佳濃度及配比。結(jié)果顯示，最佳的凍干保護(hù)劑配比（m/V）為：脫脂乳15%、蔗糖4.0%、甘露醇4.0%、葡聚糖3.0%、海藻糖2.0%、尿素1.5%、BSA 1.0%、賴(lài)氨酸0.3%。該配方于-40 ℃、12 Pa 條件下冷凍干燥20 h，能夠保持牛支原體的最高活菌率，達(dá)到（55.2±2.1）%。結(jié)果表明，所篩選的動(dòng)干保護(hù)劑具有較好的保護(hù)作用，可以應(yīng)用于牛支原體的實(shí)際凍干操作。

關(guān)鍵詞 牛支原體； 冷凍干燥； 保護(hù)劑； 正交試驗(yàn)； 疫苗

中圖分類(lèi)號(hào) S852.62 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）06-0282-07

牛支原體（Mycoplasma bovis）是牛呼吸道疾病綜合征的主要病原體之一［1］，能夠引起牛的支氣管肺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道疾病等多種癥狀，致死率可高達(dá)50%［2］，給全球養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3］。2008 年我國(guó)首次在湖北省新購(gòu)牛群中具有呼吸道疾病癥狀牛體內(nèi)分離鑒定到該病原，隨后全國(guó)多個(gè)地方報(bào)道了運(yùn)輸應(yīng)激誘發(fā)的牛支原體肺炎和新生犢牛的牛支原體肺炎［4］。隨著牛支原體對(duì)抗生素耐藥性的逐年上升［5］，該病的防治也越來(lái)越困難。疫苗免疫成為了預(yù)防和控制牛支原體病的重要手段。為預(yù)防該病，筆者所在課題組前期已開(kāi)發(fā)出了牛支原體減毒活疫苗（HB150 株），臨床試驗(yàn)證實(shí)具有較好的保護(hù)效力，但如何保持疫苗株凍干后的高存活率成為問(wèn)題。

凍干保護(hù)劑是疫苗研發(fā)過(guò)程中的重要組成部分。有效的凍干保護(hù)劑可以改變生物制品由于冷凍干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境所帶來(lái)的菌體傷害，盡可能保持原有的生理、生物活性。目前常用的凍干保護(hù)劑成分主要有脫脂奶、山梨醇、甘油、海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、乳糖、抗壞血酸、甘露醇等［6-8］。

本研究以海藻糖、蔗糖、脫脂奶、山梨醇、尿素、牛血清白蛋白等16 種物質(zhì)為基礎(chǔ)，利用正交試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)［9］，以牛支原體凍干后的存活率為指標(biāo)，對(duì)牛支原體疫苗株冷凍干燥時(shí)起保護(hù)性作用的物質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并確定最佳濃度配比，旨在篩選牛支原體疫苗株在凍干條件下的有效保護(hù)性物質(zhì)，并為后期牛支原體凍干疫苗株HB150 的生產(chǎn)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1）牛支原體HB150 株。由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)反芻動(dòng)物病原研究室制備并保存。

2）PPLO 液體培養(yǎng)基。PPLO Broth 10.5 g，酵母浸出物2.5 g，丙酮酸鈉0.5 g，純水定容至500 mL，121 °C 滅菌15 min 后，加入無(wú)菌馬血清50 mL，10 ×MEM 5 mL，青霉素鈉溶液 5 mL（8 萬(wàn) IU/ mL），1%酚紅溶液0.5 mL。

3）PPLO 固體培養(yǎng)基。在PPLO 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加1.5% 瓊脂。

4）保護(hù)劑配料。海藻糖、葡聚糖、山梨醇為阿拉丁試劑（上海）有限公司產(chǎn)品；尿素、蔗糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；脫脂乳、甘露醇為BioFroxx公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白為biosharp 公司產(chǎn)品；賴(lài)氨酸為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 菌種的制備

1）牛支原體HB150 株菌液的制備。將保存的牛支原體接種于PPLO 液體培養(yǎng)基中，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h 復(fù)壯后，再按1∶100 比例接種于PPLO 液體培養(yǎng)基，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃條件下厭氧靜置培養(yǎng)40～44 h，保存菌液備用。

2）凍干菌粉的制備。將培養(yǎng)后的牛支原體菌液，于4.0 ℃、12 000 r/min 條件下離心30 min，收集沉淀，分別于含有不同組分的候選凍干保護(hù)劑中重懸。將重懸后的菌液分裝后置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥20 h，得到凍干菌粉。隨機(jī)抽取3 瓶檢測(cè)有效活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3 活菌數(shù)檢測(cè)

采用PPLO 固體平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。將凍干前菌液做10 倍梯度稀釋?zhuān)謩e從10-4、10-5、10-6稀釋度各取100 μL 接種于PPLO 固體培養(yǎng)基上，于5% CO2、（37.0±1.0） ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h 后，取菌落數(shù)在20～200 個(gè)的稀釋度進(jìn)行計(jì)數(shù)；凍干后的菌粉用生理鹽水恢復(fù)至凍干前體積，計(jì)數(shù)方法同上。

凍干后活菌率計(jì)算方法：活菌率=凍干后2 mL菌懸液的活菌總數(shù)/凍干前2 mL 菌懸液的活菌總數(shù)×100%。

1.4 凍干保護(hù)劑篩選及凍干保護(hù)程序

1） 凍干保護(hù)劑主成分的篩選。為研究不同質(zhì)量/體積的海藻糖、葡聚糖、蔗糖和脫脂乳對(duì)牛支原體HB150 株凍干后細(xì)菌存活能力的影響，設(shè)計(jì)四因素四水平正交試驗(yàn)，各因素水平如表1 所示。

依據(jù)表1，利用SPSSAU 系統(tǒng)得到海藻糖、葡聚糖、蔗糖和脫脂乳的四因素四水平正交設(shè)計(jì)表，如表2 所示。

將不同保護(hù)性物質(zhì)依照表2 進(jìn)行配比后，制備用于凍干的保護(hù)劑配方，與菌株混合，制備凍干菌粉。計(jì)算凍干菌粉的活菌率，最高值所對(duì)應(yīng)的組合為最佳主成分配比。

2） 凍干保護(hù)劑輔成分的篩選。依據(jù)正交試驗(yàn)（材料與方法中“1.4”）的結(jié)果，通過(guò)單因素試驗(yàn)在所確定的主成分配比的基礎(chǔ)上，逐步按比例添加以下物質(zhì)。

①向主成分中分別添加1%、2%、3%、4%、5%（m/V）含量的山梨醇、甘露醇和1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%（m/V）的聚乙二醇8000，與菌株混合，凍干后計(jì)算活菌率。對(duì)比這3 種醇類(lèi)物質(zhì)的凍干保護(hù)效果，確定最佳保護(hù)性物質(zhì)及配比。

②在添加醇類(lèi)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，分別添加1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0% （m/V）的半乳糖和0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（m/V）的尿素以及0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%（m/V）的抗壞血酸，與菌株混合，凍干后計(jì)算活菌率。對(duì)比半乳糖、尿素和抗壞血酸3 種不同性質(zhì)物質(zhì)對(duì)凍干后活菌率的提升效果，確定最佳保護(hù)性物質(zhì)及配比。

③在此基礎(chǔ)上再分別添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%（m/V）的酪蛋白、BSA 和1.0%、1.5%、2%、2.5%（m/V）的NBS，與菌株混合，凍干后計(jì)算活菌率。對(duì)比這3 種物質(zhì)的凍干保護(hù)效果，確定最佳蛋白類(lèi)的保護(hù)性物質(zhì)及配比。

④ 最后分別添加0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%（m/V）的甘氨酸、賴(lài)氨酸和精氨酸，凍干后計(jì)算活菌率；對(duì)比3 種物質(zhì)的凍干保護(hù)效果，確定最佳氨基酸類(lèi)的保護(hù)性物質(zhì)及配比。最終確定輔成分及其最佳配比。

3）凍干保護(hù)程序。使用筆者所在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)凍干保護(hù)程序參數(shù)：-40 ℃、12 Pa 條件下冷凍干燥20 h對(duì)牛支原體進(jìn)行凍干。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用單因素方差分析來(lái)檢測(cè)組間的顯著性差異。采用以下方法判定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性：*表示有差異，但不顯著（Pgt;0.05）， **表示存在顯著性差異（Plt;0.01）， ***表示存在極顯著差異（Plt;0.001），****表示存在極極顯著差異（Plt;0.000 1）。誤差條表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干保護(hù)劑主成分篩選

通過(guò)四因素四水平正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)凍干保護(hù)劑的主成分進(jìn)行篩選，結(jié)果如圖1 所示， G6 組對(duì)應(yīng)的凍干菌粉的活菌率最高，為（32.7±1.5）%，所對(duì)應(yīng)的成分及配比為4.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖及15% 脫脂乳。

計(jì)算得到A、B、C 和D 四因素的極差R 依次為10.33、3.48、8.84 和11.41。極差越大表明該因素對(duì)活菌率的影響越顯著，因此可知脫脂乳對(duì)牛支原體凍干后活菌率影響最大，其次為海藻糖、蔗糖，葡聚糖對(duì)凍干后活菌率影響作用最小。k 值為正交試驗(yàn)各水平下的指標(biāo)總和，k 值越高表明該因素對(duì)活菌率的影響越顯著。由表3 中k 值可知，牛支原體凍干保護(hù)劑主成分最佳組合為A1B2C1D4，即2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳，將該配方命名為G17。在該配方條件下重復(fù)3 次試驗(yàn)，得到的牛支原體HB150 株凍干后活菌率為（33.6±1.1）%，高于正交試驗(yàn)組（G6 組）的凍干后活菌率［（32.7±1.5）%］。

2.2 凍干保護(hù)劑輔成分篩選結(jié)果

1） 添加3 種不同的醇類(lèi)物質(zhì)凍干后活菌率。在2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳的基礎(chǔ)上，逐一添加不同含量的甘露醇（圖2A）、山梨醇（圖2B）和聚乙二醇8000（圖2C），結(jié)果顯示，添加4% 的甘露醇和山梨醇凍干后活菌率最高，分別為（35.4±1.2）%和（32.7±0.7）%；聚乙二醇8000 的添加量與活菌率呈負(fù)相關(guān)，在1% 時(shí)活菌率最高，為（24.1±1.3）%。表明3 種醇類(lèi)物質(zhì)中4.0% 甘露醇對(duì)牛支原體凍干保護(hù)效果好于4.0% 山梨醇和1.0% 聚乙二醇8000，且添加聚乙二醇8000 作為保護(hù)性物質(zhì)會(huì)降低牛支原體凍干保護(hù)效率。

2） 添加不同含量的半乳糖、尿素和抗壞血酸的牛支原體凍干后活菌率。在2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎(chǔ)上，添加不同含量的半乳糖（圖3A）、尿素（圖3B），結(jié)果顯示，牛支原體凍干后2.0% 半乳糖凍干后活菌率最高，為（33.6±1.2）%，與本文“2.2 1）”中添加4.0%甘露醇凍干后保護(hù)效果無(wú)差異（Pgt;0.05）；1.5% 的尿素凍干后活菌率為（44.1±1.6）%，較其他含量的尿素凍干保護(hù)效果更好。而添加抗壞血酸（圖3C）的保護(hù)劑配方凍干后活菌率在抗壞血酸占比為1.2%時(shí)，活菌率最高僅為（24.6±2.4）%，繼續(xù)增加抗壞血酸的比例，則會(huì)導(dǎo)致制品溶液產(chǎn)生絮狀物，改變?cè)袃銎返奈锢硇誀?，進(jìn)而降低制品中牛支原體的活菌率。

3）添加3 種不同的蛋白類(lèi)物質(zhì)凍干后活菌率。在1.5% 尿素、2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎(chǔ)上，添加不同含量的蛋白類(lèi)保護(hù)性物質(zhì)，凍干后結(jié)果顯示：1.0%BSA（圖4A）凍干活菌最高為（52.3±1.8）%；0.5%酪蛋白（圖4B）凍干活菌最高為（32.5±1.5）%；2.0%NBS（圖4C）活菌率凍干活菌最高為（35.9±2.1）%。酪蛋白和NBS 的對(duì)牛支原體的凍干保護(hù)效果不如BSA。

4）添加3 種不同的氨基酸類(lèi)物質(zhì)的牛支原體凍干后活菌率。在1.0% BSA、1.5% 尿素、2.0% 海藻糖、3.0% 葡聚糖、4.0% 蔗糖、15% 脫脂乳、4.0% 甘露醇的基礎(chǔ)上，繼續(xù)添加含量為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5% 的甘氨酸（圖5A）、賴(lài)氨酸（圖5B）和精氨酸（圖5C），凍干后計(jì)算活菌率；其中添加0.3% 甘氨酸、0.3% 賴(lài)氨酸、0.6% 精氨酸活菌率最高，分別為（47.2±3.0）% 、（55.2±2.1）% 和（36.9±1.0）% 。綜上所述，在本文“2.2 3）”的配方基礎(chǔ)上添加0.3% 的賴(lài)氨酸能夠最顯著提高牛支原體的凍干后活菌率。

2.3 最佳凍干保護(hù)劑配方對(duì)凍干物外形的影響及其保護(hù)效果的穩(wěn)定性

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，我們初步確定了牛支原體凍干保護(hù)劑的最佳配方，為15% 脫脂乳、4.0% 蔗糖、4.0% 甘露醇、3.0% 葡聚糖、2.0% 海藻糖、1.5% 尿素、1.0% BSA、0.3% 賴(lài)氨酸。用該配方進(jìn)行牛支原體凍干，凍干物外觀呈淡黃色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶身脫離（圖6）。

確定牛支原體最佳保護(hù)劑配方即15% 脫脂乳、4.0% 蔗糖、4.0% 甘露醇、3.0% 葡聚糖、2.0% 海藻糖、1.5% 尿素、1.0%BSA、0.3% 賴(lài)氨酸后，將牛支原體凍干物置于-20 ℃存放，以確定凍干保護(hù)劑保護(hù)效果的穩(wěn)定性。在凍干后30、90、180 d，分別隨機(jī)取3 瓶?jī)龈傻呐Ｖгw進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果如表4 所示，凍干后活菌率在180 d 內(nèi)隨著時(shí)間變化基本無(wú)衰減，證明我們篩選出的牛支原體最佳凍干保護(hù)劑組合具有較高的穩(wěn)定性。

3 討論

添加不同類(lèi)型的保護(hù)劑可有效提高牛支原體HB150 株凍干后的存活率，推測(cè)凍干保護(hù)劑對(duì)菌株微環(huán)境的調(diào)節(jié)、降低菌體凍干損傷、提高菌體抗凍能力等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，糖類(lèi)物質(zhì)能在冷凍過(guò)程中增加蛋白質(zhì)自由能從而抑制蛋白變性，又能在干燥脫水過(guò)程中取代蛋白質(zhì)與水分子間的氫鍵來(lái)穩(wěn)定蛋白，并且不含還原基，不會(huì)使生物制品發(fā)生蛋白質(zhì)褐變反應(yīng)從而變質(zhì)失活［10］；但葡聚糖、聚乙二醇8000這2 種聚合物類(lèi)保護(hù)劑在牛支原體的冷凍干燥中的作用并不明顯［11］，且新生牛血清（NBS）的保護(hù)效果不如同為聚合物的牛血清白蛋白（BSA）保護(hù)效果明顯。

多羥基醇能與菌體細(xì)胞膜的自由基通過(guò)水合作用降低游離水含量，減少低溫下晶核的形成，穩(wěn)定磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而起到保護(hù)作用［12］。山梨醇與甘露醇互為同分異構(gòu)體，在本研究中，添加甘露醇作為牛支原體凍干保護(hù)性物質(zhì)對(duì)提升凍干后活菌率的效果較山梨醇明顯。

尿素作為低溫保護(hù)劑，能夠減緩凍品溫度降低速度，有效保護(hù)活菌；抗壞血酸作為抗氧化劑在凍干過(guò)程中能夠防止制品中的有效成分在冷凍干燥過(guò)程中發(fā)生氧化變性，從而保護(hù)菌體內(nèi)的酶活性［12］，但抗血酸添加量超過(guò)1.2% 時(shí)，制品溶液產(chǎn)生絮狀物，物理性狀發(fā)生改變，導(dǎo)致凍品中牛支原體的活菌率降低。

半乳糖作為凍干保護(hù)劑的一種，在制品脫水干燥過(guò)程前就已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生不可逆變性，在本研究中作為牛支原體保護(hù)劑只能提供十分有限的保護(hù)效力。因此，筆者設(shè)想使用蛋白類(lèi)保護(hù)性物質(zhì)，通過(guò)提高制品溶液中的蛋白濃度來(lái)降低牛支原體在冷凍干燥中的死亡率。BSA 作為一種球蛋白，在凍干過(guò)程中作為填充劑為凍干制品提供支撐，本研究結(jié)果表明，相比酪蛋白和NBS，BSA 在牛支原體凍干過(guò)程中顯示出最好的保護(hù)效果。另外，對(duì)于凍干保護(hù)劑中添加的氨基酸類(lèi)物質(zhì)，本研究中使用的賴(lài)氨酸較甘氨酸、精氨酸能更好地控制凍干制品在冷凍干燥過(guò)程中溶液pH 的變化，從而維持凍干制品的活性。

本研究通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)凍干保護(hù)劑的主成分進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)保護(hù)劑主成分對(duì)牛支原體凍干后存活率的影響順序分別為：脫脂乳gt;海藻糖gt;蔗糖gt;葡聚糖。通過(guò)單因素試驗(yàn)分析12 種不同物質(zhì)對(duì)牛支原體凍干后活菌率的影響，篩選到甘露醇、尿素、BSA 等幾種對(duì)牛支原體凍干后活菌率有明顯提升作用的輔助物質(zhì)成分，并確定了在主成分上添加4.0% 甘露醇、1.5% 尿素、1.0% BSA 以及0.3% 賴(lài)氨酸，最終凍干后活菌率能夠達(dá)到（55.2±2.1）%；同時(shí)也證實(shí)復(fù)合保護(hù)劑因各種物質(zhì)之間存在互補(bǔ)作用，相比較單一保護(hù)劑能擁有更高的保護(hù)作用。有其他研究指出，豬肺炎支原體在凍干后6 a 仍能存活［13］；雞敗血支原體和滑膜支原體在凍干后分別獲得了10% 和90% 的存活率［14］，與這些結(jié)果比較，本研究篩選出的凍干保護(hù)性物質(zhì)保護(hù)牛支原體凍干后達(dá)到的存活率處于較高水平，可為后期牛支原體凍干保護(hù)劑配方優(yōu)化提供物質(zhì)選擇的理論參考依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：邊書(shū)京）

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2023BCF01038）；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉牛/牦牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-37）