摘要 為闡明N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（NAT）在無(wú)乳鏈球菌致病過(guò)程中的作用，利用同源重組法構(gòu)建野生株HN016的nat 基因缺失株Δnat，并比較野生株和缺失株的生長(zhǎng)、形態(tài)、黏附入侵細(xì)胞能力、抗吞噬能力、全血存活能力和致病力。結(jié)果顯示，Δnat 的溶血能力降低，并且nat 缺失導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)腦細(xì)胞的黏附和入侵能力下降，并增加了細(xì)菌對(duì)血液殺傷和吞噬細(xì)胞吞噬的敏感性。羅非魚(yú)感染試驗(yàn)結(jié)果顯示，nat 基因缺失株Δnat（2×108 CFU/尾，致死率為36%）對(duì)羅非魚(yú)的致死力顯著低于野生株HN016（2×108 CFU/尾，致死率為85%）。羅非魚(yú)感染12 h 后，與野生對(duì)照株相比，Δnat 突變株在血液、脾臟和腦組織中載菌量顯著降低。研究表明，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶參與無(wú)乳鏈球菌抵抗宿主血液和吞噬細(xì)胞的清除，并協(xié)助細(xì)菌對(duì)羅非魚(yú)組織的入侵和定植。

關(guān)鍵詞 無(wú)乳鏈球菌； N-乙酰轉(zhuǎn)移酶； 基因缺失； 生物學(xué)特性； 羅非魚(yú)

中圖分類(lèi)號(hào) S917.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1000-2421（2024）06-0289-08

無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）是一種革蘭氏染色呈紫色的鏈狀球菌，又稱(chēng)B 族鏈球菌（group B streptococcus，GBS）。近年來(lái)，無(wú)乳鏈球菌已成為水生環(huán)境中的主要病原體之一，能感染許多養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，導(dǎo)致敗血癥和腦膜炎［1］，給養(yǎng)殖業(yè)尤其是羅非魚(yú)（Oreochromis spp.）養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)菌發(fā)揮致病作用的前提是能夠響應(yīng)宿主體內(nèi)微環(huán)境的變化，而這種響應(yīng)依賴(lài)于蛋白翻譯后的修飾［2］。乙酰化修飾是蛋白翻譯后修飾中最保守的方式之一。乙酰化可以調(diào)節(jié)RcsB 蛋白的活性，從而影響大腸桿菌（Escherichia coli）在酸脅迫下的存活和鞭毛合成［3］。乙?；倪^(guò)程需要乙酰轉(zhuǎn)移酶的參與，乙酰轉(zhuǎn)移酶可以催化乙?；鶑囊阴］o酶A 轉(zhuǎn)移到底物，并通過(guò)催化底物的乙?；瑓f(xié)調(diào)細(xì)菌的各種生物過(guò)程［7］。已鑒定的乙酰轉(zhuǎn)移酶被分為3 個(gè)家族，分別為GCN5 （general control non-repressed 5 protein，GCN5）、CBP/p300 （cyclic-AMP response bindingprotein-binding protein， CBP） 和MYST （Moz，Ybf2， Sas2 和Tip60， MYST），其中GCN5 家族乙酰轉(zhuǎn)移酶是細(xì)菌中最主要的乙酰轉(zhuǎn)移酶［5］。GNAT（GCN5-related N-acetyltransferase，GNAT）將乙酰輔酶A 的乙?；D(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)的N-氨基上，因此稱(chēng)為N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。

N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌耐藥性和代謝等多種生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。例如，在結(jié)核分枝桿菌（My?cobacterium tuberculosis）中，具有N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性的Eis 蛋白可以通過(guò)乙?；揎棸被擒疹?lèi)抗生素，從而削弱其與核糖體的結(jié)合，導(dǎo)致耐藥性［6］；在炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthraci）中，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶可以乙?；蜏缁铈溍顾兀瑢?dǎo)致細(xì)菌抵抗鏈霉素的抑制和殺滅［7］；在牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingi?valis）中，N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠調(diào)節(jié)牙齦痛蛋白酶的激活和成熟［8］。目前，在鏈球菌中關(guān)于乙酰轉(zhuǎn)移酶的研究并不多見(jiàn)。已報(bào)道的相關(guān)研究包括氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶CAT 可以賦予糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和A 族鏈球菌氯霉素抗性，并且將CAT 基因重組到質(zhì)粒上用于科學(xué)研究［9］；由無(wú)乳鏈球菌的neuD 基因編碼的O-乙酰轉(zhuǎn)移酶是細(xì)菌莢膜多糖唾液酸所必需的［10］，而無(wú)乳鏈球菌中的N- 乙酰轉(zhuǎn)移酶尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究構(gòu)建無(wú)乳鏈球菌nat 基因缺失株，探究該基因缺失對(duì)細(xì)菌溶血能力、全血存活能力、黏附入侵能力、抗吞噬能力、組織定植能力以及對(duì)羅非魚(yú)致死率的影響，以期闡明N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在無(wú)乳鏈球菌致病過(guò)程中的作用，促進(jìn)對(duì)無(wú)乳鏈球菌致病機(jī)制的了解。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞和試劑

無(wú)乳鏈球菌野生株HN016 分離自廣東省某養(yǎng)殖場(chǎng)患腦膜炎的羅非魚(yú)。大腸桿菌DH5α 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。溫敏型自殺載體pSET4s由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)周洋教授惠贈(zèng)。TiB 細(xì)胞是一種來(lái)自羅非魚(yú)大腦的成纖維細(xì)胞系，由佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院曾偉偉教授贈(zèng)送。小鼠單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞（RAW264.7）由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存并傳代。

DNA 聚合酶混合液、核酸Marker、限制性核酸內(nèi)切酶、核酸連接酶、pMD9-T 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 酶混合物購(gòu)自寶生物工程有限公司（大連）；質(zhì)粒提取、瓊脂糖凝膠核酸回收和原核生物的RNA 提取試劑盒購(gòu)自Tiangen 公司；DL-蘇氨酸購(gòu)自Invitrogen 公司；蔗糖、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀和甘油購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒和PBS（磷酸鹽緩沖液）購(gòu)自Solarbio 公司；麻醉劑MS-222 購(gòu)自Macklin 公司；藥敏片購(gòu)自杭州微生物有限公司；壯觀(guān)霉素（spectinomycin，Spc）購(gòu)自德國(guó)Biofroxx 公司；胎牛血清和DMEM（Dulbecco’smodified Eagle medium）培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司；THB （Todd-Hewitt broth） 和LB （Luria-Bertanibroth）培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌株及細(xì)胞的培養(yǎng)

無(wú)乳鏈球菌在THB 或含1.5%（m/V）瓊脂的THB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度為37 ℃。大腸桿菌DH5α在LB 或含1.5%（m/V）瓊脂的LB 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，溫度為37 ℃。必要時(shí)將壯觀(guān)霉素加入固體培養(yǎng)基或肉湯中，終質(zhì)量濃度為100 μg/mL。小鼠單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞（RAW264.7）在37 ℃、5% 二氧化碳條件下用含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。羅非魚(yú)腦細(xì)胞系（TiB）在含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃。

1.3 Δnat 缺失株的構(gòu)建

1）基因缺失質(zhì)粒的構(gòu)建。以HN016 基因組為模板，分別用目的基因上游引物和下游引物擴(kuò)增上下游同源臂。用融合PCR 的方法將2 個(gè)同源片段連接，再與pMD19-T 載體連接測(cè)序，之后用相應(yīng)的限制性?xún)?nèi)切酶酶切后克隆至質(zhì)粒pSET4s 的合適位置，采用熱擊方法轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒備用。

2）感受態(tài)細(xì)胞的制備。將過(guò)夜培養(yǎng)菌液按1∶100 轉(zhuǎn)接至THY（含40 mmol/L DL- 蘇氨酸的THB）培養(yǎng)液中，37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)至OD600 nm 為0.4～0.6；冰浴30 min 后，12 000 r/min，4 ℃離心10min 收集菌體；用EB 緩沖溶液（10% 蔗糖、2 mmol/L磷酸氫二鉀）重懸細(xì)菌，同上離心；再用超純水洗2 次，之后用15% 甘油溶液重懸細(xì)菌，洗2 次。最后用15% 甘油重懸菌體，按每管80～100 μL 分裝，于-80 ℃凍存待用。

3）電轉(zhuǎn)化。將該菌的感受態(tài)細(xì)胞與基因缺失質(zhì)粒以體積比10∶1 混合（質(zhì)粒最終的劑量控制在l μg）后加到電轉(zhuǎn)化杯中，冰上放置0.5 h。電轉(zhuǎn)化時(shí)，儀器設(shè)置：電壓2.35 kV/cm、電阻200 Ω 和電容25 μF。電轉(zhuǎn)化結(jié)束后立即將l mL 復(fù)蘇液加入電擊杯中。將電轉(zhuǎn)化后的無(wú)乳鏈球菌在28 ℃和180 r/min 振蕩培養(yǎng)3 h，然后加入壯觀(guān)霉素至終質(zhì)量濃度100 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜。

4）缺失株的篩選。將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液涂布在固體THB 培養(yǎng)基上，直至長(zhǎng)出單克隆。挑取單克隆接種至含有100 μg/mL 壯觀(guān)霉素的THB 液體培養(yǎng)基中。之后，在不含抗生素的THB 培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min 連續(xù)傳代培養(yǎng)，在溫度和抗性的雙重選擇下促使重組缺失質(zhì)粒與基因組上具有相同序列的基因片段發(fā)生同源重組。將傳代后的菌液梯度稀釋后涂在含有壯觀(guān)霉素抗性和無(wú)抗性的THB 平板過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)無(wú)抗性的平板上長(zhǎng)的菌落明顯多于抗性平板時(shí)挑選無(wú)抗性平板上的菌落，用缺失基因的內(nèi)部引物和上下游同源臂引物進(jìn)行PCR 篩選。

5）缺失株的驗(yàn)證。用同源臂引物PCR 擴(kuò)增疑似缺失株相應(yīng)片段，并通過(guò)DNA 膠回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，測(cè)序，測(cè)序結(jié)果只含有缺失基因上下游片段，則說(shuō)明缺失株構(gòu)建成功。另外，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的無(wú)乳鏈球菌野生株和缺失株進(jìn)行RNA 的提取，用DNase Ⅰ去除基因組DNA 干擾。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR premixEx TaqTM Kit，采用說(shuō)明書(shū)兩步法qRT-PCR 檢測(cè)目的基因的mRNA 水平，以16S rRNA 基因作為內(nèi)參。所用引物見(jiàn)表1，均由北京擎科生物公司合成。采用2-ΔΔCt法分析mRNA 水平的差異［11］。

1.4 表型測(cè)定

1）生長(zhǎng)曲線(xiàn)。將過(guò)夜培養(yǎng)的菌液按1∶100 稀釋到新鮮的THB 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期（OD600 nm=0.4～0.5）。培養(yǎng)物在新鮮的THB 培養(yǎng)基中稀釋至OD600 nm為0.1。取稀釋后的培養(yǎng)物 200 μL至96 孔微孔板中，37 ℃孵育，每小時(shí)搖動(dòng)10 s 后測(cè)量OD600 nm 值，設(shè)置4 個(gè)技術(shù)重復(fù)。根據(jù)重復(fù)的平均值繪制OD600 nm隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)圖。

2）溶血性。將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌劃線(xiàn)接種于血平板上，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h，使其形成明顯溶血圈，觀(guān)察溶血情況并拍照。

3）革蘭氏染色。先涂片固定，草酸銨結(jié)晶紫染1 min，蒸餾水沖洗；再加碘液覆蓋涂面染約1 min，水洗，用吸水紙吸去水分；再加95% 乙醇數(shù)滴，輕輕搖動(dòng)脫色，20 s 后水洗，吸去水分；番紅染色液染1 min后用蒸餾水沖洗；干燥，鏡檢。

1.5 全血存活試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［12］描述的方法，并有所修改。在羅非魚(yú)的尾靜脈取血，立即加入0.1% 肝素鈉，備用。準(zhǔn)備好已經(jīng)生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的無(wú)乳鏈球菌，稀釋至合適濃度加到血液中，控制細(xì)菌最終的濃度為1×103 CFU/mL，將混合液置于37 ℃培養(yǎng)箱并保持微翻轉(zhuǎn)。分別于0 和1.5 h 取一定量的混合液，涂布到THB 固體培養(yǎng)平板上，記錄長(zhǎng)出的菌落數(shù)。

1.6 黏附和入侵試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［12］描述的方法，并有所修改。

1）黏附試驗(yàn)。用0.25% 胰酶處理單層TiB 細(xì)胞后，顯微鏡觀(guān)察并計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，再加到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)。無(wú)乳鏈球菌野生株HN016 和缺失株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600 nm 為0.6），洗菌液3 次，調(diào)整到濃度為4×106 CFU/mL，將菌液加入細(xì)胞孔（復(fù)合感染比MOI=10），微速離心后將細(xì)胞板放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取出后用PBS 緩沖液洗3～5 次，再加入純水裂解細(xì)胞并進(jìn)行平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)。黏附率是衡量細(xì)菌黏附細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)，黏附率（裂解后菌落數(shù)量/加入細(xì)菌數(shù)量）越高說(shuō)明細(xì)菌黏附細(xì)胞的能力越強(qiáng)。

2）入侵試驗(yàn)。方法同黏附試驗(yàn)，不同的是PBS洗滌后，需加入青霉素G 至終質(zhì)量濃度為100μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1 h。入侵率是衡量細(xì)菌侵入細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)，入侵率（裂解后菌落數(shù)量/加入細(xì)菌數(shù)量）越高說(shuō)明細(xì)菌侵入細(xì)胞的能力越強(qiáng)。

1.7 抗吞噬試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［12］描述的方法。RAW264.7 細(xì)胞用含10% 胎牛血清的DMEM 營(yíng)養(yǎng)液在5% CO2和37 ℃條件下傳代培養(yǎng)，以4×105 細(xì)胞/孔傳代至24 孔板上，形成單層貼壁細(xì)胞。以MOI 為10，即4×106 細(xì)胞/孔的細(xì)菌懸液感染RAW264.7 細(xì)胞。接種后將24 孔板在室溫下1 000 r/min 離心15 min 使細(xì)菌與細(xì)胞充分接觸。24 孔板置37 ℃、5% CO2作用1 h。用PBS 洗3～5 遍，每孔加入l mL 含100 μg/mL 慶大霉素和5 μg/mL 青霉素的DMEM，以徹底清除巨噬細(xì)胞外殘余細(xì)菌。加入抗生素1 h 后用無(wú)菌PBS 清洗2 遍再加入去離子水裂解細(xì)胞。將該裂解液梯度稀釋后涂平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)。吞噬率是衡量細(xì)菌抵抗吞噬的一個(gè)重要指標(biāo)，吞噬率（裂解后菌落數(shù)量/加入細(xì)菌數(shù)量）越低說(shuō)明細(xì)菌抗吞噬的能力越強(qiáng)。

1.8 致死率試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［12］描述的方法，并有所修改。試驗(yàn)用羅非魚(yú)均購(gòu)自廣東粵強(qiáng)豐水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量（10±1） g，于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2 周后進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。通過(guò)2 次離心收集對(duì)數(shù)后期的細(xì)菌，并用PBS 重懸，備用。將120 尾魚(yú)隨機(jī)分為3 組（野生株組、突變株組和對(duì)照組），每組40 尾。對(duì)照組注射無(wú)菌PBS 0.1mL，試驗(yàn)組羅非魚(yú)用90 mg/L 的MS-222 麻醉后腹腔注射0.1 mL 細(xì)菌懸液（每尾魚(yú)注射2×108 CFU）。對(duì)被注射感染的魚(yú)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，連續(xù)14 d，從所有死魚(yú)的腦組織中重新分離出細(xì)菌并進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)重復(fù)2 次。

1.9 組織載菌量試驗(yàn)

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［19］描述的方法，并有所修改。將20 尾魚(yú)隨機(jī)分為2 組，每組10 尾。分別腹腔注射野生株HN016 和突變株，每尾魚(yú)注射2×108 CFU。麻醉的處理方法同本文“材料與方法1.8”。感染后12 h，采集腦、脾臟和血液樣本，稱(chēng)測(cè)各組織質(zhì)量。勻漿后用PBS 連續(xù)稀釋至10-2、10-3、10-5 和10-6 進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)選取菌落數(shù)在30～300 的平板。

1.10 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 6.0 軟件做圖，利用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以Plt;0.05 （*）為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Plt;0.01 （**）為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Plt;0.001 （***）為有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。除了特殊說(shuō)明，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)乳鏈球菌nat 基因缺失株的構(gòu)建

如圖1A 所示，用nat 基因內(nèi)部引物（nat-F/nat-R）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以缺失株Δnat 基因組為模板，無(wú)法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，以野生株HN016 基因組為模板能獲得約500 bp 的產(chǎn)物；以nat 基因外部引物（nat-A/nat-D）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，以缺失株Δnat 基因組為模板，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物大小為上下游同源臂的大小之和約1 000 bp，而以野生株HN016 基因組為模板，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為上下游同源臂加nat 基因長(zhǎng)度約2 200 bp。結(jié)果表明缺失株Δnat 構(gòu)建成功。用qRTPCR檢測(cè)nat 基因mRNA 的表達(dá)水平，結(jié)果（圖1B）顯示，nat 基因的mRNA 在野生菌株中正常表達(dá)，而在缺失株Δnat 中未檢測(cè)到表達(dá)；另外，用qRT-PCR檢測(cè)nat 基因的上游基因（SAHN016_RS06510）和下游基因（SAHN016_RS06520）的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果（圖1B）顯示在缺失株Δnat 和野生株HN016 中nat 上下游基因的mRNA 表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。因此，nat 基因缺失不影響上下游基因的表達(dá)。

2.2 nat 基因缺失對(duì)無(wú)乳鏈球生長(zhǎng)特性、菌落形態(tài)和溶血能力的影響

如圖2A 所示，缺失株Δnat 和野生株HN016 均在2 h 左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4 h 左右進(jìn)入平臺(tái)期，表明缺失株Δnat 和野生株HN016 生長(zhǎng)無(wú)顯著差異，這表明nat 基因缺失不影響細(xì)菌生長(zhǎng)。同時(shí)革蘭氏染色結(jié)果也表明基因缺失不影響細(xì)菌革蘭氏染色（圖2B）。另外通過(guò)比較缺失株Δnat 和野生株HN016 在血平板上的溶血環(huán)，nat 基因缺失使無(wú)乳鏈球菌的溶血能力減弱（圖2C）。

2.3 nat 基因缺失對(duì)無(wú)乳鏈球菌在血液中生存能力的影響

如圖3 所示，與羅非魚(yú)全血孵育1.5 h 后，野生株HN016 增長(zhǎng)了14.6 倍，缺失株Δnat 增長(zhǎng)了11.9 倍，Δnat 在血液中的生存能力顯著弱于野生株HN016。說(shuō)明nat 基因缺失顯著降低無(wú)乳鏈球菌在羅非魚(yú)全血中的生存能力。

2.4 nat 基因缺失對(duì)無(wú)乳鏈球菌黏附和入侵羅非魚(yú)腦細(xì)胞能力的影響

如圖4A 所示，野生型HN016 對(duì)TiB 細(xì)胞的入侵率為0.8%，缺失株Δnat 對(duì)TiB 細(xì)胞的入侵率為0.19%，Δnat 的入侵率比野生型下降了75.6%（圖4A）。如圖4B 所示，野生型HN016 對(duì)TiB 細(xì)胞的黏附率為24.1%，缺失株Δnat 對(duì)TiB 細(xì)胞的黏附率為13.8%，Δnat 對(duì)TiB 細(xì)胞的黏附性下降了42.7%（圖4B）。這些結(jié)果表明nat 基因缺失顯著降低無(wú)乳鏈球菌黏附和入侵羅非魚(yú)細(xì)胞的能力。

2.5 nat 基因缺失對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗吞噬能力的影響

用RAW264.7 評(píng)價(jià)Δnat 的抗吞噬能力，突變株Δnat 和野生株HN016 的吞噬率分別為64.5%和38.2%，Δnat 比HN016 更容易被吞噬（圖5）。結(jié)果表明，Δnat 對(duì)RAW264.7 的吞噬作用更敏感，nat 基因缺失顯著降低無(wú)乳鏈球菌對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的抗性。

2.6 nat 基因缺失對(duì)無(wú)乳鏈球菌致病力的影響

對(duì)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的野生株和缺失株以2×108CFU/尾的劑量，腹腔注射的方式攻毒羅非魚(yú)，并在之后的14 d 內(nèi)觀(guān)察存活情況。結(jié)果如圖6 所示，HN016 感染羅非魚(yú)3 d 內(nèi)可造成85% 死亡率，第4～14 天內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)死魚(yú)。Δnat 感染羅非魚(yú)8 d 后造成36% 羅非魚(yú)死亡，第8～14 天內(nèi)沒(méi)有出現(xiàn)死魚(yú)。PBS對(duì)照組在試驗(yàn)周期內(nèi)并沒(méi)有造成羅非魚(yú)的死亡。感染HN016 的羅非魚(yú)表現(xiàn)出典型的出眼癥、角膜混濁、鰓帽下緣出血等癥狀，而感染Δnat 的羅非魚(yú)癥狀較輕或無(wú)明顯癥狀（圖6B）。這些結(jié)果表明nat 基因缺失顯著降低了無(wú)乳鏈球菌的致病力。

2.7 缺失株Δnat 感染組織載菌量的變化

如圖7 所示，羅非魚(yú)感染野生株12 h 后，腦、脾臟和血液載菌量分別為4.81×105、3.77×107 和4.5×106 CFU/mg，感染突變株Δnat 后，腦、脾臟和血液載菌量分別為3×104、2.86×106 和2.6×104 CFU/mg（圖7），Δnat 感染后的組織載菌量較野生株顯著下降，其中在大腦減少93.8%，在脾臟減少92.4%，在血液中減少了99.4%。這些結(jié)果進(jìn)一步表明nat 基因缺失降低了無(wú)乳鏈球菌毒力。

3 討論

本研究通過(guò)同源重組構(gòu)建了無(wú)乳鏈球菌nat 基因缺失菌株，發(fā)現(xiàn)與野生株相比，Δnat 的革蘭氏染色和在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)無(wú)明顯差異，表明nat 基因缺失對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)和形態(tài)的影響不大。但nat 缺失明顯削弱細(xì)菌在全血中的存活能力，表明nat 基因有助于無(wú)乳鏈球菌在血液中生存。溶血性試驗(yàn)結(jié)果表明，nat基因的缺失導(dǎo)致了無(wú)乳鏈球菌溶血能力減弱，這與大腸桿菌中的乙酰轉(zhuǎn)移酶缺失的表型一致［13］，大腸桿菌中的溶血素需要乙?；拍馨l(fā)揮溶血活性，這表明nat 基因的缺失，可能導(dǎo)致了溶血素不能被乙?；罱K導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌溶血性降低。莢膜多糖是細(xì)菌關(guān)鍵毒力因子，對(duì)細(xì)菌在血液中存活至關(guān)重要［14］。在大腸桿菌中，乙?；那v膜多糖可以使細(xì)菌逃避血液的殺傷，避免宿主的免疫防御［15］。因此，我們推測(cè)nat 缺失導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌在血液中生存能力的下降可能是因?yàn)榧?xì)菌莢膜多糖不能被乙?；揎?，這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

腦膜炎是無(wú)乳鏈球菌感染最常見(jiàn)的臨床綜合征，細(xì)菌導(dǎo)致腦膜炎需要黏附和入侵腦細(xì)胞。本研究利用羅非魚(yú)大腦成纖維細(xì)胞TiB 評(píng)估基因缺失對(duì)細(xì)菌黏附入侵能力的影響。結(jié)果顯示Δnat 黏附和入侵TiB 的比率遠(yuǎn)低于野生株，表明nat 基因參與無(wú)乳鏈球菌入侵大腦過(guò)程。與上述結(jié)果相似，CheY 也是一種乙?；鞍?，Yao 等［16］的研究表明CheY 促進(jìn)單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）與上皮細(xì)胞的初步黏附并有助于單增李斯特菌對(duì)上皮細(xì)胞的入侵。插入沉默空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的cheY 基因可導(dǎo)致該細(xì)菌獲得較高的體外黏附和入侵能力，但無(wú)法在體內(nèi)定植和引起疾病［11］。抵抗吞噬細(xì)胞吞噬是無(wú)乳鏈球菌發(fā)揮致病作用的關(guān)鍵，因此我們還探究了nat 缺失對(duì)無(wú)乳鏈球菌抗RAW264.7吞噬能力的影響，結(jié)果表明缺失株對(duì)吞噬細(xì)胞的敏感性顯著增加。這說(shuō)明致病菌的乙酰轉(zhuǎn)移酶在抗吞噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

黏附和入侵減少以及吞噬敏感性增加是否會(huì)導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)致病力的降低？為了回答這個(gè)問(wèn)題，我們利用羅非魚(yú)感染模型驗(yàn)證了缺失株和野生株對(duì)羅非魚(yú)的致死率和在器官中的定植能力。當(dāng)使用2×108 CFU/尾的劑量攻毒羅非魚(yú)時(shí)，野生株死亡率為85%，而nat 基因缺失株僅為36%，同時(shí)感染野生株的羅非魚(yú)死亡速度更快，在感染最初的2 d發(fā)生集中性大量死亡，但缺失株沒(méi)有發(fā)生集中性死亡，表明nat 基因缺失導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)致死率發(fā)生明顯下降。為了更全面了解細(xì)菌致病力，我們采集了受感染羅非魚(yú)的脾臟、血液和大腦，并統(tǒng)計(jì)了不同組織和血液中的細(xì)菌載量。結(jié)果顯示缺失株在器官和血液中的載量均低于野生株，表明nat 基因的缺失導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌更容易被免疫系統(tǒng)清除，血液和脾臟中的細(xì)菌密度顯著降低可以證明這一點(diǎn)。而在大腦中觀(guān)察到的細(xì)菌密度的減少再次證明Δnat進(jìn)入大腦的能力受損。由此可見(jiàn)，nat 基因表達(dá)的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶是無(wú)乳鏈球菌關(guān)鍵毒力因子，nat 基因缺失導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌毒力減弱。乙酰轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的乙?；揎椏烧{(diào)節(jié)多種細(xì)菌毒力。在沙門(mén)氏菌中，乙酰轉(zhuǎn)移酶可以通過(guò)乙?；{(diào)控PhoP 的活性，而PhoP是細(xì)菌毒力的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，因此，推測(cè)乙酰轉(zhuǎn)移酶具有調(diào)控細(xì)菌毒力的功能［17］。在銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，kdsA 基因產(chǎn)物被乙?；瑓⑴c脂多糖的生物合成，是銅綠假單胞菌毒力所必需的［18］。因此，我們推測(cè)Δnat 毒力的減弱可能是細(xì)菌中某些毒力因子乙?；潭冉档蛯?dǎo)致的，需要進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上，本研究初步探究了無(wú)乳鏈球菌N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的功能，發(fā)現(xiàn)N-乙酰轉(zhuǎn)移酶參與無(wú)乳鏈球菌通過(guò)血液運(yùn)輸并感染羅非魚(yú)器官的過(guò)程，并且能夠協(xié)助無(wú)乳鏈球菌抵抗吞噬細(xì)胞和血液的清除，最終導(dǎo)致無(wú)乳鏈球菌對(duì)羅非魚(yú)的高致病力。這一結(jié)果闡明了N-乙酰轉(zhuǎn)移酶在無(wú)乳鏈球菌中的作用，為進(jìn)一步探索無(wú)乳鏈球菌致病機(jī)制提供了理論依據(jù)。本研究中，我們成功地以HN016 的基因組為模板，PCR 擴(kuò)增并純化出nat 基因片段，并通過(guò)嘗試酶切酶連或者重疊PCR 的方法將nat 基因連接到回補(bǔ)質(zhì)粒pSET4s上，但是，目前我們還沒(méi)有獲得正確的回補(bǔ)質(zhì)粒，后續(xù)會(huì)繼續(xù)嘗試獲得回補(bǔ)株，并檢測(cè)回補(bǔ)株的表型和毒力。

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（責(zé)任編輯：邊書(shū)京）

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