摘要：【目的】挖掘銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株HZ15抑菌物質合成相關基因及其抑菌機理，探究不同來源銅綠假單胞菌的遺傳多樣性及特異性，為菌株HZ15的實際應用提供理論依據(jù)?！痉椒ā坎捎肗anopore第三代測序技術對分離自鱗翅目幼蟲的銅綠假單胞菌菌株HZ15進行全基因組測序，并結合多種數(shù)據(jù)庫對其基因組進行注釋，同時與來自不同環(huán)境（人體、土壤、植物、廢水）的另外9株銅綠假單胞菌進行比較基因組學和泛基因組分析?！窘Y果】菌株HZ15含有1條6722482 bp的染色體，平均GC含量66.14%，共注釋到6173個編碼基因，總長度6018345 bp，編碼區(qū)占基因組全長的89.53%。比較基因組學分析結果顯示，10株銅綠假單胞菌在基因組大小、基因數(shù)量等方面均存在差異。菌株HZ15含有61個抗生素耐受基因、8個前噬菌體、53個水平基因轉移及225個毒力因子。CAZy數(shù)據(jù)庫注釋發(fā)現(xiàn)，菌株HZ15含有多種可能與其抑菌活性相關的糖苷水解酶（GH18、GH19、GH23、GH73和GH103）。此外，菌株HZ15擁有編碼3種金屬螯合劑［Pf-5 pyoverdine、偽帕林（pseudopaline）和綠膿桿菌螯鐵蛋白（pyochelin）］以及l(fā)ankaci-din C、氰化氫（hydrogen cyanide）、雙環(huán)霉素（bicyclomycin）等抑菌活性成分的基因簇，還特有套索肽（lassopeptide）的次級代謝合成相關基因。泛基因組分析發(fā)現(xiàn)10株銅綠假單胞菌有10517個泛基因組基因，5278個核心基因組基因。泛基因組中，菌株HZ15擁有231個獨特基因，其中aphA_2和bla基因與抗生素耐受性相關。【結論】菌株HZ15可能通過破壞病原菌細胞壁、釋放毒素和抑菌活性成分等抑制病原菌生長，并因其具有較強環(huán)境適應能力，在生物防治領域具有良好的應用潛力。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；菌株HZ15；全基因組測序；抑菌活性；次級代謝產物

中圖分類號：S432.42文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）09-2653-12

Whole-genome and comparative genomic analysis of Pseudomonas aeruginosa strain HZ15

YANG De-wei1，SHI Chun-lan1，ZENG Shu-quan1，XIE Zi-wei1，QIN Xiao-ping1，QIN De-qiang1，GAO Xi1，GU Xiao-fei2，XIE Yong-hui2，WU Guo-xing1*

（1College of Plant Protection，Yunnan Agricultural University，Kunming，Yunnan 650201，China；2Kunming Company，Yunnan Tobacco Company，Kunming，Yunnan 650051，China）

Abstract：【Objective】The objective was to identify genes related to the synthesis of antibacterial substances in Pseu-domonas aeruginosa strain HZ15，explore its antibacterial mechanisms，and investigate the genetic diversity and specifi-city of P.aeruginosa from different sources，providing theoretical basis for the practical application of strain HZ15.【Method】Using Nanopore third-generation sequencing technology，the whole-genome of P.aeruginosa strain HZ1，5 which was isolated from Lepidoptera larvae，was sequenced.Genome annotation was performed using various databases.Comparative genomics and pan-genomics analysis were conducted with 9 other P.aeruginosa strains from different envi-ronments（human，soil，plant and wastewater）.【Result】Strain HZ15 possessed a single chromosome of 6722482 bp，with an average GC content of 66.14%.A total of 6173 coding genes were annotated，the total length was 6018345 bp，with the coding region accounting for 89.53%of the entire genome.The comparative genomics analysis revealed varia-tions in genome size and gene number among the 10 P.aeruginosa strains.Strain HZ15 contained 61 antibiotic resistance genes，8 prophages，53 horizontally transferred genes，and 225 virulence factors.Annotation using the CAZy database re-vealed that strain HZ15 possessed several glycoside hydrolases（GH18，GH19，GH23，GH73 and GH103）that might berelated to its antibacterial activity.Furthermore，strain HZ15 harbored gene clusters encoding 3 types of metal chelators（Pf-5 pyoverdine，pseudopaline and pyochelin），as well as gene clusters for antibacterial active substances such aslankacidin C，hydrogen cyanide and bicyclomycin，along with its unique secondary metabolic synthesis related genes oflassopeptide.Pan-genomic analysis revealed that the 10 strains of P.aeruginosa had 10517 pan-genome genes and 5278 core genome genes.Within the pan-genome，strain HZ15 had 231 unique genes，among which，aphA_2 and bla genes re-lated to antibiotic resistance.【Conclusion】Strain HZ15 likely inhibits pathogens through cell wall disruption，toxin re-lease，and the production of antibacterial compounds.Its strong environmental adaptability suggests potential for applica-tion in biocontrol.

Key words：Pseudomonas aeruginosa；strain HZ15；whole-genome sequencing；antibacterial activity；secondary metabolites

Foundation items：Yunnan Reserve Talent Project for Young and Middle-aged Academic and Technical Leaders（202105AC160037，202205AC160077）；Yunnan Tobacco Company Science and Technology Project（2020530000242026）；Kunming Tobacco Company General Science and Technology Project（KMYC202201）

0引言

【研究意義】由煙草疫霉（Phytophthora para-sitica var.nicotianae）引起的煙草黑脛病是制約我國煙草生產的一種毀滅性土傳病害，其廣泛分布于我國各個煙區(qū)，給我國煙草產業(yè)造成巨大經濟損失（曾舒泉等，2021；李虹梅等，2022；匡志豪等，2023）。目前對煙草黑脛病的防控手段仍以化學農藥為主，但長期使用化學農藥會引發(fā)環(huán)境污染、食品安全以及病原微生物耐藥性增強等一系列問題，因此，開發(fā)新型、環(huán)境友好的綠色生物源農藥刻不容緩（Nazarov et al.，2020；王藝茹等，2024）。云南農業(yè)大學植物保護學院農藥學實驗室前期從鱗翅目幼蟲腸道中分離出1株對煙草黑脛病菌具有良好抗性的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）菌株HZ15（曾舒泉等，2021）。目前，全基因組測序和比較基因組學分析技術發(fā)展迅速，已被廣泛應用于探索微生物中的多種次級代謝物途徑，從而幫助揭示菌株的生防潛力和環(huán)境適應性。此外，泛基因組分析的應用進一步促進了對微生物基因組功能基因的鑒定（姚彩苗等，2019；Kumari etal.，2023）。因此，通過全基因組測序并結合比較基因組學和泛基因組分析能進一步挖掘菌株HZ15的生物防治潛力，為菌株HZ15的實際應用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】銅綠假單胞菌隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas spp.），是一種具有廣譜抑菌活性的革蘭氏陰性菌，因其強大的拮抗作用及在生物防治領域的應用潛力，已成為研究的熱點（楚文琢等，2017；肖咪云等，2019；和國優(yōu)等，2023）。相關研究表明，銅綠假單胞菌能分泌多種拮抗植物病原菌的代謝產物，如嗜鐵素類、吩嗪類、胞外多糖類和鼠李糖脂等，具有良好的生物防治潛力（Kondo et al.，2002；徐李娟，2022）。目前，關于銅綠假單胞菌生防作用的研究已較為豐富（Lakshmi et al.，2015；Nguyen et al.，2021；郝芳敏等，2023；梁衛(wèi)驅等，2024）。Wu等（2018）從蘆葦中分離的銅綠假單胞菌菌株L10不僅能有效降解被石油污染的土壤中的烴類化合物，還具有促進植物生長的能力，主要得益于其基因組中含有參與吲哚乙酸（IAA）、鐵載體、生物表面活性劑合成的相關基因。Jatan等（2023）分離到的銅綠假單胞菌菌株RK1對6種水稻病原菌均具有拮抗作用；菌株RK1的全基因組分析結果顯示，其具有多項有利于植物生長和生物防治的基因組特征，這些特征包括能產生IAA、鐵載體、吩嗪類化合物、幾丁質酶和氰化氫（HCN）等具有生物活性物質的基因。Meng等（2024）從土壤中分離到銅綠假單胞菌菌株QY43，該菌能顯著抑制假禾谷鐮刀菌（Fusarium pseudograminearum）生長和分生孢子萌發(fā)，降低其致病性；菌株QY43的基因組分析結果表明，該菌能分泌鐵載體、吩嗪類化合物和鼠李糖脂等生物防治因子；通過比較基因組學研究，發(fā)現(xiàn)其含有3個獨特的多糖類抗真菌化合物的生物合成相關基因。進一步的研究表明，來源于不同生態(tài)位的銅綠假單胞菌在生物活性上存在差異。Subedi等（2018）通過比較基因組學分析發(fā)現(xiàn)來自不同地理位置的銅綠假單胞菌在基因組大小、基因島、抗生素抗性、毒力基因上存在差異。Ambreetha和Balachan-dar（2022）發(fā)現(xiàn)從黃瓜、番茄、茄子和辣椒中分離的18株銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲的毒殺能力存在差異，主要是由不同菌株的毒力因子（如鼠李糖脂、膿青素、生物膜）表達水平不同造成。Gómez-Martínez等（2023）發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在不同生態(tài)位（尿液、肺部、環(huán)境）中展現(xiàn)出特定的遺傳適應性變化，進一步揭示了該菌在不同環(huán)境下的遺傳多樣性。此外，F(xiàn)reschi等（2019）對1311個銅綠假單胞菌的泛基因組分析結果表明，該物種的泛基因組是開放的，水平基因轉移（HGT）在其進化過程中發(fā)揮了關鍵作用?！颈狙芯壳腥朦c】前期研究發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌菌株HZ15對煙草黑脛病菌具有良好的拮抗特性（曾舒泉等，2021），但尚未對其抑菌機制進行深入研究?！緮M解決的關鍵問題】基于Nanopore第三代測序技術對銅綠假單胞菌HZ15進行全基因組測序，并利用多種數(shù)據(jù)庫對其基因組進行功能注釋，同時與來自不同環(huán)境（人體、土壤、植物、廢水）的9株銅綠假單胞菌進行比較基因組學和泛基因組分析，旨在挖掘菌株HZ15的生物活性成分，并揭示其遺傳多樣性及特異性，以深入了解該菌株的潛在應用價值，為菌株HZ15的實際應用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試生防菌：銅綠假單胞菌菌株HZ15，分離自鱗翅目幼蟲，保存于云南農業(yè)大學植物保護學院農藥學實驗室。培養(yǎng)基：蛋白胨酵母培養(yǎng)基（LB）。

1.2試驗方法

1.2.1菌株HZ15全基因組分析菌株HZ15的DNA提取參考李虹梅等（2022）的方法。將菌株HZ15接種至LB液體培養(yǎng)基中28℃下180 r/min培養(yǎng)24h，12000 r/min離心10min獲得菌體，采用DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）提取菌株DNA。委托百邁客生物科技有限公司完成菌株DNA基因組測序?；贜anopore第三代測序平臺，使用Canu v 1.5對過濾后的reads進行組裝，運用Racon v3.4.3、Circlatorv 1.5.5和Pilon v1.22矯正糾錯。將菌株HZ15的全基因組數(shù)據(jù)提交至中國生物信息中心（China National Center for Bioinfortnation，CNCB），Genome Warehouse登記號為GWHESEO01000000。

使用Prodigal v2.6.3對編碼基因進行預測，rRNA和tRNA通過Infernal v1.1.3及tRNAscan-SE v2.0預測。使用CRT v1.2預測CRISPR序列。運用COG、Pfam、Swiss-Prot、Nr、GO和KEGG通用數(shù)據(jù)庫及CAZy特殊數(shù)據(jù)庫進行注釋。

1.2.2比較基因組學分析根據(jù)文獻報道并隨機挑選，從NCBI上下載9株不同分離源（人體、土壤、植物、廢水）的銅綠假單胞菌：PAO1、PAC1、RK1、M18、DN1、L10、JBPA、B10W和CH1的全基因組。基于在線工具Proksee（https：//proksee.ca/）（Grant et al.，2023）進行以下分析：HGT（Vernikos and Parkhill，2006）；前噬菌體（Prophage）（Starikova et al.，2020）；抗生素耐藥性（Alcock et al.，2023），排除松散的命中和低質量序列。使用VFDB數(shù)據(jù)庫預測菌株的毒力因子（Liu et al.，2022a）。使用antiSMASH v5.0.0預測次級代謝基因簇（僅包括嚴格的命中）。通過dbCAN2（https：//bcb.unl.edu/dbCAN2/index.php）在線網站的dbCAN_sub（參數(shù)為E-valuelt;1e-15，coveragegt;0.35）工具進行CAZy數(shù)據(jù)庫注釋，使用SignalP預測分泌蛋白。

利用IPGA在線工具（https：//nmdc.cn/ipga/）進行平均核苷酸一致性（ANI）和共線性分析。先對基因組進行質控，對完整性大于90%、污染率小于5%的序列進行后續(xù)分析。當ANI大于95%時界定為同一物種；此外，共線性分析僅挑選每種來源的1株菌株與菌株HZ15進行比較（Liu et al.，2022b）。

1.2.3泛基因組分析使用IPGA（Liu et al.，2022b）對10株銅綠假單胞菌進行泛基因組分析。先對基因組序列進行質控，確保對完整性大于90%、污染率小于5%的序列進行分析。選擇PANOCT、OrthoMCL、Roary、panX、OrthoFinder、Panaroo和PPanGGoLiN模塊進行分析，參數(shù)Identity、Ratio（core）、Support分別設置為70、0.95和-1。

1.3數(shù)據(jù)可視化

使用Origin 2023繪制餅圖，ChiPlot（https：//chi-plot.online/）繪制條形圖，imageGP（https：//www.bic.ac.cn/BIC/#/）繪制花瓣圖和堆積圖。

2結果與分析

2.1菌株HZ15全基因組分析結果

2.1.1菌株HZ15基因組概況及COG、Pfam和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋測序結果（圖1）顯示，菌株HZ15含有1條6722482bp的染色體，平均GC含量為66.14%，共注釋到6173個編碼基因，總長度為6018345 bp，平均長度974 bp，編碼區(qū)占基因組全長的89.53%。此外，共檢測到55444bp的重復序列，占總基因組的0.82%，預測到16個rRNA和66個tRNA。

菌株HZ15在COG數(shù)據(jù)庫中共注釋到6173個功能基因，其中未知功能（Function unknown）注釋最多，為1170個，其次為一般功能預測（General func-tion prediction only，500個）、氨基酸轉運和代謝（Amino acid transport and metabolism，456個）、轉錄（Transcription，436個）。

Pfam數(shù)據(jù)庫提供了相對完整、準確的蛋白家族和功能域的分類信息，Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫能夠可靠驗證非冗余高質量蛋白序列。在對菌株HZ15的分析中，分別在Pfam數(shù)據(jù)庫和Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫注釋到5345和3700個具有生物學意義的基因。表明菌株HZ15的基因組蘊含豐富的功能信息，具有重要的生物學價值。

2.1.2 Nr和CAZy數(shù)據(jù)庫注釋菌株HZ15在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋到6163個基因，其中，4000個基因在假單胞菌屬得到注釋，占比最高，達64.90%，其次是銅綠假單胞菌1935個，占比為31.40%（圖2-A）。

碳水化合物酶基因是潛在的致病相關基因，通過CAZy數(shù)據(jù)庫對菌株HZ15的碳水化合物酶進行預測，共注釋到157個基因，其中，糖基轉移酶（Gly-cosyl transferases）注釋到的基因數(shù)最多，為47個，其次是糖苷水解酶（Glycoside hydrolases）和碳水化合物酯酶（Carbohydrate esterases），分別注釋到40和33個基因（圖2-B）。

2.1.3 GO和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋共有4589個基因注釋到GO功能條目。分子功能（Molecular func-tions）包括12個分支、5887個基因，其中催化活性（Catalytic activity）富集到的基因數(shù)最多，有2633個。生物過程（Biological processes）包括17個分支，富集到的基因數(shù)最多，有8885個，其中代謝過程（Meta-bolic process）、單體生物過程（Single-organism pro-cess）和細胞過程（Cellular process）富集到的基因數(shù)較多，分別為2346、1971和1969個。細胞組分（Ce-llular components）包括14個分支、6569個基因，其中與細胞（Cell）相關的基因數(shù)最多，為1636個（圖3）。

共有3213個基因被富集到KEGG信號通路。有2325個基因富集到4個一級信號通路，即環(huán)境信息加工（Environmental information processing）、細胞過程（Cellular processes）、遺傳信息加工（Genetic information processing）和代謝（Metabolism），其中與代謝通路有關的基因數(shù)最多，為1638個；4個一級通路包括48個二級通路，其中ABC轉運蛋白（ABC transporters）、雙組分調節(jié)系統(tǒng)（Two-component sys-tem）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）和碳代謝（Carbon metabolism）是菌株HZ15主要的代謝通路（圖4）。

2.2比較基因組學分析結果

2.2.1基因綜合組分析10株銅綠假單胞菌的基因組信息如表1所示，分別來源于人體、土壤、植物、廢水和昆蟲。10株銅綠假單胞菌的基因組長度在6264404～7564383 bp，預測到5671～7000個基因，GC含量為65.43%～66.56%。利用Phigaro工具預測10株菌株前噬菌體數(shù)量，菌株CH1、PAO1分別擁有最多（10個）和最少（1個）的前噬菌體數(shù)量。HGT是細菌獲得外源遺傳物質的重要途徑，菌株RK1注釋到最多的HGT區(qū)域（155個）、PAO1最少（39個），這些HGT區(qū)域可能作為遺傳物質的交換單元，促進了銅綠假單胞菌與其他細菌或環(huán)境間的基因交流，進一步增強其遺傳多樣性和環(huán)境適應性。

銅綠假單胞菌是一種多重耐藥性細菌，通過CARD數(shù)據(jù)庫注釋10株菌株的抗生素耐受基因，結果如表1和圖5-A所示。10株菌株間的抗生素耐受基因數(shù)量差異較小，10株菌共有的53個抗生素耐受基因對四環(huán)素類、糖肽類和氨基糖苷類等多種抗生素具有抗性。菌株JBPA含有4個特有抗生素耐受基因（APH（3''）-Ib、APH（6）-Id、adeF和PDC-8），主要與氨基糖苷類、四環(huán)素類和碳青霉烯類抗生素抗性有關；菌株HZ15和PAO1沒有特定的抗生素耐受基因。

對10株銅綠假單胞菌進行CAZy數(shù)據(jù)庫注釋，發(fā)現(xiàn)其糖苷水解酶中的部分酶可能與抑菌活性相關（表2）。GH18和GH19家族為幾丁質酶，能抑制真菌生長（Chen et al.，2015；Shrivastava，2020；Rafiei et al.，2021）。SignalP工具預測到GH23（溶菌酶、幾丁質酶和肽聚糖裂解酶）、GH73（溶菌酶）和GH103肽聚糖裂解酶）家族的部分酶含有信號肽區(qū)域，能分泌到胞外，可能與銅綠假單胞菌的抑菌作用有關（Shrivastava，2020；Moroz et al.，2021）。10株銅綠假單胞菌在GH18和GH73家族的酶數(shù)量上一致，在其他3種酶的數(shù)量上具有較大差異。

毒力因子是使微生物能在特定物種的宿主上或宿主內建立自身并增強其致病潛力的基因產物，利用VFDB數(shù)據(jù)庫對銅綠假單胞菌的毒力因子進行注釋，結果如圖5-B所示。毒力因子共分為11個模塊，銅綠假單胞菌中黏附性（Adherence）、分泌系統(tǒng)（Secretion system）和鐵攝?。↖ron uptake）模塊的基因數(shù)量最多。毒素基因中，主要編碼外毒素A、Exo-lysin和HCN，其中，外毒素A是銅綠假單胞菌主要的毒性物質。菌株PAO1被關聯(lián)到與致病性相關的功能基因數(shù)量最多（233個）、RK1最少（217個）。

2.2.2 ANI和共線性分析對10株銅綠假單胞菌的ANI進行分析，所有菌株之間基因組的相似性均大于95%（圖6-A），表明10株菌株具有較強的相似性，為同一物種。其中，菌株HZ15、PAO1、M18和RK1之間的基因組相似性均大于99%，DN1與L10和B10W的相似性也在99%以上?；蚪M系統(tǒng)發(fā)育進化樹表明，菌株HZ15與RK1的親緣關系最近。將來源于人體（PAO1）、土壤（M18）、植物（JBPA）、廢水（CH1）和昆蟲（HZ15）的菌株進行共線性分析，結果（圖6-B）顯示，不同來源的銅綠假單胞菌核苷酸序列存在高度相似性，但也存在基因組重排現(xiàn)象，如翻轉和易位等，此外，菌株M18、JBPA、CH1和HZ15相較于模式菌株PAO1還增添了許多片段。

2.2.3次級代謝合成基因簇分析10株銅綠假單胞菌的次級代謝基因簇如表3所示，其中11個基因簇為所有菌株共有?；虼?、8、10負責編碼3種金屬螯合劑，分別為f-5 pyoverdine、偽帕林（Pseudo-paline）和綠膿桿菌螯鐵蛋白（Pyochelin），與銅綠假單胞菌獲取金屬元素有關，對于其在環(huán)境中的生存和致病性至關重要?；虼?、6、7、9和11所編碼的產物具有抑菌作用，使銅綠假單胞菌具有廣譜的抑菌活性（Lee et al.，2010；蔣海霞等，2015；Zhou et al.，2016）?；虼?2～17為部分菌株特有的次級代謝合成通路。

2.3泛基因組分析結果

對不同來源的10株銅綠假單胞菌進行泛基因組分析，結果（圖7-A）顯示，隨著基因組數(shù)量的增加，泛基因組增加至10517個，核心基因組減少至5278個并逐漸趨于穩(wěn)定，表明銅綠假單胞菌的泛基因組為開放型，能從環(huán)境中獲取新的遺傳信息?；贑OG注釋的泛基因組圖譜顯示（圖7-B），5278個核心基因中，1932、811和1146個基因分別用于代謝、信息存儲和處理（Information storage and pro-cessing）、細胞過程和信號傳導（Cellular processes and signaling），此外，還有1389個基因的特征不佳和未標注（Poorly characterized and unannotated）。菌株PAC1因為擁有最大的基因組，其獨特基因最多（744個），而菌株PAO1基因組最小，獨特基因僅有20個。菌株HZ15擁有231個獨特基因，包括38個代謝、23個信息存儲和處理、12個細胞過程和信號傳導基因。

3討論

銅綠假單胞菌的代謝功能多樣，廣泛分布于土壤、水體、植物和動物中，其具有多種生物活性成分，能有效抑制植物病害、促進植物生長、降解環(huán)境污染物等（Zhou et al.，2016；Wu et al.，2018；曾舒泉等，2021；郝芳敏等，2023；梁衛(wèi)驅等，2024）。這些特性使得銅綠假單胞菌在植物病害管理中顯示出巨大的應用潛力。本研究以對煙草黑脛病有較好抑制作用的銅綠假單胞菌菌株HZ15為對象，通過對菌株HZ15進行全基因組和比較基因組學分析，有助于深入理解其抑菌作用機制，識別抑菌成分及其特異性，同時，泛基因組分析有助于揭示不同菌株之間的差異，進一步挖掘菌株HZ15特有的基因功能。

全基因組測序可快速識別與某些性狀或表型相關的基因，如從銅綠假單胞菌的基因組中注釋到與促進植物生長和生物防治活性相關的基因或基因簇（Jatan et al.，2023）。本研究中，發(fā)現(xiàn)菌株HZ15含有與色氨酸生物合成相關的基因trpA、trpB、trpC、trpD、trpE、trpF和trpG，這些基因與IAA的合成途徑相關，與Wu等（2018）報道的銅綠假單胞菌L10中的基因一致。此外，還發(fā)現(xiàn)菌株HZ15中存在乙偶姻分解代謝途徑（Acetoin catabolism）的關鍵基因aocA、aocB、aocC和aocR，乙偶姻分解代謝途徑已知能促進植物生長（Biessy et al.，2019）。這些基因的存在預示著菌株HZ15在促進植物生長方面的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)，供試10株菌株間的抗生素耐受性、前噬菌體、水平基因轉移及毒力因子的數(shù)量存在差異，可能是不同菌株適應不同生態(tài)位的原因之一（Gómez-Martínez etal.，2023）。此外，菌株PAO1作為最早公布基因組序列的菌株，所提供的基因組信息偏少（Stover et al.，2000）。CARD數(shù)據(jù)庫預測到銅綠假單胞菌擁有廣泛的抗生素抗性基因，為其在不同環(huán)境條件下的生存和適應提供了重要保障（Alcock et al.，2023）。10株銅綠假單胞菌的抗生素耐受基因中有53個共有基因，推測這些共有基因在銅綠假單胞菌中具有保守性。前噬菌體和水平基因轉移的存在是銅綠假單胞菌遺傳多樣性的重要體現(xiàn)，這些基因有助于其獲得抗生素抗性和毒力因子等，賦予菌株在特定環(huán)境壓力下的獨特競爭優(yōu)勢（Vernikos and Parkhill，2006；Starikova et al.，2020；王琦等，2024）。

通過VFDB數(shù)據(jù)庫注釋，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌能產生多種毒力因子，其中部分毒力因子具有抑菌活性（Biessy et al.，2019；Jatan et al.，2023）。生物表面活性劑（Biosurfactant）中的3個基因為鼠李糖脂生物合成簇基因（rhlA、rhlB和rhlC），能修復土壤、水體中的石油和金屬等污染物造成的環(huán)境污染，并且具有抑菌作用，鼠李糖脂生物殺菌劑已在美國獲得登記（蔣海霞等，2015；Wu et al.，2018）?？咕钚裕ˋnti-microbial activity）中的基因全部為phz基因家族，與吩嗪類生物合成相關，其中，吩嗪-1-羧酸（Phenazine-1-carboxylic acid，PCA）具有強大的抑菌能力，已被注冊為新型農藥（Wu et al.，2011；蔣海霞等，2015）。菌株PAO1的PCA合成基因種類最多，具有PCA生物合成2個通路的全套基因（phzA1、phzB1、phzC1、phzD1、phzE1、phzF1、phzG1和phzA2、phzB2、phzC2、phzD2、phzE2、phzF2、phzG2）（Zhou et al.，2016；Biessy et al.，2019），盡管菌株HZ15中缺乏phzC2、phzD2、phzE2、phzF2和phzG1基因，但其中的phzC1、phzD1、phzE1、phzF1和phzG2基因存在雙拷貝，相關基因條數(shù)與菌株PAO1一致。

在CAZy數(shù)據(jù)庫注釋中檢測到多種與銅綠假單胞菌抗菌活性可能有關的糖苷水解酶（張承康等，2023）。雖然沒有檢測到糖苷水解酶GH18和GH19具有信號肽區(qū)域，但其能在幾丁質培養(yǎng)基上生長，這可能歸因于其能通過膜囊泡（OMVs）將幾丁質酶運輸?shù)桨?，從而降解幾丁質并利用其作為營養(yǎng)來源（Chen et al.，2015；Metruccio etal.，2016）。除糖苷水解酶外，銅綠假單胞菌所產生的幾丁質結合蛋白D（CbpD）隸屬于輔助氧化還原酶AA10家族，可協(xié)助降解幾丁質，從而有效抑制真菌的生長（Folders et al.，2000）。據(jù)報道，部分幾丁質酶還能溶解昆蟲外骨骼和線蟲體壁中的幾丁質，具有殺蟲作用（Chen et al.，2015）。銅綠假單胞菌的GH23、GH73和GH103家族糖苷水解酶在細菌細胞分裂和細胞壁修復等生命活動中發(fā)揮關鍵作用；但也可能通過釋放這些胞外酶水解鄰近細菌的細胞壁以增強其在微生物群落中的競爭力（Shrivastava，2020；Moroz etal.，2021；Rafiei et al.，2021）。碳水化合物結合模塊CBM50能夠與糖基水解酶結合，提高酶的催化效率，從而可能增強菌株的抑菌活性（Rafiei et al.，2021）。本研究中，10株銅綠假單胞菌菌株編碼糖苷水解酶基因的數(shù)量不同，可能表現(xiàn)出不同的抑菌效果，其中菌株HZ15預測到具有較多編碼這類糖苷水解酶的基因。

次級代謝產物是抗菌劑和其他生物活性化合物的重要來源，本研究10株銅綠假單胞菌共有的次級代謝物主要產生鐵載體和抑菌活性物質。Pf-5 pyoverdine和綠膿桿菌螯鐵蛋白是銅綠假單胞菌從周圍介質中獲取鐵元素的重要載體，而偽帕林為窄譜離子螯合劑，可幫助菌株螯合鋅、鎳和鈷（Ghssein and Ezzeddine，2022）。研究表明，這些金屬載體不僅幫助銅綠假單胞菌獲取必需的金屬元素，還能通過降低環(huán)境中的金屬離子濃度來抑制其他病原微生物的生長和繁殖（蔣海霞等，2015；Ghssein and Ezzeddine，2022）。L-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸（L-2-amino-4-methoxy-trans-3-butenoic acid，AMB）作為一種氨基酸衍生物已被證實對多種細菌和真菌具有抑制作用，尤其是對革蘭氏陰性菌具有較強的抑制效果（Lee et al.，2010）。lankacidin C和oxalo-mycin B已被報道具有抗菌和抗腫瘤作用；此外，oxalomycin B還具有抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）的活性（和夢穎等，2023）。HCN為毒性化合物，通過抑制細胞內的呼吸酶而達到抑菌效果（Zhou et al.，2016）。這些共有的抑菌成分使得銅綠假單胞菌具有廣譜的抑菌活性。然而，除共有基因簇外，個別菌株還擁有一些特有的基因簇，M18和HZ15等菌株能產生綠膿菌素（pyocyanine，PYO），這是一種由phzM和phzS基因編碼的酶將PCA轉化而來的毒力因子，具有顯著的抗菌、抗氧化和抗癌特性，并因其穩(wěn)定性被用作生物著色劑（蔣海霞等，2015；Zhou et al.，2016）。雙環(huán)霉素（bicyclomycin，BCM）是一種具有顯著抗革蘭氏陰性菌活性的二酮哌嗪類生物堿抗生素，是目前已知的唯一選擇性抑制終止因子Rho蛋白的天然產物（Vior et al.，2018），僅在菌株M18和HZ15中存在其合成相關的基因簇。菌株HZ15還特有套索肽（lassopeptide）合成相關的基因簇，這類由核糖體合成和翻譯后修飾的肽（RiPP）具有顯著的熱穩(wěn)定性和蛋白水解穩(wěn)定性，以及多種生物活性，如抗菌、酶抑制、受體阻斷、抗癌特性和HIV拮抗作用；鑒于其高穩(wěn)定性和多功能性，套索肽在藥物開發(fā)領域展現(xiàn)出廣闊的應用前景，尤其是在開發(fā)新型抗生素和抗癌藥物方面（Zhao et al.，2016）。這種肽的存在可能會增強菌株HZ15的抑菌作用。

根據(jù)泛基因組分析結果可知，銅綠假單胞菌的泛基因組為開放型，意味著其能不斷地從外部環(huán)境中獲得新的遺傳信息，具有較強的環(huán)境適應性，與Freschi等（2019）的研究結果一致。10株菌的泛基因組COG注釋結果中，菌株HZ15擁有231個獨特基因，其中aphA_2和bla基因分別賦予卡那霉素（Sáenz et al.，2004）、碳青霉烯類抗生素（Forero-Hurtado et al.，2023）耐受性。然而，對于菌株HZ15中的其他特有基因目前尚未發(fā)現(xiàn)與抑菌或抗生素耐受性有直接相關的功能。

4結論

全基因組測序顯示菌株HZ15可能具有多種與降解細胞壁相關的糖苷水解酶，以及一系列可編碼AMB、HCN、PYO和BCM等抑菌活性物質的基因簇。比較基因組學分析表明菌株HZ15攜帶61個抗生素耐受基因、8個前噬菌體和53個HGT，與其他來源的銅綠假單胞菌存在較大差異，并具有特有的套索肽合成基因簇。泛基因組分析表明，銅綠假單胞菌的泛基因組為開放型，可不斷從外部環(huán)境中獲取新的遺傳信息。推測菌株HZ15可能通過破壞病原菌細胞壁、釋放毒素和抑菌活性成分等抑制病原菌生長，并因其具有較強環(huán)境適應能力，在生物防治領域具有良好的應用潛力。

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（責任編輯 麻小燕）