摘要：【目的】明確雞糞中莫能菌素的降解規(guī)律及其在環(huán)境中的趨向，為評估莫能菌素用作飼料藥物添加劑的生態(tài)毒性效應(yīng)提供理論依據(jù)，也為畜禽糞便的無害化處理提供技術(shù)支撐。【方法】建立快速測定糞便莫能菌素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），并構(gòu)建莫能菌素雞糞模型，提取雞糞總DNA，通過Illumina NovaSeq 6000平臺完成高通量測序，使用Trimmomatic（v0.33）處理測序結(jié)果，然后分別進(jìn)行OTU聚類分析、物種注釋、Alpha和Beta多樣性分析、組間差異顯著性分析及相關(guān)分析，以預(yù)測莫能菌素殘留對雞糞堆肥微生物群落的影響?！窘Y(jié)果】LC-MS/MS檢測雞糞中莫能菌素殘留的準(zhǔn)確度和精密度良好，檢出限為0.10μg/kg，定量限為0.25μg/kg。莫能菌素在低（40μg/g）、中（80μg/g）、高（120μg/g）濃度下的降解半衰期分別為111.95、287.55和374.59 d，即莫能菌素濃度越高，在雞糞中的降解半衰期越長。在雞糞中加入莫能菌素，厚壁菌門相對豐度隨時間的推移呈極顯著的降低趨勢（Plt;0.01）；莫能菌素的存在也改變了雞糞堆肥中優(yōu)勢菌屬的相對豐度，初期導(dǎo)致雞糞微生物群落的物種豐度及其多樣性降低，但隨著時間的推移雞糞微生物群落物種豐度及其多樣性不斷升高?；瘜W(xué)異養(yǎng)是雞糞微生物群落的主要代謝，其次是需氧化學(xué)異養(yǎng)、碳?xì)浣到?、發(fā)酵及硝化等；莫能菌素的加入能促使鹽單胞菌屬改變反硝化細(xì)菌組成，降低反硝化作用?！窘Y(jié)論】以分散固相萃取結(jié)合LC-MS/MS測定雞糞中莫能菌素殘留具有快速、靈敏、可靠的特點(diǎn)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。莫能菌素在雞糞中的降解時間與濃度呈正相關(guān)，其濃度越高，在雞糞中的半衰期越長。莫能菌素能改變雞糞堆肥過程中的微生物群落組成，進(jìn)而影響雞糞堆肥肥力。

關(guān)鍵詞：莫能菌素；雞糞；堆肥；降解規(guī)律；微生物群落

中圖分類號：S859.795文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：2095-1191（2024）09-2783-15

Degradation regulation of monensin in chicken manure and its impact on microbiota in chicken manure

LU Qing1，YANG Jian1，PAN Shi-qin1，ZHOU Yu-han1，XIE Li-li2，WEI Xing-ke1，SONG Xu-qin1*，HE Jiang3*

（1School of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China；2Guizhou Provincial SupervisoryInstitute of Veterinary Drug and Feeds，Guiyang，Guizhou 550003，China；3Guiyang Agricultural Products Qualityand Safety Supervision，Inspection and Testing Center，Guiyang，Guizhou 550081，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to reveal the regulation of degradation of monensin in chicken manure and its tendency in the environment，which would provide theoretical basis for evaluating the ecotoxic effect of monensin used as a feed drug additive，and the support for the harmless treatment of livestock and poultry manure.【Method】A high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）method was establishedfor the rapid determination of manure monensin residue，and a model of chicken manure formonensin was constructed.Total DNA of chicken manure was extracted，and high-throughput sequencing was completed by the Illumina NovaSeq 6000 platform，and the results of the sequencing were processed by using Trimmomatic（v0.33）.Then，the OTU cluste-ring analysis，species annotation，Alpha and Beta diversity analysis，significance of differences between groups and cor‐relation analysis were performed to predict the effect of monensin residue on the microbiota in chicken manure compost.【Result】The accuracy and precision of LC-MS/MS for the determination of monensin residue in chicken manure were well，with a limit of detection of 0.10μg/kg and a limit of quantification of 0.25μg/kg.The degradation half-lives of mo‐nensin in low（40μg/g），medieum（80μg/g），high（120μg/g）concentrations were 111.95，287.55 and 374.59 d，that was，the higher the concentration of monensin，the longer the half-life of the degradation in chicken manure.The relative abundance of the Firmicutes showed extremely significant decrease（Plt;0.01）with time when monensin was added to chicken manure.The monensin also altered the relative abundance of dominant genera in chicken manure.The species abundance and diversity of manure microbiota decreased initially，while these indicators increased over time.Chemical heterotrophy was the main metabolism of the chicken manure microbiota，followed by oxidative heterotrophy，hydrocar‐bon degradation，fermentation and nitrification.Monensin induced Halomonas to change the composition of denitrifying bacteria and decrease denitrification.【Conclusion】The determination of monensin residue in chicken manure by disper‐sive solid-phase extraction coupled with LC-MS/MS is rapid，sensitive and reliable，which can be applied to the detection of real samples.The degradation of monensin in chicken manure is positively correlated with its concentration，and the higher the concentration，the longer the half-life in chicken manure.Monensin can change the composition of microbiotain chicken manure composting process，then affect the fertility of chicken manure compost.

Key words：monensin；chicken manure；compost；degradation regulation；microbiota

Foundation items：National Natural Science Foundation of China（32202854）；Guizhou Basic Research Plan（Natu‐ral Science）Project（QKHJC-ZK〔2023〕-109）；Natural Science Special Project（Special Post）Scientific Research Project of Guizhou University（GDTGHZ〔2020〕25）

0引言

【研究意義】球蟲病是一種常見的畜禽寄生蟲病，能給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。莫能菌素（Monen‐sin，MOM）是從肉桂鏈霉菌（Streptomyces cinnamo-neus）中分離獲得的羧酸聚醚離子載體抗生素（Kocogluetal.，2023），已廣泛應(yīng)用于家禽球蟲病的防治（Zhang et al.，2022）。莫能菌素能與鈉和鉀的陽離子形成脂溶性復(fù)合物，導(dǎo)致生物膜對這些陽離子的滲透性增加，干擾子孢子及第一代裂殖體的生長繁殖，從而發(fā)揮抗球蟲的作用（Noack etal.，2019）。在動物養(yǎng)殖中，莫能菌素主要作為抗球蟲藥和反芻動物促生長劑，但大量使用或不遵守休藥期會導(dǎo)致其殘留于動物源性食品中，而威脅人體健康（Soares et al.，2022）。此外，莫能菌素在雞腸道中幾乎不被吸收，80%以藥物原型從糞便中排出（Munaretto etal.，2016），未經(jīng)處理的糞便可能會污染環(huán)境。因此，亟待研究糞便中莫能菌素的降解規(guī)律及其對微生物的影響，為臨床上莫能菌素的合理用藥及評估其隨糞便排出進(jìn)入環(huán)境后的殘留風(fēng)險提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】據(jù)統(tǒng)計，我國動物糞便釋放的抗生素每年可達(dá)5.0萬t（饒怡璇等，2022），在施用有機(jī)肥的土壤中經(jīng)常能檢測到莫能菌素。Sun等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞墊料中的莫能菌素含量高達(dá)4 mg/kg，在施肥土壤中的莫能菌素殘留量為183μg/kg；Yoshida等（2022）對農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)的監(jiān)測結(jié)果表明，糞便中的莫能菌素含量為37 mg/kg，土壤中的莫能菌素含量為15 mg/kg。此外，未經(jīng)處理的含莫能菌素糞便可通過徑流或污水排放方式進(jìn)入水體或農(nóng)田，進(jìn)而威脅農(nóng)作物食品安全（李豪等，2022）。Pérez等（2021）通過分析不同地表水中的莫能菌素殘留量，發(fā)現(xiàn)牛屠宰場附近水樣的莫能菌素檢出率較高，且對水生生物具有潛在的生態(tài)毒理學(xué)風(fēng)險。畜禽糞便經(jīng)發(fā)酵處理后能有效減少部分抗生素殘留，降低藥物殘留造成的生態(tài)風(fēng)險（Xu etal.，2023）。然而，莫能菌素只能在特定條件下加速降解，如改變溫度或pH，自然堆肥13 d后僅下降13%（Munaretto etal.，2016），堆肥3個月后其環(huán)境濃度預(yù)測值仍為0.013 mg/kg（?i?eketal.，2011）。Li等（2019）通過分析莫能菌素在不同土壤中的吸附和遷徙能力，結(jié)果證實(shí)莫能菌素對土壤的親和力、流動性較高，非常容易積累。家禽糞便或墊料作為肥料施用于農(nóng)田時，未完全降解的莫能菌素不僅直接威脅人類食品和飲水安全，還會導(dǎo)致土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)改變，降低土壤肥力和有機(jī)物含量，繼而影響土壤微生物及農(nóng)作物的正常發(fā)育生長（Doydora et al.，2017）。Menezes-Oliveira等（2018）研究表明，莫能菌素會增加蚯蚓體內(nèi)銅離子的生物積累，放大土壤銅污染對蚯蚓繁殖和生存的毒性作用；Granados-Chinchilla等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，莫能菌素通過糞便施肥進(jìn)入土壤，迅速殺死某些微生物，而對幸存的微生物群落進(jìn)行選擇和代謝刺激；Jiang等（2022）研究表明，莫能菌素殘留于土壤會干擾蚯蚓的能量代謝，削弱其腸道屏障。綜上所述，糞便中的莫能菌素殘留可能會威脅生態(tài)環(huán)境安全，因此研究莫能菌素經(jīng)糞便排出后在環(huán)境中的趨向及其生態(tài)毒性，對評估莫能菌素的殘留風(fēng)險具有重要意義。【本研究切入點(diǎn)】至今，針對莫能菌素的研究主要集中于動物體內(nèi)代謝及其殘留情況（Zhao et al.，2017），有關(guān)莫能菌素對糞便微生物群落影響的研究報道較少，且前期處理的操作過程繁瑣、成本高。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建快速測定糞便莫能菌素殘留的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS），并通過16S rRNA測序技術(shù)探究莫能菌素濃度對雞糞堆肥中微生物群落豐度、多樣性及其結(jié)構(gòu)的影響，明確雞糞中莫能菌素的降解規(guī)律及其在環(huán)境中的趨向，為評估莫能菌素用作飼料藥物添加劑的生態(tài)毒性效應(yīng)提供理論依據(jù)，也為畜禽糞便的無害化處理提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

莫能菌素購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇和乙腈（色譜純）購自美國ThermoFisher Scientific公司；甲酸（色譜純）購自德國Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯（分析純）購自廣州化學(xué)試劑廠。主要儀器設(shè)備有GM-2100氮吹儀（昆山超聲波儀器有限公司）、電子分析天平（深圳市盛美儀器有限公司）、Agilent 1290液相色譜儀及Agilent 6470三重四極桿質(zhì)譜儀（安捷倫科技有限公司）。

1.2莫能菌素濃度確定

依據(jù)Davison（1984）的研究結(jié)果，并結(jié)合目前我國飼料添加劑的添加標(biāo)準(zhǔn)，確定高、中、低3個莫能菌素濃度，分別為120、80和40μg/g。

1.3雞糞中莫能菌素殘留檢測方法的建立

1.3.1儀器條件液相條件：色譜柱為Phenomenexluna C18色譜柱（150.0 mm×2.0 mm，5.0μm），柱溫50℃，流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量5.0μL，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）+甲醇（B）。梯度洗脫程序：0～3.0 min，23%A；3.0～5.5 min，14%A；5.5～7.0 min，5%A；7.0～8.0 min，23%A。質(zhì)譜條件：電噴霧電離正離子模式（ESI+），干燥氣體流量13 L/min，霧化器壓力20 psi，干燥氣體溫度320℃;鞘氣體流量12 L/min，鞘氣體溫度400℃;噴嘴電壓0 kV，毛細(xì)管電壓4.5 kV。

1.3.2樣品前處理取1 g雞糞，加入5 mL乙酸乙酯，渦旋1 min、超聲5 min、振蕩20 min后8000 r/min離心10 min，收集上清液；沉淀再加入5 mL乙酸乙酯重復(fù)提取，合并上清液，加入50 mg C18吸附劑，搖勻，8000 r/min離心10 min，取上清液，采用GM-2100氮吹儀吹干，加入1 mL的甲醇+0.1%甲酸水（v∶v=8∶2），渦旋2min，超聲5min，取上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)行LC-MS/MS分析。

1.3.3方法學(xué)驗(yàn)證（1）選擇性。按照1.3.1和1.3.2的方法處理檢測空白雞糞基質(zhì)及空白雞糞基質(zhì)加標(biāo)樣品，檢測目標(biāo)藥物在保留時間處是否存在基質(zhì)干擾峰。（2）檢測限和定量限。以S/N≥3倍信噪比為檢測限，以S/N≥10倍信噪比為定量限。（3）基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。采用空白雞糞基質(zhì)將標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋為2、5、10、20、50和100μg/kg等6個標(biāo)準(zhǔn)工作液（每個濃度設(shè)3個平行），擬定線性回歸方程，并計算相關(guān)系數(shù)（r2）。（4）回收率和精密度。在空白雞糞樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)工作液，制備成2、10和50μg/kg的加標(biāo)樣品，每個濃度設(shè)6個重復(fù)；按1.3.2的前處理方法，檢測雞糞中莫能菌素的回收率和精密度，計算公式如下：

回收率（%）=添加藥物濃度（測得藥物濃度）×100

式中，Xi表示每個樣品測得的藥物濃度；X（ˉ）表示同一濃度下測得的藥物濃度平均值；n表示同一濃度平行樣品數(shù)量。

1.4含莫能菌素糞便模型構(gòu)建

雞糞采自貴州省貴陽山嶼駐地農(nóng)場，通過五點(diǎn)取樣法隨機(jī)采樣，樣品陰干，粉碎過2mm篩網(wǎng)，經(jīng)檢測無目標(biāo)藥物。按Henri等（2009）的方法確定構(gòu)建雞糞莫能菌素模型的濃度，共設(shè)4組：對照組（CK）、低濃度組（L：40μg/g）、中濃度組（M：80μg/g）和高濃度組（H：120μg/g）。每組設(shè)5個重復(fù)，將混合樣品倒入1 L燒杯中，然后將對應(yīng)濃度的莫能菌素溶解于甲醇，分別均勻噴灑于L組、M組和H組的雞糞，CK組雞糞噴灑等體積的甲醇，噴藥的同時調(diào)整模型含水量，使糞便持水量維持在50%左右。于噴藥后第1、3、5、7、10、15、30和45 d，每組雞糞取2份樣品，一部分通過LC-MS/MS測定雞糞中的莫能菌素含量，另一部分-80℃保存，用于16S rRNA測序。

1.5莫能菌素對雞糞微生物多樣性的影響

1.5.1高通量測序參照TIANamp Stool DNA Kit使用說明提取雞糞總DNA，PCR擴(kuò)增建庫后，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行高通量測序。使用Trimmomatic（v0.33）對測序獲得的Raw reads進(jìn)行質(zhì)量過濾，然后通過Cutadapt 1.9.1進(jìn)行引物序列的識別與去除，最后以USEARCH 10.0對雙端Reads進(jìn)行拼接，并去除嵌合體（龍小霞等，2024）。

1.5.2 OTU聚類分析及物種注釋噴藥后第1、15、30和45 d分別采集各濃度處理組的雞糞樣品，共80份，使用USEARCH 10.0在相似性97%的水平上對Clean reads進(jìn)行OTU聚類分析，以測序所獲Reads數(shù)量的0.005%作為閾值進(jìn)行OTU過濾。對特征序列進(jìn)行分類學(xué)注釋，在各分類水平［界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）、屬（Genus）、種（Species）］上統(tǒng)計各樣本的群落組成，并以QIIME2比對特有序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系（吳云飛等，2024）。

1.5.3 Alpha和Beta多樣性分析使用QIIME2計算Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)，基于Binary Jaccard、Bray Curtis等算法呈現(xiàn)物種多樣性矩陣，并以R語言進(jìn)行樣本主成分分析（PCA）。

1.5.4組間差異顯著性分析采用線性判別分析（LDA）估算各組分豐度對差異效果的影響程度及組間豐度差異顯著的物種。

1.5.5相關(guān)分析根據(jù)各物種在各樣品中的豐度及變化進(jìn)行Spearman秩相關(guān)分析，篩選出相關(guān)系數(shù)gt;0.1且Plt;0.05的數(shù)據(jù)構(gòu)建相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6統(tǒng)計分析

采用Excel 2020對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，雞糞中莫能菌素含量通過一級動力學(xué)方程Ct=C0e-kt進(jìn)行擬合，根據(jù)半衰期公式T1 20.693/K，以O(shè)rigin 2021作圖并計算半衰期，使用SPSS 20.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2結(jié)果與分析

2.1快速檢測雞糞莫能菌素殘留的LC-MS/MS

2.1.1樣品前處理優(yōu)化分別對提取液、凈化方法和復(fù)溶液進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果（圖1-A）顯示，乙酸乙酯提取莫能菌素的回收率高于85.0%，且雜質(zhì)最少，因此選擇乙酸乙酯作為提取劑；比較C18、PSA、硅膠和活性炭4種吸附劑的凈化方法，結(jié)果（圖1-B）顯示，PSA和活性炭的莫能菌素回收率低于50.0%，C18吸附劑凈化時莫能菌素的回收率可達(dá)89.3%，故選擇以C18為吸附劑的凈化方法；比較不同體積比和不同濃度的甲醇+甲酸水溶液為復(fù)溶液對莫能菌素回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇+甲酸水溶液的體積比不變，甲酸水濃度變化對莫能菌素回收率的影響不明顯；保持甲酸水濃度不變時，莫能菌素回收率隨著甲醇體積比的增加而升高，因此選擇甲醇+0.1%甲酸水（v∶v=8∶2）作為復(fù)溶液。

2.1.2方法選擇性分別對空白雞糞基質(zhì)和添加莫能菌素雞糞基質(zhì)進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖2所示。在莫能菌素出峰時間±2.5%的范圍內(nèi)空白雞糞基質(zhì)未觀察到干擾峰，說明構(gòu)建的LC-MS/MS選擇性良好。

2.1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍以濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y），擬合得到回歸方程y=777671x-590096（r2=0.9939），線性良好。由表1可知，添加2μg/kg莫能菌素時，雞糞中莫能菌素的平均回收率為115.1%～117.7%；添加莫能菌素濃度為10μg/kg時，雞糞中莫能菌素的平均回收率在102.5%～104.7%；莫能菌素添加濃度為50μg/kg時，雞糞中莫能菌素的平均回收率在90.9%～93.3%；且批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.3%～2.8%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～3.5%，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。雞糞中的莫能菌素檢出限為0.10μg/kg，定量限為0.25μg/kg。

2.2雞糞中莫能菌素的降解規(guī)律

雞糞中莫能菌素的降解規(guī)律如圖3所示。莫能菌素在雞糞中的降解時間與濃度呈正相關(guān)，濃度越低降解速率越快。對莫能菌素的濃度—時間變化趨勢進(jìn)行線性擬合，發(fā)現(xiàn)其變化趨勢符合一級動力學(xué)方程Ct=C0e-kt，且擬合得到莫能菌素在低（40μg/g）、中（80μg/g）、高（120μg/g）濃度下的降解半衰期分別為111.95、287.55和374.59 d，即莫能菌素濃度越高，其在雞糞中的半衰期越長。

2.3莫能菌素對雞糞微生物多樣性的影響

2.3.1樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量與OTU聚類分析結(jié)果

對80份雞糞樣品的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行評估，共獲得3308697條Clean reads，經(jīng)OTU聚類分析，最終獲得71081個OTUs。其中，F(xiàn)FH樣本（高濃度組第45 d）的OTUs數(shù)量最多（9534個）；分類分配后通過Venn圖觀察到34個共同的OTUs。物種注釋結(jié)果顯示，71081個OTUs共注釋到2界52門131綱389目795科1689屬。

2.3.2門分類水平組成共檢測到52個菌門，選取相對豐度排名前15的菌門繪制物種相對豐度柱狀圖，結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)不同濃度不同時段的各雞糞微生物主要由變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）及未定義菌群（unclassified_Bacteria）等組成。變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度之和在90.0%以上，其中，厚壁菌門在空白雞糞樣本的相對豐度較高，加入莫能菌素后其相對豐度隨時間的推移呈極顯著降低趨勢（Plt;0.01）。

2.3.3屬分類水平組成在屬分類水平上，以鹽單胞菌屬（Halomonas）、擬諾卡氏菌屬（Nocardiopsis）、別樣海源菌屬（Aliidiomarina）、未分類擬桿菌科（unclassified_Balneolaceae）、未分類芽孢桿菌科（unclassified_Bacillaceae）和枝芽孢桿菌屬（Virgiba-cillus）為優(yōu)勢菌屬。由表2可知，莫能菌素改變了雞糞中優(yōu)勢菌屬的相對豐度。與空白對照組相比，低濃度組和中濃度組在噴藥后第1 d即對未分類芽孢桿菌科產(chǎn)生抑制作用，對鹽單胞菌屬表現(xiàn)出促進(jìn)作用，對枝芽孢桿菌屬則表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的現(xiàn)象；至噴藥后第15 d，莫能菌素表現(xiàn)出明顯的抑制鹽單胞菌屬的效果，而低濃度組和中濃度組對擬諾卡氏菌屬具有促進(jìn)作用；至噴藥后第30 d，低濃度組對擬諾卡氏菌屬具有促進(jìn)作用，而中濃度組和高濃度組對擬諾卡氏菌屬起抑制作用；至噴藥后第45 d，低濃度組對未分類擬桿菌科具有抑制作用，而中濃度組和高濃度組對未分類擬桿菌科起促進(jìn)作用。

2.3.4 Alpha多樣性分析Alpha多樣性主要反映單個樣本物種豐度及其多樣性，包括ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)等指標(biāo)（Yan et al.，2021；楊啟晟等，2024）。由圖5-A可看出，噴藥后第1 d各濃度組雞糞微生物群落的Chao1指數(shù)低于空白對照組，加入莫能菌素后物種數(shù)量減少；各處理組雞糞微生物群落的Chao1指數(shù)隨時間推移而逐漸增加，至噴藥后第45 d，高濃度組的Chao1指數(shù)明顯高于空白對照組。各處理組雞糞微生物群落Shannon指數(shù)的變化趨勢（圖5-B）與Chao1指數(shù)相似。雖然添加莫能菌素的初期會導(dǎo)致雞糞微生物群落的物種豐度及其多樣性降低，但隨著時間推移至45 d時，莫能菌素處理組的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于空白對照組，即物種豐度及其多樣性不斷升高。

2.3.5 Beta多樣性分析PCA分析結(jié)果（圖6）顯示，噴藥后第1 d各樣本間的距離較近，表明微生物群落組成相似。隨著時間的推移，各樣本間的距離逐漸分散，表明莫能菌素改變了雞糞微生物群落組成，至噴藥后第45 d，空白對照組樣本與低濃度組樣本的距離相對較近，說明二者間的微生物群落結(jié)構(gòu)仍有部分相似。

2.3.6物種豐度聚類分析聚類分析熱圖中顏色代表物種豐度，縱向聚類表示不同物種在各樣本間的豐度相似情況，橫向聚類表示不同樣本各物種間的豐度相似情況。樣品間的距離越近，說明各物種豐度越相似。由圖7可看出，在噴藥后第1d，芽孢桿菌科菌株BM62（Bacillaceae bacterium BM62）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、高鈉芽孢桿菌屬（Natribacillus）、假纖細(xì)芽孢桿菌屬（Pseudogracilibacillus）、硫假單胞菌屬（Thiopseudomonas）、枝芽孢桿菌屬、未分類芽孢桿菌科和unclassified_Muribaculace在空白對照組及各莫能菌素處理組中的相對豐度均較高；至噴藥后第15 d，纖細(xì)芽孢桿菌屬（Gracilibacillus）、鹽單胞菌屬、涅斯特連科氏菌屬（Nesterenkonia）、鹽水球菌屬（Salinicoccus）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和未分類藍(lán)藻（unclassified_Cyanobacteri）在各處理組中的相對豐度較高；別樣海源菌屬（Aliidiomarina）、RB41、鞘鞍醇單胞菌屬（Sphingomonas）、未分類芽孢桿菌科、未定義菌群、未分類藍(lán)藻、unclassified_Vicinami-bacteraceae和unclassified_Vicinamibacterales在噴藥后第1 d并未出現(xiàn)，但至噴藥后第45d其相對豐度均較高。隨著時間的推移，芽孢菌類的致病菌（芽孢桿菌屬、芽孢桿菌科菌株BM62、高鈉芽胞桿菌屬和假纖細(xì)芽胞桿菌屬等）的相對豐度逐漸降低，與反硝化有關(guān)的菌群（鹽單胞菌屬）也隨之下降。

2.3.7相關(guān)分析基于R語言繪制物種相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖，展示相關(guān)性排名前50的優(yōu)勢菌屬。由圖8可看出，排名前50的優(yōu)勢菌屬大部分隸屬于變形菌門和厚壁菌門，且大部分菌屬間存在正相關(guān)，只有枝芽孢桿菌屬與部分菌屬存在負(fù)相關(guān)。

2.4雞糞微生物群落BugBase表型預(yù)測結(jié)果

采用BugBase預(yù)測雞糞微生物群落功能通路生物水平覆蓋及生物可解釋表型，并根據(jù)革蘭氏陽性（Gram positive）、革蘭氏陰性（Gram negative）、生物膜形成（Forms biofilms）、致病性（Potentially patho-genic）、移動元件（Mobile elements）、氧需求［好氧（Aerobic）、厭氧（Anaerobic）、兼性厭氧（Facultatively anaerobic）］及氧化脅迫耐受（Stress tolerant）七類表型進(jìn)行分類，結(jié)果（圖9）顯示，隨著堆肥時間的推移，生物膜形成和革蘭氏陰性2種功能的占比隨之增加，而革蘭氏陽性功能的占比隨之減少。

2.5雞糞微生物群落FAPROTAX功能注釋結(jié)果

FAPROTAX功能注釋適用于預(yù)測環(huán)境樣本的生物地球化學(xué)循環(huán)過程，尤其是碳、氫、氮等元素的循環(huán)（Louca etal.，2016），其中，碳代謝相關(guān)功能包括化學(xué)異養(yǎng)（Chemoheterotrophy）、好氧化學(xué)異養(yǎng)（Aerobic chemoheterotrophy）、光養(yǎng)（Phototrophy）和光異養(yǎng)（Photoheterotrophy）等，氮代謝相關(guān)功能包括硝化（Nitration）、好氧氨氧化（Aerobic ammonia oxi-dation）、硝酸鹽還原（Nitrate reduction）、硝酸鹽呼吸（Nitrate respiration）和氮呼吸（Nitrogen respiration）等，在一定程度上能反映微生物群落功能（Wang et al.，2023）。由圖10可知，共注釋到21項功能條目，碳代謝相關(guān)功能涉及化學(xué)異養(yǎng)和好氧化學(xué)異養(yǎng)；氮代謝相關(guān)功能包括硝酸鹽還原、氮呼吸、硝酸鹽呼吸及尿素分解（Ureolysis）。其中，化學(xué)異養(yǎng)是雞糞微生物群落的主要代謝，其次是需氧化學(xué)異養(yǎng)、碳?xì)浣到猓℉ydrocarbon degradation）和發(fā)酵（Fermenta-tion）等。

2.6莫能菌素殘留對雞糞微生物群落代謝通路的影響

微生物群落間進(jìn)行物質(zhì)和能量交換時會產(chǎn)生一系列代謝通路，且每個群落都具有獨(dú)特的代謝通路，相互作用后實(shí)現(xiàn)整個微生物群落的代謝功能（楊銘，2022）。采用PICRUSt 2進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示，各處理雞糞樣本在一級代謝通路主要預(yù)測到六大類代謝通路（圖11），分別是新陳代謝（Metabolism）、環(huán)境信息處理（Environmental information processing）、細(xì)胞過程（Cellular processes）、遺傳信息處理（Geneticinformation processing）、有機(jī)體系統(tǒng)（Organismal sys-tems）和人類疾病（Human diseases）；二級代謝通路（圖12）主要包括全局和概述圖譜（Global and over-view maps）、碳水化合物代謝（Carbolhydrate metabo-lism）、氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、輔助因子和維生素代謝（Metabolism of cofactors and vita-mins）、能量代謝（Energy metabolism）、薄膜運(yùn)輸（Me-mbrane transport）、核苷酸代謝（Nucleotide metabo-lism）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（Signal transduction）、轉(zhuǎn)運(yùn)（Transla-tion）及復(fù)制與修復(fù)（Replication and repair）；三級代謝通路（圖13）主要包括代謝途徑（Metabolic path-ways）、次級代謝產(chǎn)物生物合成（Biosynthesis of se-condary metabolies）、抗菌素生物合成（Biosynthesis of antibiotics）、不同環(huán)境微生物代謝（Microbial me-tabolismin diverse environments）、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABCtransporters）、氨基酸生物合成（Biosynthesis of amino acids）、碳代謝（Carbon metabolism）、二組分系統(tǒng)（Two-component system）、嘌呤代謝（Purine metabo-lism）及核糖體（Ribosome）。

3討論

莫能菌素含量常采用高效液相色譜與紫外（UV）檢測器或熒光檢測器（FLD）進(jìn)行檢測（Olejniketal.，2013），但莫能菌素紫外檢測和熒光檢測的吸光度較低，通常需要進(jìn)行衍生化，因此耗時長，樣品預(yù)處理復(fù)雜。LC-MS/MS具有定性和定量準(zhǔn)確性高、檢測速度快及無需衍生化等優(yōu)點(diǎn)，且靈敏度高，可檢測低濃度的物質(zhì)（Wang et al.，2020）。莫能菌素的水溶性較差、化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，與鈉離子、鉀離子具有特殊的親和力，可形成親脂性絡(luò)合物。在液—液萃取中，對于親脂性物質(zhì)常以乙酸乙酯、乙腈、乙酸乙酯—氨水混合物、乙腈—水混合物、甲醇—三氯乙酸—磷酸鹽緩沖液混合物等作為提取液（呂小玲，2023）。本研究選取2%乙酸乙腈、甲醇和乙酸乙酯3種提取劑進(jìn)行提取，結(jié)果表明，2%乙酸乙腈提取的莫能菌素回收率低于80.0%，而用甲醇提取的雜質(zhì)較多，不僅影響莫能菌素的準(zhǔn)確定量，還會縮短色譜柱和儀器的使用壽命。以乙酸乙酯提取莫能菌素的回收率高于85.0%，且能有效消除基質(zhì)干擾。由于動物源性食品基質(zhì)復(fù)雜、所含成分較多，其樣品前期處理技術(shù)包括液—液萃取法、免疫親和色譜法及固相萃取法等（王玉梅等，2021）。目前，針對糞便莫能菌素殘留的前期處理主要采取固相萃取法，但該方法操作繁瑣、耗時長、檢測成本高。本研究采用的分散固相萃取法具有快速、低成本及藥物損失少等優(yōu)點(diǎn)。PSA是由表面涂有N-丙基乙二胺的改性硅膠制備而成，在水溶液和有機(jī)溶液中均具有良好的離子交換能力及吸附性能，對多種極性或非極性雜質(zhì)（脂肪酸、有機(jī)酸、螯合金屬離子、糖類和色素等）都有很好的凈化效果。C18吸附劑是將長鏈烷基鍵整合到硅膠表面，具有較高的碳含量和疏水性，對各種類型的化合物吸附作用良好。本研究通過比較不同類型的吸附劑，結(jié)果顯示C18既能有效吸附雜質(zhì)，又不影響莫能菌素的回收率。

堆肥是改變各種微生物群落（細(xì)菌和真菌）豐度的過程（Neher etal.，2013），在此過程中抗生素可能會改變微生物群落組成而達(dá)不到堆肥的目的。真菌在堆肥過程中主要發(fā)揮分解有機(jī)物的作用（Liu et al.，2017），但某些抗生素如高濃度的鹽酸四環(huán)素可抑制真菌活性，而降低堆肥效果（Cui et al.，2022）。在任何環(huán)境下，濃度都是影響藥物降解因素之一，不同藥物濃度對微生物活性和有機(jī)物降解的影響也存在明顯差異，即低濃度促進(jìn)，高濃度抑制（Ndlovu et al.，2020）。本研究中，高濃度莫能菌素（120μg/g）的降解速率明顯低于中濃度（80μg/g）和低濃度（40μg/g），且濃度越高降解速率越慢，在雞糞中的半衰期越長，可能是莫能菌素對雞糞微生物群落產(chǎn)生了不同程度的影響。Sun等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，莫能菌素濃度因堆肥過程不同而存在差異，翻堆和堆放的莫能菌素濃度降至20.0%以下，而充氣堆肥和翻堆/充氣堆肥的莫能菌素濃度分別降低35.6%和39.9%。本研究結(jié)果表明，雞糞中莫能菌素的降解時間與其濃度呈正相關(guān)，莫能菌素濃度越高，其在雞糞中的半衰期越長，作用于環(huán)境或間接通過食物鏈進(jìn)入機(jī)體的概率越高（Biswas et al.，2012）。

微生物群落在堆肥過程中主導(dǎo)有機(jī)物降解、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、生物熱產(chǎn)生及腐殖質(zhì)的形成（Wang et al.，2014），因此，微生物活性、含氮量和碳氮比常作為堆肥工藝參數(shù)或堆肥特征指標(biāo)（Greffetal.，2022）。本研究結(jié)果表明，雞糞堆肥過程以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、酸桿菌門和綠彎菌門為優(yōu)勢菌門。厚壁菌門在空白雞糞樣本中的相對豐度較高，加入莫能菌素后其相對豐度呈降低趨勢。厚壁菌門在堆肥的初始和升溫階段可促進(jìn)纖維素降解與利用（Yin et al.，2017）。此外，厚壁菌門能在含氮量較高的堆肥中富集（Zhang et al.，2018）。莫能菌素的殘留可能會抑制厚壁菌門，影響堆肥初始階段的微生物群落結(jié)構(gòu)，不利于纖維素降解及堆肥過程中的氮素積累，進(jìn)而降低堆肥產(chǎn)品的肥效，還可能對環(huán)境造成嚴(yán)重污染（曹麗娜等，2024）。變形菌門和擬桿菌門作為堆肥成熟度的潛在生物標(biāo)志物（Martins et al.，2023），在加入莫能菌素后其相對豐度變化不明顯，推測莫能菌素對堆肥的嗜熱期和成熟期無明顯影響。鹽單胞菌屬作為嗜鹽微生物的重要代表菌群，其產(chǎn)生的四氫嘧啶、甜菜堿和L-天冬氨酸酶等生物活性物質(zhì)，在發(fā)酵生產(chǎn)及環(huán)境治理等方面發(fā)揮著重要作用（陳英松等，2023）。鈉離子對某些嗜鹽細(xì)菌或嗜堿細(xì)菌至關(guān)重要（He etal.，2015），而莫能菌素能與鈉離子、鉀離子形成脂溶性復(fù)合物，因此莫能菌素對鹽單胞菌屬表現(xiàn)出抑制作用，不利于堆肥發(fā)酵，且進(jìn)入土壤后對無脊椎動物造成影響，或通過植物根系進(jìn)入食物鏈而威脅人體健康。高濃度莫能菌素在雞糞中半衰期長，對擬諾卡氏菌屬起抑制作用。擬諾卡氏菌屬普遍存在于不同地區(qū)，其生態(tài)適應(yīng)性強(qiáng)，能產(chǎn)生具有生物活性的代謝物和酶類，在自然條件下協(xié)助復(fù)雜底物分解（Bhairamkar et al.，2023）。芽孢桿菌屬在堆肥嗜溫或嗜熱期的生物降解過程中發(fā)揮重要作用（Yang et al.，2024），能氧化/發(fā)酵代謝多種碳底物，包括麥芽糖、果糖、蔗糖、葡萄糖及肽等，而促進(jìn)腐殖質(zhì)的形成（Wang et al.，2022）；芽孢桿菌屬還能降解雞糞中的氨氣、硫化氫和糞臭素，且降解效果良好。擬桿菌屬作為條件致病菌，當(dāng)正常的微生態(tài)平衡被打破時會引起內(nèi)源性感染（吳彥彬等，2007）。本研究結(jié)果表明，添加莫能菌素的初期會導(dǎo)致雞糞微生物群落的物種豐度及其多樣性降低，但隨著時間的推移，各處理組的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)逐漸增加，即物種豐度及其多樣性不斷升高。莫能菌素還改變了雞糞中微生物菌群組成，至噴藥后第45 d僅空白對照組與低濃度組的微生物群落結(jié)構(gòu)存在部分相似，表明高濃度抗生素殘留會減低堆肥效果。

氮素是堆肥過程中微生物生長和生化反應(yīng)所需的常量營養(yǎng)素（Guo et al.，2020）。氮循環(huán)包括5個主要步驟：氨化、硝化、反硝化、厭氧氨氧化及由微生物活動控制的同化（Loecke et al.，2012）。其中，反硝化主要發(fā)生在缺氧/厭氧條件下的嗜熱和成熟階段，涉及異養(yǎng)和自養(yǎng)反硝化劑（Shen et al.，2023）。鹽單胞菌屬作為反硝化作用的優(yōu)勢微生物，主要表現(xiàn)出呼吸代謝，且以氧或硝酸鹽作為電子受體，大多數(shù)鹽單胞菌屬物種通常呈中度嗜鹽（Gonzalez-Domenech et al.，2010）。本研究結(jié)果表明，各處理組中鹽單胞菌屬的相對豐度均在噴藥后第15 d達(dá)最高值，隨著堆肥時間的推移，其相對豐度有所下降，且莫能菌素處理組均低于空白對照組，表明莫能菌素能促使鹽單胞菌屬改變反硝化細(xì)菌組成，降低反硝化作用，進(jìn)而影響雞糞堆肥肥力。

4結(jié)論

以分散固相萃取結(jié)合LC-MS/MS測定雞糞中莫能菌素殘留具有快速、靈敏、可靠的特點(diǎn)，可應(yīng)用于實(shí)際樣品檢測。莫能菌素在雞糞中的降解時間與濃度呈正相關(guān)，其濃度越高，在雞糞中的半衰期越長。莫能菌素能改變雞糞堆肥過程中的微生物群落組成，進(jìn)而影響雞糞堆肥肥力。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）